CN108307823B - 一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法 - Google Patents

一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法。本发明利用蓝莓组培苗作为插条进行扦插繁殖，将继代芽苗瓶内生根培养阶段与生根苗移栽驯化结合起来，减少了组织培养环节，节约了生产成本且大大缩短了生根时间，进而缩短了育苗周期，并通过研究不同条件对蓝莓组培苗扦插生根的影响，探索影响蓝莓组培苗扦插生根的条件，进而利用人工调控，提高了生根率。本发明建立了一种能够快速、大量繁殖蓝莓苗木的新方法，能够满足市场对蓝莓的大量需求。

Description

一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法
技术领域
本发明涉及一种蓝莓的组织培养方法，特别涉及一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法，本发明属于农业种植技术领域。
背景技术
蓝莓(blueberry)，属杜鹃花科(Eri-caceae)越橘属(Vaccinium)植物，又名越橘、蓝浆果，是多年生的小浆果灌木果树。
蓝莓果实富含糖、酸、蛋白质、维生素、矿物质元素，除此之外还含有花色素苷、熊果苷、尼克酸、单宁酸、黄酮素、抗氧化剂、叶酸等物质。果实具有保护视力缓解视疲劳，延缓衰老、抗癌、增强人体的免疫，软化血管等保健功能和药用价值。此外，蓝莓果实还有极高的经济价值，除可鲜食外，果实也可以加工成饮料、化妆品、保健品等，因此被誉为“浆果之王”，并且被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一[6-8]。蓝莓不仅是经济价值较高的浆果树种，其观赏价值同样可以得到开发利用，蓝莓成园后，春观花、夏品果、秋赏叶，极具观赏性。
目前，蓝莓苗木的主要繁育方法是组织培养和扦插。植物组织培养，是将植物体的细胞、组织、活器官以及原生质体等在无菌的操作条件下接种到相应的培养基上，由人工控制其培养条件，以获得再生植物的一项技术。组织培养由于具有培养周期短、繁殖速度快并且不受季节限制等优点，因此有很大的应用价值。在组织培养的繁育中，蓝莓可以在在短时间内快速获得大量的增殖苗，但瓶内生根较困难，并且生根周期长，移栽成活率低，成本高，从而限制了蓝莓的繁殖。扦插又称插条、插枝，为植物所使用的其中一种繁殖方法，是把一段植物插在某物质中使其生根、发芽，然后成长开花、结果，是取得与原植物特征一致的最有效方法。相对于组培培养，扦插繁殖因具有简单易行、育苗周期短、生根速度快等优在植物苗木繁育中被广泛应用，但常规的扦插繁殖方法会受到插条数量、取材时间等限制，并且蓝莓直接扦插生根率低是制约利用蓝莓扦插进行无性系生产发展的瓶颈。
随着我国对蓝莓的栽培规模逐渐扩大，优良蓝莓种苗的需求量也急剧增加，因此急需建立一种能够快速、大量繁殖蓝莓苗木的新方法，以满足市场需求。
为此，本发明在较成熟的蓝莓组织培养技术上进行扦插的研究，以减少组织培养环节，降低成本，缩短育苗周期，并通过研究不同条件对蓝莓组培苗扦插生根的影响，探索影响蓝莓组培苗扦插生根的条件，进而利用人工调控，提高生根率，为蓝莓组培苗扦插繁殖提供技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够快速、大量繁殖蓝莓苗木的新方法，该方法生根率高，减少了组织培养环节，缩短了育苗周期，能够在短时间内培育出大量的蓝莓幼苗，并且成本低，操作简单、方便。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法，包括以下步骤：
(1)将采集的蓝莓1年生枝条用水培法促使腋芽萌发，当腋芽萌发并长至1.5-2.5cm时剪下，消毒后放入超净工作台中，接到初代培养基中；
(2)在培养室温度为24-26℃，湿度70％-80％，光强2000lx，光照周期12h/d的条件下进行蓝莓组培苗的初代培养和继代培养；
(3)取经继代培养后的组培苗进行炼苗；
