CN108341879B - 一种嵌合多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种嵌合多肽，所述多肽的序列如以下通式I所示，通式I：HX2QGTFTSDYSKYLX15X16X17X18X19X20X21FIX24WLX27KGX30X31X32。本发明还提供了具有通式1基本结构多肽的二聚体，所述二聚体是由上述多肽通过Cys残基共价连接而成或通过接头共价连接而成。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述多肽或其盐、上述多肽的聚乙二醇修饰物、其二聚体。本发明提供的多肽具有显著的降血糖作用和减轻体重作用，其药效和长效性优于阳性对照药，而且溶解性和稳定性好，更适于制剂，可用于制备肥胖等代谢性疾病的控制和糖尿病的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种嵌合多肽以及所述多肽在制备用于预防和/或治疗糖尿病、肥胖和/或代谢综合征的药物中的用途。
背景技术
肥胖是引起多种疾病的风险因素，其中2型糖尿病(T2DM)是肥胖风险最大的健康隐患。肥胖及其伴随的胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键因素，据调查，80-90％的2型糖尿病患者超重或肥胖。因此，预防和控制糖尿病，尤其是肥胖性2型糖尿病的治疗始终是该领域的重要课题。
机体的血糖和能量调节信号系统是由多种因子维持精细的平衡，包括不同的多肽类激素。前胰高血糖素(pro-glucagon)是一种具有158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中经处理而形成多种不同的胰高血糖素原的衍生肽，包括胰高血糖素(GC)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)及胃泌素。这些激素参与多种生理功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空、肠道生长以及对食物摄取的调节。GC是对应于前胰高血糖素的33至61位氨基酸组成的含29个氨基酸的衍生肽，刺激糖原在肝脏中分解，并且促进葡萄糖释放，以使血糖水平升高至正常范围。除升高血糖水平外，GC还抑制食欲和激活脂肪细胞的激素敏感性酯酶以促进脂解。
GLP-1是对应于前胰高血糖素的72至108位氨基酸组成的含37个氨基酸残基的衍生肽。GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)是GLP-1的体内活性形式，对GLP-1受体显示相等活性。GLP-1受体激动剂被开发为糖尿病患者的高血糖治疗剂，降血糖的同时保护和增殖胰岛细胞，具有减缓胃排空，增加葡萄糖利用率和抑制食物摄入。已经上市的GLP-1受体激动剂有基于人源GLP-1序列的利拉鲁肽、阿必鲁泰、杜拉鲁肽和基于美洲毒蜥蜴来源的Exendin-4序列的艾塞纳肽、利西拉来、Bydureon，但当前短效的利拉鲁肽、艾塞纳肽仍需要频繁给药，仍需提高临床依从性，阿必鲁泰、杜拉鲁肽等长效产品长期使用时达不到理想的体重控制作用(British Journal of Pharmacology(2014)171 1114-1128 1121)。
因此，当前仍然需要更为有效控制血糖和减轻体重而且依从性好的肠道激素类治疗剂。
发明内容
本发明的目的提供一种嵌合多肽，该多肽是GLP-1受体激动剂，和胰高血糖素受体的部分激动剂，在发挥降血糖作用的同时，还具有优于单纯的GLP-1受体激动剂的减轻体重作用，进一步地，本发明的多肽还具有长效性，可以提高用药依从性，适合用于糖尿病、肥胖等慢性病的治疗。
一方面，本发明提供了一种嵌合多肽，所述多肽的序列如以下通式I所示：
通式1：
HX2QGTFTSDYSKYLX15X16X17X18X19X20X21FIX24WLX27KGX30X31X32
其中：
X2为Aib或D-Ser；
X15为Asp或Glu；
X16为Aib或Glu；
X17为Glu或Arg；
X18为Ala或Arg；
X19为Val或Ala；
X20为Lys或Gln；
X21为Leu或Glu；
X24为Ala、Glu或Cys；
X27为Val或Leu；
X30为Arg、Cys或不存在；
X31为Gly、Cys、-NH2或不存在；
X32为-NH2、Cys或不存在；
并且，X24、X30、X31、X32中有且仅有一个位点为Cys。
优选地，在通式I所示的序列中，X2为Aib或D-Ser，X15为Asp或Glu，X16为Glu，X17为Glu，X18为Ala，X19为Val，X20为Lys，X21为Leu或Glu，X24为Ala、Glu或Cys，X27为Val或Leu；X30为Arg或Cys，X31为Gly、Cys、-NH2或不存在；X32为-NH2、Cys或不存在；
优选地，在通式I所示的序列中，X2为Aib或D-Ser，X15为Asp或Glu，X16为Glu，X17为Arg，X18为Arg或Ala，X19为Ala，X20为Lys或Gln，X21为Glu，X24为Ala或Cys，X27为Val或Leu；X30为Arg或Cys，X31为Gly、Cys、-NH2或不存在；X32为-NH2、Cys或不存在；
优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-40中任一条所示。
另一方面，本发明还提供了所述多肽的聚乙二醇修饰物，其中，在所述多肽的Cys残基的侧链上共价连接聚乙二醇；所述聚乙二醇平均分子量为5-50KD；更优选地为20-50KD；进一步优选地，所述聚乙二醇为40-45KD的直链或支链聚乙二醇；
