CN108283630A - 和厚朴酚在血管性痴呆药物中的应用 - Google Patents

Abstract

和厚朴酚在血管性痴呆药物中的应用。本发明属于中药技术领域，涉及和厚朴酚在治疗血管性痴呆中的应用，本发明动物试验验证，和厚朴酚脂质体可以显著性提高血管性痴呆大鼠的学习记忆能力，有效降低血管性痴呆大鼠脑中MDA的含量，升高SOD和GSH‑Px含量，降低血性管痴呆模型大鼠脑组织中AChE活力，下调血清中的TC，TG，LDL‑C含量，上调HDL‑C含量改善血脂情况。另外，和厚朴酚可以明显升高血管性痴呆大鼠脑组织中NE、DA、5‑HT、5‑HIAA的含量，提高学习记忆功能。

Description

和厚朴酚在血管性痴呆药物中的应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，涉及和厚朴酚在治疗血管性痴呆中的应用。

背景技术

随着经济的发展和人均寿命的延长，痴呆成为一项备受关注的公共卫生问题。血管性痴呆（vascular dementia，VD）是痴呆的重要类型，指各种脑血管病引起的获得性认知障碍，也是血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment，VCI）的严重阶段。血管性痴呆的病因尚未完全明确，有望通过早期预防和干预降低疾病的残障情况，但目前还需积极开展针对病患的药物治疗。血管性痴呆是由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的一种获得性智能损害综合征，是一种慢性的进行性疾病。其临床表现除神经系统定位损害的症状和体征外，尚有系列异常的神经心理症状和精神行为，已成为继阿尔茨海默病后的第二大痴呆疾病。中国作为世界上人口最多的国家，受社会、经济和人口政策等因素的影响，其老龄化的速度比西方发达国家更快。2010 年第六次人口普查结果表明，我国60岁以上人口已达13.3%（一亿八千万）。伴随着快速老年化，疾病模式的变迁将导致我国面临慢性非传染病和新发、再发传染病的双重挑战。毫无疑问，痴呆作为常见的神经性的障碍性疾病，其发病和患病将随着快速的人口老龄化而逐渐增加。国外有研究发现，痴呆造成的社会经济负担已经超过癌症以及心脑血管疾病的总和。各方面的迹象均表明痴呆将逐渐成为一个重要的公共卫生问题，也会影响整个社会卫生资源配置和相关的卫生政策制定。血管性痴呆发病渐有上升趋势，这不仅严重影响患者的生存质量，也给病患家属，社会及国家增添了沉重的负荷。据国外资料报道，血管性痴呆是迄今为止唯一可采用药物进行积极防治的痴呆，如早期治疗会具有可逆性。因此探索血管性痴呆发病的相关因素及发病机制，以期寻求早诊断，早预防，早治疗的有效措施，已成为医学基础研究和临床研究的重要课题。

本研究开展的和厚朴酚对各种血管性痴呆动物模型的作用影响可以有效地证明和厚朴酚的治疗作用相关机理和分子机制，对血管性痴呆的综合性治疗以及和厚朴酚制剂的开发均具有一定的积极意义。

发明内容

为了丰富治疗血管性痴呆的中药药物，本发明提供了和厚朴酚在治疗血管性痴呆的药物中的应用。本发明所述和厚朴酚提取于中药厚朴，本发明所述药物是指以和厚朴酚为主要活性成分，与可药用载体制成的医疗上可接受的制剂，如冻干脂质体、片剂、丸剂或胶囊剂等。

通过运用和厚朴酚脂质体治疗高血压伴有高血脂的双侧颈总动脉阻断和4-血管阻断法制备的血管性痴呆大鼠模型，本实验得出了和厚朴酚注射用冻干脂质体对血管性痴呆具有较好的治疗效果。其中和厚朴酚脂质体针对高血压伴有高血脂的双侧颈总动脉阻断大鼠血管性痴呆造模后的病态行为学起到了重要的改善作用。和厚朴酚可以显著性提高血管性痴呆所致的记忆获得障碍大鼠的学习记忆能力。和厚朴酚对脑神经具有一定的保护作用，可有效降低血管性痴呆大鼠脑中MDA的含量，可以升高血管性痴呆大鼠脑组织中的SOD和GSH-Px含量，降低血性管痴呆模型大鼠脑组织中AChE活力，并通过下调血清中的TC，TG，LDL-C含量，上调HDL-C含量改善血脂情况。