(4)用镊子将炼好的组培苗从瓶中取出，放入清水中，将粘带的培养基洗干净，用剪刀将其底端的木质化部分和顶端生长弱的部分剪掉，留下生长较旺盛的茎段，剪成4.5-5.5cm的茎段，茎段浸蘸生根液后进行扦插，扦插所采用的苗床为铺有基质的穴盘；
(5)组培苗扦插完后立即放入小拱棚里保温，定时浇水，前10d，控制拱棚内的空气湿度为95％-100％，温度控制在23-26℃，2周后，空气湿度保持在85％-90％之间，温度控制在23-26℃，扦插20d后，每周喷施1次1/2倍的大量元素培养液和杀菌剂。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述的消毒是用75v/v％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次后转入0.1w/w％HgCl2溶液中，消毒8min，最后用重蒸馏水冲洗5次。
在本发明中，优选的，所述的蓝莓品种为伯克利、美登和日出，更优选的，所述的蓝莓品种为美登。
在本发明中，优选的，蓝莓美登初代培养和继代培养所采用的培养基均为含有2.0g/L ZT，20mg/L蔗糖以及7g/L琼脂的WPM培养基，pH 5.1；蓝莓日出与伯克利的初代培养基为含有0.3g/L ZT，20mg/L蔗糖以及7g/L琼脂的WPM培养基，pH 5.1，继代培养基为含有2.0g/L ZT，20mg/L蔗糖以及7g/L琼脂的WPM培养基，pH 5.1。
在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的炼苗是将经继代培养后的组培苗放入有自然光照的无菌室内，放置3d后将其移入温室，4d后将未染菌的组培苗的瓶口逐渐打开，准备扦插。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的扦插所采用的基质为苔藓、草炭土、体积比为1:1的草炭土和蛭石的混合物、体积比为1:1的草炭土和珍珠岩的混合物或体积比为2:1的苔藓和草炭土的混合物，更优选的，所述的基质为苔藓。
在本发明中，优选的，苗床按照以下方法制备：干苔藓用清水洗三遍后放入稀释800倍的多菌灵液中，浸泡12h，捞出甩干后平铺在穴盘里；草炭土、蛭石、珍珠岩，用800倍的多菌灵液浇透，将草炭土分别与蛭石、珍珠岩以及苔藓按体积比为1：1、1：1以及1：2的比例混匀，装入穴盘中；将铺好的穴盘用0.1w/w/％的高锰酸钾消毒，放置24h后使用。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的茎段为组培苗的中段和下段。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的生根液为按照100-250倍稀释的3721生根液、200-2000mg/L的IBA溶液或200-2000mg/L NAA溶液，茎段浸蘸3721生根液的时间为20s，浸蘸IBA溶液和NAA溶液的时间为2s，更优选的，所述的生根液为1500mg/L的IBA溶液。
在本发明中，优选的，步骤(5)中所述的1/2倍的大量元素培养液中含有NH4NO3825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L以及KH2PO4 85mg/L。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
组培苗瓶内生根较瓶外生根技术而言，瓶内诱导试管苗生根过程的时间长、费用高、效率低。De-bergh等认为瓶外生根总费用可降低35％～75％。尤其就蓝莓而言，在瓶内生根时间在3个月以上，而瓶外生根仅需35～45d。本发明将继代芽苗瓶内生根培养阶段与生根苗移栽驯化结合起来，
减少了组织培养环节，节约了生产成本且大大缩短了生根时间，进而缩短了育苗周期，并通过研究不同条件对蓝莓组培苗扦插生根的影响，探索影响蓝莓组培苗扦插生根的条件，进而利用人工调控，提高了生根率，建立了一种能够快速、大量繁殖蓝莓苗木的新方法，能够满足市场对蓝莓的大量需求。
附图说明
图1为组培苗扦插后16d时的形态；
图2为组培苗扦插后24d时的形态；
图3为组培苗扦插后50d时的形态；