另一方面，本发明还提供了一种上述多肽的二聚体，所述二聚体是由上述多肽通过Cys残基共价连接而成或通过接头共价连接而成；
优选地，所述二聚体通过连有双官能胺交联基团的接头与本发明的多肽的巯基反应形成；
优选地，所述接头为双马来酰亚胺-聚乙二醇(Mal-PEG-Mal)；
更优选地，所述聚乙二醇平均分子量范围为3-20KD；
优选地，所述二聚体为同源二聚体；
再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述多肽或其盐、上述多肽的聚乙二醇修饰物、其二聚体。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
更优选地，所述载体和/或辅料包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水或渗透压调节剂中的一种或多种。
优选地，所述水溶性填充剂选自甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖等中的一种或多种；所述pH调节剂包括但不限于枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐中的一种或多种；所述稳定剂选自EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
再另一方面，本发明提供了上述多肽、多肽的聚乙二醇修饰物、其二聚体、其盐或上述药物组合物在制备用于治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征的用途。
优选地，本发明所述的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式或口服、直肠、鼻腔给药。剂量范围可以为5μg-10mg/次，这取决于治疗对象、给药方式、适应症以及其他因素等。
以下为发明内容的详细说明：
具有通式I结构的多肽：
人源GLP-1的活性形式是GLP-1(7-36/37)，其氨基酸序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(7-36)，HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(7-37)；
毒蜥蜴来源的GLP-1受体激动剂多肽Exendin-4的序列为：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2；
而内源性胰高血糖素的多肽序列为：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(1-29)。
本发明人发现，通过将GLP-1(7-36/37)、GC和Exendin-4序列的特定的片段部分嵌合到一个多肽序列中，如将GC序列的1-15片段与Exendin-4序列的16-26片段以及GLP-1序列的27-30/31片段嵌合得到的嵌合多肽(如SEQ ID NO：1-6)在对GLP-1受体具有激动活性的同时，还可以部分激动GC受体。同时，本发明人发现将该多肽序列的2位氨基酸替换为不易被酶活性位点识别的其他氨基酸可以抵抗酶降解失活，如2位用d-Ser，Aib替代，从而克服可GLP-1(7-36/37)和GC在体内极易被DPP-IV水解而失去N端两个氨基酸而失活的缺陷。本发明人还发现，在多肽序列的C-末端羧基酰胺化有助于提高多肽稳定性，因此，本发明实施方案中一些特定序列的C-末端羧基形成酰胺。
经过上述结构设计，本发明提供的如通式I所示的序列的多肽具有以下的优点：
1)本发明的多肽其活性侧重于对GLP-1受体的激动作用，同时还是GC受体的部分激动剂，具有理想的降血糖作用同时可以有效地减轻体重，与单纯的GLP-1受体的激动剂相比更具应用价值；
2)本发明的多肽不容易被DPP-IV识别，从而避免了DPP-IV酶的识别和由此造成的降解失活；
3)本发明提供的多肽序列中24位或C-末端替换或引入Cys残基不影响多肽的活性，可以选择作为长效化修饰位点。C-末端羧基酰胺化有助于多肽系列稳定，因此，本发明还进一步提供了特定序列的C-末端羧基形成酰胺。
本发明的具体的多肽序列如但不限于SEQ ID NO：1-40的多肽序列。
聚乙二醇化
多肽类激素在机体内主要通过酶降解和肾清除途径代谢，其中肾清除占主导，是影响多肽类药物体内半衰期的主要因素。多肽序列中一些氨基酸残基侧链上的结构修饰特别是烷基化或聚乙二醇等大分子基团的缀合可以延缓肾清除，有效延长生物半衰期。
一般的，聚乙二醇修饰会导致多肽的活性下降或药效延迟。本发明的特定实施方案中，具有通式I序列多肽，在位点X24或C末端的X30、X31或X32的Cys残基的巯基侧链上定点缀合聚乙二醇(PEG)基团，发现受体结合活性仍可保留，而且体内药效持久。本发明所述PEG是指平均分子量范围5-50KD的直链或支链结构，在一些实施方案中优选40-45KD的分子量范围。
本发明所述的聚乙二醇是通过多种途径可以得到，包括商业途径获得或者根据本领域中已知的方法自行制备。
本发明所述PEG修饰可以通过本领域公知的任何方法实现，包括经由酰化、还原性烷化、Michael加成、硫醇烷化或通过PEG部分的活性基团(例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其他化学选择性缀合方法。在本发明的特定实施方案中，通过Michael加成反应，即用马来酰亚胺活化的PEG修饰Cys的巯基侧链，产生硫醚键连接的聚乙二醇化多肽。在某些实施方案中，通过亲核取代反应，即用卤代乙酰基活化的PEG修饰硫醇，得到硫醚键连接的聚乙二醇化多肽。