本项目同时考察了和厚朴酚脂质体针对4-血管阻断法制备的血管性痴呆动物模型的治疗效果和作用机理，发现和厚朴酚脂质体能够较好改善血管性痴呆动物模型的智力状况，和厚朴酚可以明显升高血管性痴呆大鼠脑组织中NE、DA、5-HT、5-HIAA的含量，提高学习记忆功能。和厚朴酚脂质体用药后的大鼠海马CA1区椎体细胞层结构排列相对较为规整，层次相对较为丰富，使用和厚朴酚后明显降低了发病动物模型脑组织中神经元细胞出现核固缩深染，退化变性坏死以及脱失现象出现的频率。通过荧光定量PCR技术，推断和厚朴酚脂质体治疗血管性痴呆疾病的分子机制可能是通过抑制Bax基因表达，上调Bcl-2基因表达从而抑制神经元细胞凋亡，抑制血管性痴呆的发生发展。

和厚朴酚对大鼠行为学的影响，定位航行实验12次的定位航行训练中：与阴性空白对照组比较，阳性空白对照组逃避潜伏期第2-12次显著延长（P<0.05）。与阳性空白对照组比较，和厚朴酚注射用冻干脂质体高剂量组第3-12次显著缩短（P<0.05），中剂量组第5-12次显著缩短（P<0.05），低剂量组第8-12次显著缩短（P<0.05），阳性给药组逃避潜伏期第6-12次显著缩短（P<0.05 或 P<0.01）。和厚朴酚和阳性药对照组均能改善高血压高血脂的血管性痴呆大鼠动物模型的学习记忆能力。

和厚朴酚对大鼠行为学的影响，空间探索实验。和厚朴酚高剂量组能显著延长高血压高血脂大鼠在原安全台周围10厘米范围内的游泳距离和游泳时间，并显著增加通过安全台的次数（P<0.01）。中低剂量组亦起到了非常好的治疗作用（P<0.05）。

和厚朴酚注射用冻干脂质体对高血压高血脂的血管性痴呆动物模型的乙酰胆碱酯酶活性的影响，和厚朴酚注射用冻干脂质体高、中、低剂量组，阳性药对照组与阳性空白对照组比较能显著升高脑 AChE量（P<0.05）。

和厚朴酚注射用冻干脂质体对高血压伴有高血脂的血管性痴呆动物模型自由基和相关酶学的影响，和厚朴酚制剂组和阳性药物组都产生了较好的药物效果，使MDA含量大幅下降，与阴性空白组的MDA含量类似，与阳性对照组的MDA有显著性差别（P<0.01）。

和厚朴酚脂质体对血管性痴呆大鼠的SOD含量的影响，和厚朴酚制剂组和阳性药物组都产生了较好的药物效果，使SOD含量大幅上升，与阳性空白模型组的SOD相比有显著性差别（P<0.01）。

和厚朴酚对血管性痴呆大鼠的GSH-Px含量的影响情况。经过和厚朴酚的治疗后，脑内GSH-PX活性显著上升，与阳性空白模型组的SOD相比有显著性差别（P<0.01），这有助于加快对自由基的清除，可能是和厚朴酚减轻脑损伤的药理学机理之一。

和厚朴酚对高血压高血脂的血管性痴呆动物模型血脂含量的影响。给予和厚朴酚和阳性药干预后，血清中的TC，TG，LDL-C 含量有所降低，HDL-C 的量有所增加，与高血脂模型组比较有显著性差异（P<0.01），中剂量组和低剂量组和厚朴酚脂质体组的血清中的TC，TG，LDLC含量有所降低，HDL-C 的量也有所增加，与高血脂模型组比较有差异（P<0.05）。

和厚朴酚对4-阻断血管性痴呆动物模型的脑组织中去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）的影响，和厚朴酚与阳性药对照组可明显升高血管性痴呆大鼠脑组织中NE、DA含量，且与阳性药组和阳性空白对照组具有显著的统计学差异（P<0.05）。