图4为美登品种扦插生根过程中的解剖特性；
图4a：扦插前的插穗的解剖结构；图4b：扦插后10d插穗的解剖结构；图4c为扦插后12d插穗的解剖结构；图4d为扦插后24d插穗的解剖结构。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1蓝莓组培苗扦插繁殖方法的建立
1材料与方法
1.1蓝莓组培苗的培养
1.1.1材料及前期处理
本试验于2014年11月至2016年9月在黑龙江省农科院园艺分院实验室进行。试验材料于2014年11月在黑龙江省农科院园艺分院蓝莓园中采集，蓝莓品种为伯克利、美登和日出。
将在采集的三个品种的1年枝条带回实验室，用水培法促使腋芽萌发，当腋芽萌发并长至2cm左右时剪下，放入超净工作台中，用75v/v％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次后转入0.1w/w％HgCl2中，消毒8min，最后用重蒸馏水冲洗5次，接到初代培养基中。
1.1.2培养条件
以WPM作为基本培养基，蓝莓美登初代培养和增殖培养的培养基均采用WPM+2.0g/L ZT；日出与伯克利的初代培养基采用WPM+0.3mg/L ZT，增殖培养基采用WPM+2.0mg/L ZT，这三种培养基中另加蔗糖20mg/L，琼脂7g/L，pH 5.1，培养基在121℃，1.0-1.2大气压下灭菌20min，培养室的温度为24-26℃，湿度70％-80％，光强2000lx，光照周期12h/d。三个品种的蓝莓组培苗进行大量增殖，以供试验使用。
1.2蓝莓组培苗扦插繁殖的研究
1.2.1材料的前期处理
取经继代培养后的美登、伯克利、日出组培苗进行炼苗，放入有自然光照的无菌室内，放置3d后将其移入温室，4d后将未染菌的组培苗的瓶口逐渐打开待用。扦插前，用镊子将炼好的组培苗从瓶中取出，放入清水中，将粘带的培养基洗干净，扦插时，组培苗除调查不同部位对扦插生根的影响外，都用剪刀将其底端的木质化部分和顶端生长弱的部分剪掉，留下生长较旺盛的茎段，剪成5cm茎段进行扦插。试验于2015年5月25日8：00在黑龙江省农科院园艺分院温室内进行。
1.2.2苗床的准备
干苔藓用清水洗三遍后放入稀释800倍的多菌灵液中，浸泡12h，捞出甩干后平铺在穴盘里。草炭土、蛭石、珍珠岩，用800倍的多菌灵液浇透。将草炭土分别与蛭石和珍珠岩按体积比为1：1的比例混匀，装入穴盘中。将铺好的穴盘用0.1％的高锰酸钾消毒，放置24h后使用。
1.2.3扦插后的管理
组培苗扦插完后立即放入扣好的小拱棚里保温，用喷雾式喷壶定时浇水。前10d,保证拱棚内的空气湿度在95％以上，温度控制在23-26℃,温度超过30℃时要及时放风，并且在阳光较强时遮盖遮阳网。2周后，空气湿度保持在85％-90％之间，随着温度升高逐渐揭开塑料膜，扦插20d后，每周喷施1次1/2倍的大量元素培养液和杀菌剂。
所述的1/2倍的大量元素培养液中含有NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L以及KH2PO4 85mg/L。
1.2.4测定的指标及方法
1.2.4.1外源激素的处理对蓝莓扦插生根的影响
以美登为试材，为了调查不同种类及浓度的激素对组培苗茎段扦插生根的影响，取长势健壮的组培苗，剪成5cm的茎段，分别在不同浓度的3721生根液、IBA和NAA处理下进行扦插。选取不同浓度的3721生根液，NAA，IBA共13个处理(表1)，设3721生根液的4个浓度分别为稀释100倍，稀释150倍，稀释200倍，稀释250倍；设IBA的4个浓度分别为500mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L；NAA的4个浓度分别设为500mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L，以清水为对照，茎段浸蘸3721生根液的时间为20s，浸蘸IBA和NAA的时间为2s，扦插基质选用苔藓，每个处理扦插100株为1个小区，试验重复3次，随机区组排列，50d后调查生根率、平均生根条数、平均根长、综合评价插穗生根质量(生根指数Q)。