二聚体
多肽的二聚体或多聚体形式也是延长多肽体内半衰期的有效手段。本发明的特定实施方案中提供了具有通式I序列结构多肽的二聚体形式。包括通过序列中24位Cys残基上的巯基侧链以分子间二硫键形成的同源二聚体或经由接头共价结合的二聚体形式。这些多肽二聚体是通过形成空间位阻有效屏蔽肽链中的酶切位点而延缓活性多肽降解。
在特定实施方案中，通式I序列结构的单链多肽通过结构中半胱氨酸残基的侧链巯基氧化形成分子间二硫键。二硫键形成方法可采用本技术领域公知的常规技术，包括空气氧化、谷胱甘肽、K3Fe(CN)6，I2，DMSO氧化法等。
在一些特定实施方案中所述二聚体是通过连有双官能胺交联基团的接头与单体肽链的巯基反应形成。所述接头是但不限于双马来酰亚胺-聚乙二醇(Mal-PEG-Mal)，所述聚乙二醇平均分子量范围优选但不限于3000-20000道尔顿。
用途
针对目前治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征等现有药物治疗的局限性，本发明提供一种新型治疗方法，所述方法涉及给予包含本发明的多肽或其可药用盐的药物组合物。与单独给予GLP-1受体激动剂相比，包含本发明的多肽或其可药用盐的药物组合物在更为有效地降低血糖的同时具有促进减重和防止增重作用，逆转胰岛素抵抗，与现有药物相比具有意想不到的有益作用。
药物组合物
再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述多肽或其盐、上述多肽的聚乙二醇修饰物、其二聚体。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
更优选地，所述载体和/或辅料包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂中的一种或多种。
优选地，所述水溶性填充剂包括但不限于甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等；所述pH调节剂包括但不限于枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐；所述稳定剂包括但不限于EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠或氯化钾。
再另一方面，本发明提供了上述多肽、多肽的聚乙二醇修饰物、其二聚体、其盐或上述药物组合物在制备用于治疗糖尿病、肥胖和/或代谢综合征的药物中的用途。
优选地，本发明所述的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式或口服、直肠、鼻腔给药。剂量范围可以为5μg-10mg/次，这取决于治疗对象、给药方式、适应症以及其他因素等。
实施方案
合成：
在本发明提供的具有通式I结构的序列肽链是通过本领域公知的方法制备得到：
1)通过常规固相或液相方法逐步或通过片段组装合成；
2)在宿主细胞中表达编码多肽的核酸构建体，并从宿主细胞培养物回收表达产物；
3)影响编码多肽的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收表达产物；
或通过方法1)、2)或3)的任意组合来获得肽片段，随后连接这些片段以获得目标肽。
本发明提供的实施方案中优选地，使用Fmoc固相合成方法制备得到目标肽。
本发明提供的具体实施方案中通过以下方法完成目标多肽的聚乙二醇化修饰：将经过活化的PEG与本发明的多肽在pH5.0-7.0，PEG与肽的摩尔比值为1-10，反应时间为0.5-12小时，反应温度为4-37℃。
缀合反应之后，可以通过本领域公知的合适方法将目标产物分离。适用的方法包括但不限于超滤法、透析法或色谱法等。
本发明的实施方案中通过GLP-1/GC受体介导的体外cAMP产生的影响评价了所述多肽对GLP-1/GC受体的作用。
本发明的实施方案中采用正常小鼠糖负荷模型，以艾赛那肽为阳性对照药，评价了多肽的降血糖活性。
本发明的实施方案中采用高脂饮食肥胖型糖尿病小鼠(Dio)模型评价了所述PEG修饰多肽的降血糖作用和对体重的影响，结果表明本发明提供的聚乙二醇修饰多肽具有显著的降血糖作用和减轻体重作用，其药效和长效性优于阳性对照药，而且溶解性和稳定性好，更适于制剂，可用于制备肥胖等代谢性疾病的控制和糖尿病的治疗药物。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为使用本发明的实施例7中SEQ ID NO：1的同源二聚体(SEQ ID NO：1-1)、SEQID NO：3的PEG修饰物(gep-3)、SEQ ID NO：6的PEG(40KD)修饰物(gep-6)、SEQ ID NO：4双马来酰亚胺(PEG3000)二聚体(SEQ ID NO：4-1)、SEQ ID NO：15的PEG(45KD)修饰物(gep-15)对正常小鼠糖负荷模型的降血糖作用评价结果；
图2为实施例8中SEQ ID NO：3、15多肽的PEG修饰物给药两周对Dio小鼠体重影响的评价结果。
图3为实施例8中SEQ ID NO：3、15多肽的PEG修饰物给药两周对Dio小鼠血糖影响的评价结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本实施例仅为解释本发明，不意味以任何方式限制本发明内容。
氨基酸缩写的说明：
Gly：甘氨酸(G)
Ala：丙氨酸(A)
Val：缬氨酸(V)
Leu：亮氨酸(L)
Phe：苯丙氨酸(F)
Trp：色氨酸(W)
Ser：丝氨酸(S)