和厚朴酚对4-阻断血管性痴呆动物模型的脑组织中5-羟色胺（5 -HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的影响，和厚朴酚和阳性药对照组可升高血管性痴呆大鼠脑组织中5-HT、5-HIAA含量，高剂量组在升高这两项含量时，与阳性药组对比具有显著性差异（P<0.05）。

和厚朴酚对4-阻断血管性痴呆动物模型的脑组织中海马CA1区病理形态学的影响，和厚朴酚治疗组的高剂量组，中剂量组和阳性药物组（美金刚）大鼠海马CA1 区椎体细胞层结构排列规整，层次丰富，锥体神经细胞核圆形，核膜清楚，有核仁。模型组即阳性空白组大鼠海马CA1 区锥体细胞层次断裂紊乱，大量细胞核固缩、深染，退化变性、坏死，神经细胞有脱失现象。

和厚朴酚对血管性痴呆动物模型的分子机制研究，使用了和厚朴酚治疗后，Bax的mRNA的表达较模型组偏低（P<0.05），而Bcl-2的mRNA的表达较模型组偏高（P<0.05）。其中高剂量组相对于阳性药组的Bax偏高，Bcl-2偏低具有显著性差别（P<0.05）。

实施例一：和厚朴酚脂质体对高血压伴有高血脂的双侧颈总动脉阻断法制备的血管性痴呆动物模型的治疗效果评价和作用机理研究。

（一）实验动物

本实验应该选用成熟的健康大鼠（吉林大学实验动物中心提供）。鼠笼内要求数目合理，选用灭菌后的锯末做垫层，选用营养丰富颗粒饲料以及高温高压灭菌纯净水喂养，鼠笼所置的房间湿度50%左右，温度保持20℃左右通风换气良好。动物饲养按照吉林大学动物饲养的相关规定和章程进行饲养。实验的各项操作条件需遵循吉林大学实验动物中心的相关规定执行。

（二）主要需要的实验药物

和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液，北京大学药学院提供；美金刚灌胃水溶液，吉林大学药学院购买并配置提供。

（三）主要实验仪器与主要实验试剂

动物手术台 吉林大学药学院

AB104-N 型电子天平 美国Mettler-Toledo Group

Olympus BX-40显微镜 日本 Olympus

液氮罐 CMR8031 美国Thermo公司

-80℃超低温冰箱 日本三洋公司

高速冷冻离心机 美国 BECKMEN 公司

721分光光度计 Bio－Photometer，Epentoff公司

可调式移液器套 德国Ependorf Research plus公司

Morris 水迷宫 吉林大学药学院

10%水合氯醛溶液 吉林大学药学院

0.9%氯化钠注射液 吉林大学药学院

总胆固醇( TC) 试剂盒，甘油三酯( TG)试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇( HDL-C) ，低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C ) 试剂盒，超氧化歧化酶（SOD）检测试剂盒，丙二醛（MDA）检测试剂盒，乙酰胆碱酯酶(AChE)检测试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒，RNA试剂盒，RT-PCR试剂盒均购自美国西格玛公司，重复验证实验用南京建成生物工程研究所产品。

（四）高血压伴有高血脂双侧颈总动脉阻断法血管性痴呆大鼠模型的制备

先用高脂饲料（由普通饲料78%，胆固醇1%，牛胆盐1%，蛋黄粉10%，油10%组成）喂养大鼠4周制备高脂血症大鼠模型，经鼠尾静脉采血确定大鼠体内血脂水平已升高（三酰甘油3mmol/L）以后，再用传统双侧颈总动脉阻断法造模，制成高脂高血压的血管痴呆模型。具体做法为分离出大鼠双侧颈总动脉后将其永久性结扎，待高血压高血脂模型成型后，开始进行双侧颈总动脉阻断。选取尼龙鱼线（0.28mm/单股），固定长度做标记，断端平齐钝圆后蘸取热融的石蜡使其光滑呈球型，放入百分之七十五的酒精溶液浸泡十分钟，然后转置于浸入百分之一的肝素中备用。各个大鼠造模前应停止进食八小时，但可以饮水。将大鼠称重后按0.06mL腹腔注入10%水合氯醛溶液，麻醉成功后将大鼠四肢绑定在手术台上，使其呈仰卧位，并使用碘伏消毒，将其沿着颈正中切口，逐层切开直至气管，在气管旁边找到颈总动脉，用玻璃分针将颈总动脉与周围细小的神经组织分离开，用手术线双重结扎动脉血管近心端及远心端两侧，并于结扎点的中段剪断，冲洗切口，隔周进行另一侧实验，制备双侧颈总动脉血管性痴呆模型。