评价指标：
生根率(％)＝生根的组培苗数量/扦插的组培苗总数×100％
平均根数(条)＝总根数/生根株数
平均根长(cm)＝根系总长/生根总量
生根指数(Q)＝生根率×50％+平均根数×25％+平均根长×25％
表1不同种类及浓度的激素扦插处理组合方案
Figure BDA0001569361700000061
1.2.4.2不同品种对扦插生根的影响
以伯克利，美登，日出组培苗为试材，分别将长势健壮的三个品种的组培苗剪成5cm茎段，分别将三个品种的茎段用1500mg/L的IBA速蘸基部2s，以苔藓为扦插基质，比较不同品种的蓝莓生根能力的差异。每个品种扦插100个茎段为1个小区，试验重复3次，随机区组排列，50d后调查各个品种的生根率、平均生根条数、平均根长、综合评价插穗生根质量(生根指数Q)。
1.2.4.3不同温度对蓝莓扦插生根的影响
依据不同的温度，将美登组培苗分为4个处理，试验在型号为HPG-208HX的人工气候培养箱中进行，模拟室外环境，保持其它条件一致，苔藓作为基质，温度分别设为20℃、23℃、26℃、29℃，将生长健壮的组培苗茎段茎段剪成5cm，在1500mg/L的IBA浸蘸2s后进行扦插，每个处理扦插100个茎段为1个小区，试验重复3次，随机区组排列，50d后调查生根率、平均生根条数、平均根长、综合评价插穗生根质量(生根指数Q)。
1.2.4.4不同基质对蓝莓扦插生根的影响
以美登为试材，调查不同基质对美登组培苗扦插生根的影响，选取5种不同的基质，分别为苔藓、草炭土、体积比为1:1的草炭土和蛭石、体积比为1:1的草炭土和珍珠岩、体积比为2:1的苔藓和草炭土，取其生长健壮且长势一致的组培苗茎段，剪成5cm。将剪好的插穗茎段用1500mg/L的IBA速蘸基部2s，分别扦插在5种基质上，每个处理扦插100个茎段为1个小区，试验重复3次，随机区组排列，50d后调查生根率、平均生根条数、平均根长、综合评价插穗生根质量(生根指数Q)。
1.2.4.5不同扦插部位对蓝莓扦插生根的影响
以美登为试材，苔藓为基质，调查不同部位对美登组培苗扦插生根的影响，将组培苗分成上段，中段，下段三部分，用1500mg/L的IBA浸蘸插穗基部2s，每个处理扦插100个茎段为一个小区，试验重复3次，随机区组排列，50d后调查生根率、生根条数、平均根长、综合评价插穗生根质量(生根指数Q)。
2结果
2.1不同条件对蓝莓组培苗微扦插的影响
2.1.1不同外源激素对蓝莓组培苗扦插生根的影响
2.1.1.1不同浓度的IBA对蓝莓组培苗扦插生根的影响
选取长势一致的美登组培苗为试材，IBA浓度分别为500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L，以苔藓作为扦插基质，50d后调查其对蓝莓组培苗扦插生根的影响，其结果如表2：
从表2可以看出，与对照相比，4个浓度的IBA处理均不同程度的提高了插穗的生根率，其中1500mg/L的IBA处理插穗，生根率最高，与其他处理差异显著；从根生条数来看，处理3，即1500mg/L的IBA处理，生根条数最多，为4.23条；从平均根长来看，处理3的平均根长最长，为3.18cm，与处理2差异不显著，与处理1，4，5差异显著；从生根指数来看，处理3的生根指数最高；综上所述，在IBA的四个浓度的处理中，1500mg/L的IBA处理美登组培苗插穗，生根效果最好。
表2不同浓度的IBA对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000081
2.1.1.2不同浓度的NAA对蓝莓组培苗扦插生根的影响
选取长势一致的美登组培苗为试材，NAA浓度分别为500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L，以苔藓作为扦插基质，50d后调查其对蓝莓组培苗扦插生根的影响，其结果如表3-2：