Thr：苏氨酸(T)
Glu：谷氨酸(E)
Gln：谷氨酰胺(Q)
Asp：天冬氨酸(D)
Asn：天冬酰胺(N)
Tyr：苯丙氨酸(Y)
Arg：精氨酸(R)
Lys：赖氨酸(K)
His：组氨酸(H)
Aib：2-氨基异丁酸
试剂缩写的说明
Boc：叔丁氧基羰基
Tert-Bu：叔丁基
DCM：二氯甲烷
DIC：二异丙基碳二亚胺
Fmoc：9-芴甲氧基羰基
HoBt：1-羟基苯并三唑
HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲鎓六氟磷酸酯
HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基-脲鎓六氟磷酸酯
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DMF：二甲基甲酰胺
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃
Trt：三苯基甲基
EDT：乙二硫醇
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
FBS：胎牛血清
实施例1
通式I多肽单体的制备
1)合成：采用Fmoc策略，用CS 336型多肽合成仪(CS Bio)，按照如下步骤逐步合成：
a)在活化剂系统存在下由树脂固相载体和Fmoc保护的C-端氨基酸偶联得到Fmoc-氨基酸-树脂；其中，合成C-端酰胺化多肽采用氨基树脂，如Rink Amide AM，Rink Amide，Rink MBHA等。
b)肽链的延长：通过固相合成法按照肽序列氨基酸顺序连接氨基酸，得到N-端和侧链保护的肽-树脂偶联物；带侧链氨基酸采取如下保护措施：色氨酸用Boc，谷氨酸用OtBu，赖氨酸用Boc，谷氨酰胺用Trt，酪氨酸用tBu，丝氨酸用Trt或tBu，天冬氨酸用OtBu，苏氨酸用tBu，半胱氨酸用Trt，组氨酸用Trt或Boc，精氨酸用Pbf保护。使用的偶联活化剂为HOBT/HBTU/DIEA和HOBT/HATU/DIEA，茚三酮法检测反应效率。
c)树脂上多肽的裂解：TFA/EDT/TIS/H2O(92.5∶2.5∶2.5∶2.5v/v)溶液，置室温下反应90min，脱保护和脱树脂。抽滤得滤液，用过量乙醚沉淀粗多肽，离心，收集沉淀，再用少量乙醚洗涤沉淀，真空下干燥，得粗品多肽。同时脱除保护基和树脂，得到本发明所述的多肽的粗品；
2)纯化：将得到的多肽的粗品溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，加入50-100mM的二硫基苏糖醇DTT或β-巯基乙醇进行变性，采用制备型HPLC法，C18色谱柱，乙腈-水-三氟乙酸系统分离纯化，浓缩，冻干，得巯基游离的纯品多肽。
以上述方法制备得到以下多肽。
SEQ ID NO：1HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKLFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：2HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKLFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：3HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKLFIEWLVKGRCNH2
SEQ ID NO：4HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKLFIEWLVKGRCNH2
SEQ ID NO：5HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKLFIEWLVKGCNH2
SEQ ID NO：6HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKLFIEWLVKGCNH2
SEQ ID NO：7HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKLFICWLLKGRNH2
SEQ ID NO：8HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKLFICWLLKGRNH2
SEQ ID NO：9HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKLFIEWLLKGRCNH2
SEQ ID NO：10HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKLFIEWLLKGRGC
SEQ ID NO：11HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKLFIAWLLKGCNH2
SEQ ID NO：12HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKLFIEWLLKGCNH2
SEQ ID NO：13HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKEFIAWLVKGRGC
SEQ ID NO：14HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKEFIAWLVKGCNH2
SEQ ID NO：15HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKEFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：16HAibQGTFTSDYSKYLEEEAVKEFIAWLVKGRCNH2
SEQ ID NO：17HAibQGTFTSDYSKYLDEEAVKEFIAWLLKGCNH2
SEQ ID NO：18HAibQGTFTSDYSKYLDERRAKEFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：19HAibQGTFTSDYSKYLEERRAKEFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：20HAibQGTFTSDYSKYLDERRAKEFIAWLVKGRCNH2
SEQ ID NO：21HAibQGTFTSDYSKYLEERRAKEFIAWLVKGRGC
SEQ ID NO：22HAibQGTFTSDYSKYLDERRAKEFICWLLKGRNH2
SEQ ID NO：23HAibQGTFTSDYSKYLEERRAKEFIAWLLKGRCNH2
SEQ ID NO：24HAibQGTFTSDYSKYLEERAAQEFICWLLKGRNH2
SEQ ID NO：25HAibQGTFTSDYSKYLEERAAQEFIAWLLKGCNH2
SEQ ID NO：26HAibQGTFTSDYSKYLEERAAQEFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：27HAibQGTFTSDYSKYLDERAAQEFIAWLVKGRCNH2
SEQ ID NO：28HAibQGTFTSDYSKYLDERAAQEFIAWLVKGRGC
SEQ ID NO：29HAibQGTFTSDYSKYLEERAAQEFIAWLVKGRGC
SEQ ID NO：30H(d-S)QGTFTSDYSKYLEEEAVKLFICWLVKGRNH2
SEQ ID NO：31H(d-S)QGTFTSDYSKYLDEEAVKLFIEWLVKGRNH2
SEQ ID NO：32H(d-S)QGTFTSDYSKYLDEEAVKEFIAWLVKGRNH2
SEQ ID NO：33H(d-S)QGTFTSDYSKYLEEEAVKEFIAWLVKGCNH2
SEQ ID NO：34H(d-S)QGTFTSDYSKYLDEEAVKLFIEWLVKGCNH2
SEQ ID NO：35H(d-S)QGTFTSDYSKYLDERAAQEFIAWLVKGRGC
SEQ ID NO：36H(d-S)QGTFTSDYSKYLEERAAQEFICAWLVKGRNH2
SEQ ID NO：37H(d-S)QGTFTSDYSKYLEERAAQEFICWLLKGRNH2
SEQ ID NO：38H(d-S)QGTFTSDYSKYLDERAAQEFIAWLLKGRCNH2
SEQ ID NO：39H(d-S)QGTFTSDYSKYLEERRAKEFIAWLLKGRCNH2
SEQ ID NO：40H(d-S)QGTFTSDYSKYLDERRAKEFIAWLLKGCNH2
实施例2聚乙二醇化多肽的制备
1)连接：
马来酰基功能化：SEQ ID NO：1多肽溶解于含有5mM EDTA的pH6的50mM磷酸钠缓冲溶液中，浓度为2mg/mL。加入1.2-1.5倍摩尔量的固态的PEG-马来酰亚胺，搅拌溶解，于室温反应2hr。反应以HPLC监控，以5mMβ-巯基乙醇终止反应，置室温30min后纯化。
碘乙酰基功能化：通过肽前体和碘乙酰基功能化的mPEG(1∶1)在7M脲/50mM Tris缓冲液(pH7.5-8.5)中室温搅拌反应45分钟完成聚乙二醇修饰，以在PEG和肽链上的Cys间形成共价硫醚键。
2)纯化：采用制备型离子交换柱层析，以SP SepharoseHP填料，以0-500mM氯化钠溶液线性梯度洗脱。流出液以HPLC和SDS-电泳检测，收集PEG-多肽流分，超滤浓缩，冷冻干燥而得。
3)纯品多肽经MILD-Q-TOF进行全分子量扫描，确定平均分子量。
采用上述方法制备了下表1所示的PEG化多肽。
表1PEG化多肽
| 序列 | 修饰位点 | 基团 |
| SEQ ID NO：1 | Cys24 | Mal-mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO：2 | Cys24 | Mal-mPEG(45KD) |
| SEQ ID NO：3 | Cys31 | Mal-mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO：4 | Cys31 | Mal-mPEG(45KD) |
| SEQ ID NO：5 | Cys30 | Mal-mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO：6 | Cys30 | -mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO13 | Cys32 | Mal-mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO15 | Cys24 | Mal-mPEG(45KD) |
| SEQ ID NO16 | Cys31 | Mal-mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO：19 | Cys24 | Mal-mPEG(35KD) |