（五）造模后动物分组及给药情况

逐层缝合颈部肌肉和皮肤后，在大鼠腿部肌注庆大霉素注射液0.30mL，用以术后抗炎治疗。A组作为高剂量给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，尾部静脉注射和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液（给药量150ug/kg，以和厚朴酚含量计算）。B组作为中剂量给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，尾部静脉注射和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液（给药量30ug/kg，以和厚朴酚含量计算）。C组作为低剂量给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，取尾部静脉注射和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液（给药量6ug/kg，以和厚朴酚含量计算）。A（High dose group），B（Middle dose group），C（Low dose group）三组给药为每天注射给药，一直给药到实验结束。D组（Control group）作为阴性空白对照组，取健康的大鼠即可。E组（Model group）作为阳性空白对照组，给予双侧颈总动脉结扎模型制备，但不给予药物治疗。F组（Positive group）作为阳性给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，采用灌胃的给药方式给予美金刚水溶液2mL（给药量5mg/kg，以美金刚含量计算，溶于羧甲基纤维素钠溶液中给药），每日上午灌胃给药，一直给药到实验结束。每组27-30只大鼠，饲养过程精心细致，确保每组至试验结束时最少25只大鼠，单项药效学实验评价时，采集样本最少为15只。

（六）和厚朴酚脂质体药效学实验检测分析

以上各组大鼠给药完毕后均分类放回笼子中，然后进行常规的饮食饮水。大鼠造模并且给药后，将其分类放回笼子中，饲养14天，期间进行正常的饮食饮水，14天后进行行为学检测，行为学检测后将其处死，处死前20min进行神经缺损评分，评分后马上取出脑组织，在冰浴上分离出海马区，左侧进行相关生化检测和荧光定量PCR分析，剩余放入液氮中冷冻保存以备重复检测。

1、大鼠行为学检测（Morris水迷宫实验）

1.1、定位航行实验

在给药的第7天，进行水迷宫训练。由深 70厘米，半径为60厘米的白色圆桶组成，里面设有视频和定位追踪器组成了这样一个水迷宫装置。在池边任取一点入水，作为第一象限放入平台。圆桶里面注入高出平台约 2cm的水。倒入奶粉使水呈乳白色。将平台对侧半圆均分为5点，将大鼠从任一点面向池壁放入水中，记录一分半钟内大鼠的逃避潜伏期，即从入水到爬上平台所需的时间。允许大鼠在一分半钟找到平台。每只大鼠上午、下午各训练一次，连续五天。记录每次训练大鼠找到安全台的逃避潜伏期。训练期间，尽量避免人为因素的发生，实验者将大鼠放入实验平台后应立即撤离，并且标记迷宫周围的参照物并保持其不变。共记录12次。各组大鼠的逃避潜伏期随游泳训练次数的增加而不断下降，需要的时间越来越少，可知各组大鼠经过一些时间的游泳训练对于寻找平台均有一定的学习记忆能力，但组间的学习记忆能力具有很大差异。12次的定位航行训练中：与阴性空白对照组比较，阳性空白对照组逃避潜伏期第2-12次显著延长（P<0.05）。与阳性空白对照组比较，和厚朴酚注射用冻干脂质体高剂量组第3-12次显著缩短（P<0.05），中剂量组第5-12次显著缩短（P<0.05），低剂量组第8-12次显著缩短（P<0.05），阳性给药组逃避潜伏期第6-12次显著缩短（P<0.05 或 P<0.01）。提示和厚朴酚注射用冻干脂质体和阳性药对照组均能改善高血压高血脂的血管性痴呆大鼠动物模型的学习记忆能力。