由表3可知，从生根率来看，1000mg/L的NAA生根率最高，为59％，是对照的2.46倍，并且与其他几组处理差异显著；从生根条数来看，1000mg/L的NAA生根条数最多，为4.16条，2000mg/L的NAA生跟条数最少，为3.04条，低于对照，生跟条数由多到少的顺序为，NAA1000mg/L>NAA1500mg/L>NAA500mg/L>CK>NAA2000mg/L；从平均根长来看，1500mg/L的NAA平均根长最长，为2.94cm，除与第四组处理差异不显著外，与其他几组处理均呈显著差异；从生根指数来看，1000mg/L的NAA生根指数最高。综上所述，在NAA的四组处理中，1000mg/L的NAA生根效果最佳。
表3不同浓度的NAA对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000082
Figure BDA0001569361700000091
2.1.1.3不同浓度的3721生根液对蓝莓组培苗扦插生根的影响
选取长势一致的美登组培苗为试材，3721生根液浓度分别为稀释100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L，以苔藓作为扦插基质，50d后调查其对蓝莓组培苗扦插生根的影响，其结果如表3-3：
由表4可知，从生根率来看，稀释200倍的3721生根液生根率最高，为65％，与第2组处理差异不显著，与其他三组呈显著差异；是从生根条数来看，生根条数最多的为稀释200倍的3721生根液，为3.71条；在平均根长方面，稀释150倍的3721生根液平均根长最长，为2.31cm，除与第一组处理差异不显著外，与其他几组处理均呈显著差异；从生根指数来看，稀释200倍的3721生根液生根指数最高。综上所述，在3721生根液的4组处理中，稀释200倍的3721生根液生根效果最佳。
表4不同浓度的3721生根液对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000092
结合表2-4的比较结果可以得出，不同激素种类及浓度对美登组培苗扦插生根均起到促进作用。生根率最高的为1500mg/L的IBA，为75％，对照生根率最低，为24％；在生根数目方面，1500mg/L的IBA生根条数最多，为4.23条。在平均根长方面，1500mg/L的IBA平均根长最长，为3.18cm，约为对照的2.47倍；在生根指数方面，1500mg/L的IBA处理扦插生根的生根指数最高。综上所述，1500mg/L的IBA生根效果好于NAA，3721生根液，即使用1500mg/L的IBA处理美登组培苗，生根效果最佳。
2.1.2不同品种对蓝莓组培苗扦插生根的影响
研究不同品种组培苗间扦插生根的差别，实验选取长势良好的美登组培苗，伯克利组培苗，日出组培苗进行扦插，其他条件一致，50d后调查其生根率，平均生根条数，平均根长以及生根指数，试验结果如表5：
由表5可知，美登的生根率最高，为74％，其次是伯克利，为62％，而日出生根率最低，仅为46％；从生根数来看，美登的平均生根数最多为3.70条，伯克利为2.79条，日出的数最少，2.21条；从平均根长的角度来看来看，美登的值最高，其次是日出，最短的是伯克利。综上所述，美登的Q值最大，为38.64，与另外两个品种差异显著。综上所述，美登组培苗扦插生根效果由于伯克利和日出。
表5不同品种对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000101
2.1.3不同温度对蓝莓组培苗扦插生根的影响
调查温度对蓝莓组培苗微扦插生根的影响，选取四个温度进行处理，苔藓作为基质，激素处理选用1500mg/L IBA浸蘸2s，50d后调查其生根率，平均生根条数，平均根长以及生根质量，其结果如表3-5：
由表6可得出，温度设在20-29℃范围内，随着温度的升高，生根率、生根条数、根长均呈现先上升后下降的趋势，其中温度为26℃时，生根率最高，达到80％，在95％的置信区间与20℃和29℃差异显著，生根条数为3.9条，平均根长为2.93cm。温度超过26℃时，生根率、生根条数、根长逐渐降低，29℃时各项指标达到最低，分别为35％，2.97条，1.98cm。对反应生根质量的综合指标(Q)进行分析，数据分析结果表明，在95％的置信区间，23℃与26℃的Q值差异不显著，与其他两个处理差异显著。所以，可得出，最适宜美登组培苗微扦插生根的温度为23-26℃。