| SEQ ID NO：21 | Cys32 | Mal-mPEG(40KD) |
| SEQ ID NO：24 | Cys24 | Mal-mPEG(20KD) |
| SEQ ID NO：27 | Cys31 | Mal-mPEG(45KD) |
| SEQ ID NO：30 | Cys24 | --mPEG(30KD) |
| SEQ ID NO：35 | Cys32 | Mal-mPEG(40KD) |
实施例3二聚体(二硫键连接)的制备
将GLP-1类似物单体以适当浓度(1.5-2mmol/L)溶解于去离子水中，根据碳酸氢铵法或DMSO法形成二聚体，按实施例1中纯化方法纯化，得到GLP-1类似物二聚体纯品。
按照该方法制备了SEQ ID NO：1、3、5、13、15、27的二硫键同源二聚体。
实施例4Cys-双马来酰亚胺二聚体的制备
将0.05mmol的SEQ ID NO：1单体多肽和0.15-0.2mol的平均分子量3500的双马来酰亚胺聚乙二醇溶解于pH6的含有0.01mM EDTA的磷酸盐缓冲液中，室温下搅拌16小时后，继续在反应体系中加入0.05mmol的单体多肽，继续搅拌反应16-20小时，用HPLC监控反应，以5mMβ-巯基乙醇终止反应，置室温30min。采用制备型离子交换柱层析，以SP SepharoseHP填料，以0-500mM氯化钠溶液线性梯度洗脱。流出液以HPLC和SDS-电泳检测，收集PEG-多肽流分，超滤浓缩，进一步用制备型HPLC纯化，相应流分浓缩，冷冻干燥，得目标二聚体。同法制备得到SEQ ID NO：2、4、6、27、28、32、40通过双马来酰亚胺连接的同源二聚体。
实施例5本发明的多肽、二聚体和PEG修饰体在体外对DPP-IV降解的稳定性
受试样品于37℃在50mmol/L TEA-HCl(pH7.8)中与纯化的猪DPP-IV(5毫单位)共孵0、2、4、8小时。HPLC法(色谱柱：Aeriswidepore XB-C18 3.6μm，4.6×150mm；流动相：A：0.05％TFA，B：95％乙腈；检测波长：214nm)测定各时间点溶液中的残留样品峰面积，计算样品消除率。结果见表2。
表2本发明的多肽、二聚体和PEG修饰体在体外的半衰期
| 肽 | 半衰期(h) |
| GLp-1 | 3.8±0.21 |
| GC | 2.4土0.16 |
| SEQ ID NO：1 | ＞8 |
| SEQ ID NO：3 | ＞8 |
| SEQ ID NO：5 | ＞8 |
| SEQ ID NO：13 | ＞8 |
| SEQ ID NO：27 | ＞8 |
| SEQ ID NO：1-Mal-mPEG(40KD) | ＞8 |
| SEQ ID NO：3-Mal-mPEG(40KD) | ＞8 |
| SEQ ID NO：6二聚体 | ＞8 |
实施例6对GLP-1/GC受体的作用
通过对GLP-1/GC受体介导的体外cAMP产生的影响评价所述多肽对GLP-1/GC受体的作用。
将转染有人GLP-1受体的中国豚鼠非细胞和转染GC受体的HEK293细胞接种到96孔培养板，(200000个/孔)，以Hanks’平衡盐缓冲液洗涤后，与不同浓度的受试多肽样品(10-5-10-12mol/L)，在200μmol/L3-异丁基-1-甲基茜草黄素存在下于37℃共孵20min。去除介质，溶解细胞，测定cAMP值，测定方法参照分析试剂盒说明。用Origin软件计算50％有效浓度。结果见表3、4。
表3多肽对cAMP的诱导产生作用
实施例7降血糖作用评价
采用正常小鼠糖负荷实验评价了本发明的多肽的降血糖作用。
动物(n＝8)于实验前禁食过夜，皮下注射生理盐水(10mL/kg)作为对照组；皮下注射艾塞那肽(5μg)作为阳性对照药组；其余受试组分别为、SEQ ID NO：1的同源二聚体(SEQID NO：1-1)、SEQ ID NO：3的PEG修饰体(gep-3)、SEQ ID NO：6的PEG(40KD)修饰体(gep-6)、SEQ ID NO：4双马来酰亚胺(PEG3000)二聚体(SEQ ID NO：4-1)、SEQ ID NO：15的PEG(40KD)修饰体(gep-15)。
称取适量受试品(≥98％)溶于生理盐水，配制成50μg/ml的样品溶液。试验组小鼠，每只皮下注射200μl受试品溶液；
给药前测定血糖，葡萄糖(4.5g/kg)腹腔注射后即刻给与受试样品，尾尖取血测定药后15，30，60min的血糖水平。
结果见图1。
所试5个样品均显示了与阳性药艾塞那肽相当的降糖作用，其中SEQ ID NO：1-1略优于阳性药。
实施例8对Dio小鼠体重和血糖的影响
将平均体重50.2g的Dio小鼠(北京华埠康生物科技有限公司)分为4组，每组10只，其中，空白组给予生理盐水，阳性对照组给予利拉鲁肽25nmol/kg，每日一次，受试组分别给与实施例2中制备的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：15多肽的PEG修饰物(分别简称gep-3、gep-15)300nmol/kg，每周一次，给药2周。在注射后0、2、4、6、8、10、12、14天测量体重变化，检测任意血糖水平。结果见图2、图3。
受试药物组，即gep-3，gep-15每周给药1次，连续给药2周，显示了与阳性药利拉鲁肽相似的降血糖作用，但相较阳性对照药更为显著地减轻体重，给药14天减轻幅度可达到11-13％。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 天津药物研究院有限公司
<120> 一种嵌合嵌合多肽及其用途
<130> DIC16110048