附图说明图1 和厚朴酚脂质体治疗后大鼠在定位航行实验中的结果

1.2、空间探索实验

在完成最后一次定位航行试验结束后，撤除实验用的定位航行平台，进行空间探索实验。仍将大鼠从原平台对侧半圆5点内取任一点面向池壁放入水中，记录一分半钟内大鼠经过原平台位置的次数，在原平台位置周围10厘米范围内停留的时间和游泳距离。对通过安全平台的次数，有效停留时间，有效停留距离分别进行分析作图。与阴性空白对照组比较，阳性空白对照组大鼠在原安全台周围10厘米范围内的游泳距离和游泳时间显著缩短，通过安全台次数显著减少（P<0.05），显示了造模成功地模拟了关于上述指标的病症表现。通过和厚朴酚脂质体的治疗后，可见治疗组有比较好的治疗效果，其中和厚朴酚注射用冻干脂质体高剂量组能显著延长高血压高血脂大鼠在原安全台周围10厘米范围内的游泳距离和游泳时间，并显著增加通过安全台的次数（P<0.01）。中低剂量组亦起到了非常好的治疗作用（P<0.05）。

附图说明：图2：大鼠通过安全平台的次数

图3：大鼠在安全台的有效停留时间

图4：大鼠的有效停留距离

2、和厚朴酚脂质体治疗后各组大鼠神经缺陷评分

各组大鼠于行为学检测后，在处死前20分钟根据神经功能缺陷评分法分别从运动表现、脑干的作用、感觉评估、运动行为学等方面进行神经功能评分，评分范围为0-100分。0分为脑基本死亡，85分以上基本正常。5项主要测试实验如下，每项20分：

A平衡木测试：将大鼠放在木棍上行走，离地面高半米，宽2cm，长1m。观察大鼠是否能独立行走判断其平衡能力。

B正位反射：将大鼠背部接触地面。观察大鼠能否自行翻身进行评估。

C转身测试：隔离出一段半米的胡同，让大鼠在里行走。观察大鼠是否会自动转向而对胡同进行评估。

D视觉配合：使鼠尾吊起，测定大鼠视觉定位功能。

E拒地趋向反射：将大鼠背靠一倾斜45°的斜面，观察大鼠是否能够自行纠正并向上移动进行判断。

附图说明：图5：和厚朴酚脂质体在高血压高血脂的血管性痴呆大鼠模型中神经学评分情况

3、和厚朴酚注射用冻干脂质体对高血压高血脂的血管性痴呆动物模型的乙酰胆碱酯酶活性的影响。在针对大鼠的行为学实验结束后，将大鼠的海马组织进行乙酸胆碱酯酶AChE的活性检测实验。将完成行为学实验以及神经学评分后的每组余下的部分大鼠中随机取出进行实验，将其断头、取脑，分离海马组织。具体操作步骤：各组大鼠模型用10%的水合氯醛2mL腹腔注射使大鼠麻醉。将大鼠的枕骨处用组织剪将其皮肤、椎骨及其组织剪断，然后剪开顶骨，将剪刀斜插入枕骨大孔处，将两侧顶骨用止血钳剥离出来，使止血钳深入颅底，然后将其视神经（脑组织底部）离断，在冰浴上分离出大鼠的脑干和小脑并剔除，分离两侧海马，用于做病理切片和生物化学检测。部分留存海马放入无菌 PVC 管并浸入液氮速冻保存，统一转移至零下80℃冰箱保存，部分海马浸泡于10%的福尔马林溶液中保存用于病理检测。要求整个过程熟练迅速。用于生物化学检测部分的海马于4℃生理盐水冲洗残留血液，分析天平称重，加入9倍体积的预冷生理盐水，组织匀浆器匀浆，制备10%的海马组织匀浆液，3500r/min离心15 min并取上清液备用。按所购买的试剂盒说明书测定AChE活性。AChE水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力。在测定管中加入样本40ul，在标准管中加入1umol/mL标准应用液40ul，在标准空白管加入双蒸水40ul，然后在各管中依次加入底物缓冲液0.5mL，显色应用液0.5mL。混匀后37℃准确反应6min。然后在各管中依次加入抑制剂0.03mL，透明剂0.1mL，稳定剂0.05mL。最后在测定空白管中加入样本40ul。混匀放置15min，722光栅分光光度剂于412nm处，0.5cm光径，通过水调零比色。每毫克组织蛋白样本在37℃保温6分钟，水解反应体系中1umol基质为1个活力单位。公式为(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)X标准品浓度/蛋白含量。与阴性空白对照组比较，阳性空白对照组脑 AChE含量明显减少（P<0.05），和厚朴酚注射用冻干脂质体高、中、低剂量组，阳性药对照组与阳性空白对照组比较能显著升高脑AChE量（P<0.05）。我们的研究结果显示，大鼠出现血管性痴呆损伤迹象后，学习记忆能力显著下降，同时AChE活性显著上升，经过和厚朴酚治疗后，学习记忆能力改善，同时AChE的活力显著下降。目前己有研究证明，血管性痴呆发生后，海马、纹状体、丘脑等脑区中ACh含量下降。因此我们认为，抑制AChE活性，减少ACh的降解，维持中枢胆碱能系统的正常功能，可能是和厚朴酚改善血管性痴呆病人记忆、思维和智力水平的药理学基础之一。提示和厚朴酚注射用冻干脂质体能影响胆碱能神经活力，从而起到保护神经的作用。