表6不同温度对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000102
2.1.4不同基质对蓝莓组培苗扦插生根的影响
研究不同基质对蓝莓组培苗扦插生根的影响，以长势一致的美登组培苗为试材，选取5种不同的基质进行处理，其它条件保持一致，50d后调查其生根率，平均生根条数，平均根长以及生根质量，其结果如表7：
通过表7可得出，苔藓为基质，美登组培苗扦插生根率最高，为78％，在95％置信区间与其他几个处理差异显著，扦插生根率最低基质为草炭土，39％；从平均生根条数方面来看，几组处理间差异不显著(95％的置信区间)；就平均根长可以看出，苔藓作为扦插基质效果最佳，为3.18cm；综合三个指标，对反应生根质量综合指标的生根指数(Q)进行分析，结果表明以苔藓为基质的扦插生根质量最好，与其他4个处理差异显著(95％的置信区间)，综上所述，最适合美登组培苗扦插生根的基质为苔藓。
表7不同基质对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000111
2.1.5不同部位对蓝莓组培苗扦插生根的影响
调查不同部位对蓝莓组培苗扦插生根的影响，选取长势一致的美登组培苗为试材，将其分为上段、中段和下段，分别在1500mg/L IBA中浸蘸2s，扦插到苔藓中，50d后调查其生根率，平均生根条数，平均根长，生根质量(Q)，结果如表3-7：
由表8可以得出，不同部位间的美登组培苗扦插生根效果不同，组培苗的下段生根率最高，达69％，数据分析结果表明，在95％的置信区间与下段扦插生根率有明显差异，而与中段扦插生根率无明显差别；生根条数最多的为中段，4.10条，与其他两个处理差异不显著；综上所述，取美登组培苗的中段和下段扦插生根效果最佳。
表8不同部位处理对蓝莓组培苗扦插生根的影响
Figure BDA0001569361700000112
Figure BDA0001569361700000121
实施例2蓝莓扦插生根过程中形态解剖学研究
以蓝莓美登组培苗为试验材料，对其扦插不定根发育过程中外部形态的变化以及生根解剖学进行研究。
1蓝莓美登组培苗扦插繁殖方法
采用实施例1建立的最优技术方案进行，具体包括以下步骤：
(1)将采集的蓝莓美登1年生枝条用水培法促使腋芽萌发，当腋芽萌发并长至2cm时剪下，用75v/v％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次后转入0.1w/w％HgCl2溶液中，消毒8min，最后用重蒸馏水冲洗5次，消毒后放入超净工作台中，接到初代培养基中；
(2)在培养室温度为24-26℃，湿度70％-80％，光强2000lx，光照周期12h/d的条件下进行蓝莓组培苗的初代培养和继代培养；蓝莓美登初代培养和继代培养所采用的培养基均为含有2.0g/L ZT，20mg/L蔗糖以及7g/L琼脂的WPM培养基，pH 5.1；
(3)取经继代培养后的组培苗进行炼苗：将经继代培养后的蓝莓美登组培苗放入有自然光照的无菌室内，放置3d后将其移入温室，4d后将未染菌的组培苗的瓶口逐渐打开，准备扦插；
(4)用镊子将炼好的组培苗从瓶中取出，放入清水中，将粘带的培养基洗干净，用剪刀将其底端的木质化部分和顶端生长弱的部分剪掉，留下生长较旺盛的茎段，剪成5cm的茎段，茎段在1500mg/L的IBA溶液中浸蘸2s，清水处理作为对照，扦插所采用的苗床为铺有苔藓的穴盘(干苔藓用清水洗三遍后放入稀释800倍的多菌灵液中，浸泡12h，捞出甩干后平铺在穴盘里)，每个处理扦插100个茎段；
(5)组培苗扦插完后立即放入小拱棚里保温，定时浇水，前10d，控制拱棚内的空气湿度为95％-100％，温度控制在23-26℃，2周后，空气湿度保持在85％-90％之间，温度控制在23-26℃，扦插20d后，每周喷施1次1/2倍的大量元素培养液和杀菌剂。
2切片制作
用石蜡切片法制作切片，显微镜观察、拍照。
3结果
3.1扦插生根动态分析
从扦插当天起，进行根外部形态观察，每隔4d观察一次，记录插穗基部开始凸起的时间(d)、不定根开始出现的时间(d)和大量不定根生成的时间(d)；进行解剖学观察时，从扦插当日起到不定根发生时，每隔4d取一次样，取插穗基部的茎段，约2cm，用FAA固定。试验结果如表9：