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 1
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 2
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 3
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 4
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 5
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 6
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 7
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Cys Trp Leu Leu Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 8
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Cys Trp Leu Leu Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Arg的C端连接NH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 9
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<400> 10
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 11
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 12
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<400> 13
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 14
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 15
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 16
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 17
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 18
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 19
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 20
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<400> 21
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 22
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Leu Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 23
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 23
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 24
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Cys Trp Leu Leu Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 25
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 26
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Arg的C端连接NH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 27
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<400> 28
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib，2-氨基异丁酸
<400> 29
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1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 30
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 31
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 32
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 33
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 34
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<400> 35
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 36
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 36
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Cys Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 37
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Cys Trp Leu Leu Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 38
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 38
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 39
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 39
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D型丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 40
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Lys Gly Cys
20 25 30
Claims (18)
1.一种嵌合多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15所示。
2.如权利要求1所述的多肽的聚乙二醇修饰物，其特征在于，在所述多肽的Cys残基的侧链上共价连接聚乙二醇。
3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述聚乙二醇平均分子量为5-50KD。
4.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述聚乙二醇平均分子量为20-50KD。
5.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述聚乙二醇为40-45KD的直链或支链聚乙二醇。
6.如权利要求1所述的多肽的二聚体，其特征在于，所述二聚体是由所述多肽通过接头共价连接而成。
7.如权利要求1所述的多肽的二聚体，其特征在于，所述二聚体是由所述多肽通过Cys残基共价连接而成。
8.如权利要求6所述的二聚体，其特征在于，所述二聚体通过连有双官能胺交联基团的接头与如权利要求1所述的多肽的巯基反应形成。
9.如权利要求6所述的二聚体，其特征在于，所述接头为双马来酰亚胺-聚乙二醇。
10.如权利要求9所述的二聚体，其特征在于，所述聚乙二醇平均分子量范围为3-20KD。
11.如权利要求6所述的二聚体，其特征在于，所述二聚体为同源二聚体。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的多肽或其盐、如权利要求2-5中任一项所述的聚乙二醇修饰物或如权利要求6-11中任一项所述的二聚体。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述载体和/或辅料包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂中的一种或多种。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述水溶性填充剂选自甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖中的一种或多种；所述pH调节剂选自枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵盐的一种或多种；所述稳定剂选自EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述羧基/羟基纤维素或其衍生物为HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC。
17.如权利要求1所述的多肽或其盐、如权利要求2-5中任一项所述的聚乙二醇修饰物或如权利要求6-11中任一项所述的二聚体在制备用于治疗糖尿病、肥胖或代谢综合征的药物中的用途。
18.如权利要求12-16中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病、肥胖或代谢综合征的药物中的用途。
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| Effects of glucagon-like peptide-1 receptor agonists on non-alcoholic fatty liver disease and inflammation;Xing-Chun Wang 等;《World Journal of Gastroenterology》;20141028;全文 * |
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