表9插穗生根动态
Figure BDA0001569361700000131
由表9可知，插穗经外源激素处理后，生根时间明显短于对照。对照在24d后插穗基部逐渐出现凸起，32d后逐渐形成不定根，48d后大量不定根生成。1500mg/L的IBA处理的插穗，16d后基部逐渐出现凸起，不定根开始发生时间与大量不定根生成的时间分别为24d和33d。不定根开始形成时间比对照早8d，大量不定根生成比对照早12d。生根图见图1-图3。
3.2扦插生根解剖学研究
从美登茎横切面图上看，茎主要由周皮，皮层，韧皮部，木质部，髓组成。周皮细胞呈近长方形，排列紧密，是一种保护组织，位于横切面最外层。近周皮的组织为皮层，细胞呈圆形，排列较疏松，细胞间间距较大，细胞内含有丰富的贮藏物质。皮层以里为维管组织，其中包含韧皮部、木质部和髓。韧皮部细胞排列紧密。木质部主要由木纤维和导管等组织组成。髓由许多薄壁细胞组成，排列紧密，无间隙。扦插前茎的横切面未见根原基的存在，由此可以说明美登不具有潜伏根原基，其不定根的发育属于诱导型。
对美登诱导生根插穗进行解剖发现，在扦插前，插穗具有完整的解剖结构，如图4a所示；在扦插后10d发现，木质部细胞发生明显变化，细胞体积变大，数量增多，并且向外分裂生长，如图4b所示；随着细胞的不断分裂，在木质部处形成近圆形的细胞团，这个细胞团就是根原基细胞，如图4c所示；这些细胞不断分裂，根原基继续伸长，最终突破皮层向外生长，如图4d。在整个生根过程中，激素处理的插穗在12d时根原基初步形成，24d时根原基突破周皮，而对照在19d时根原基才初步形成，比处理晚了7d，说明激素处理加快了根原基的形成。

Claims (2)

1.一种利用蓝莓组培苗进行扦插繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将采集的蓝莓1年生枝条用水培法促使腋芽萌发，当腋芽萌发并长至1.5-2.5cm时剪下，消毒后放入超净工作台中，接到初代培养基中；所述的蓝莓品种为美登；
(2)在培养室温度为24-26℃，湿度70％-80％，光强2000lx，光照周期12h/d的条件下进行蓝莓组培苗的初代培养和继代培养；初代培养和继代培养所采用的培养基均为含有2.0g/L ZT，20mg/L蔗糖以及7g/L琼脂的WPM培养基，pH 5.1；
(3)取经继代培养后的组培苗进行炼苗；所述的炼苗是将经继代培养后的组培苗放入有自然光照的无菌室内，放置3d后将其移入温室，4d后将未染菌的组培苗的瓶口逐渐打开，准备扦插；
(4)用镊子将炼好的组培苗从瓶中取出，放入清水中，将粘带的培养基洗干净，用剪刀将其底端的木质化部分和顶端生长弱的部分剪掉，留下生长较旺盛的茎段，剪成4.5-5.5cm的茎段，选择组培苗的中段和下段浸蘸生根液后进行扦插，扦插所采用的苗床为铺有苔藓的穴盘；苗床按照以下方法制备：干苔藓用清水洗三遍后放入稀释800倍的多菌灵液中，浸泡12h，捞出甩干后平铺在穴盘里；所述的生根液为1500mg/L的IBA溶液；
(5)组培苗扦插完后立即放入小拱棚里保温，定时浇水，前10d，控制拱棚内的空气湿度为95％-100％，温度控制在23-26℃，2周后，空气湿度保持在85％-90％之间，温度控制在23-26℃，扦插20d后，每周喷施1次1/2倍的大量元素培养液和杀菌剂，所述的1/2倍的大量元素培养液中含有NH4NO3 825mg/L、KNO3950 mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L以及KH2PO4 85mg/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒是用75v/v％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次后转入0.1w/w％HgCl2溶液中，消毒8min，最后用重蒸馏水冲洗5次。
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