附图说明：图6和厚朴酚脂质体在高血压高血脂的血管性痴呆大鼠模型中影响乙酰胆碱酶活性的情况

4、和厚朴酚注射用冻干脂质体对高血压伴有高血脂的血管性痴呆动物模型自由基和相关酶学的影响。针对MDA含量的测定，主要通过过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥(TBA)结合，形成红色产物，在530nm处有最大吸收峰。

将标准管中加入0.1mL标准品，标准空白管中加入0.1mL无水乙醇，测定管和测定空白管中加入0.1mL测试样品。然后四管中分别加入测试试剂，除测定空白管加入1mL的50%冰醋酸外，其余三管分别加入测试试剂1mL混匀。试管口用保鲜膜扎紧刺一小孔，95度水浴40min，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10min。取上清液在530nm处测定吸光度值。组织中MDA含量(nmol/mgprot)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度) X标准品浓度(10nmol/mL)X样本稀释前浓度/(标准管吸光度-标准空白管吸光度) X蛋白含量(mgprot/mL)。和厚朴酚脂质体制剂组和阳性药物组都产生了较好的药物效果，使MDA含量大幅下降，与阴性空白组的MDA含量类似，与阳性对照组的MDA有显著性差别（P<0.01）。

附图说明：图7和厚朴酚脂质体对血管性痴呆大鼠模型的MDA含量的影响情况

针对SOD含量的测定，主要通过黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，测定的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。测定管和对照管各加1mL试剂，测定管加50ul样品，测定管加0.5mL蒸馏水，对照管加0.5mL蒸馏水，然后两管分别再加测试试剂，用分析振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴40min。最后两管分别加入2mL显色剂，混匀10min后倒入1cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550nm处比色。和厚朴酚脂质体制剂组和阳性药物组都产生了较好的药物效果，使SOD含量大幅上升，与阳性空白模型组的SOD相比有显著性差别（P<0.01）。

附图说明：图8为和厚朴酚脂质体对血管性痴呆大鼠的SOD含量的影响情况。

针对谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的测定，主要是GSH-Px为机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。NADPH的减少量则和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。GSH-Px主要包括4种：分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px酶系能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H₂O₂的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。和厚朴酚脂质体治疗高血压伴有高血脂的大鼠血管性痴呆模型后，与氧化自由基相关的分子酶学指标显现了和厚朴酚脂质体具有非常好的治疗作用。自由基连锁反应是导致血管细性痴呆病情加重的重要原因之一。在正常生理条件下，体内自由基的产生和清除处于生理性低水平的平衡状态，但在大脑遭受高血压高血脂的血管性损伤时，自由基生成增多，且自由基清除酶活性降低，动态平衡遭到破坏，自由基连锁反应发生，引发膜的脂质过氧化反应，造成组织损伤进一步恶化。SOD和GSH-PX是机体内广泛存在的两种自由基清除剂，在组织中的水平常作为清除自由基能力的主要指标，它们可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。实验研究结果表明，造成高血压高血脂的血管性损伤后，自由基清除能力下降，可能导致脑内自由基增多。经过和厚朴酚脂质体的治疗后，脑内SOD，GSH-PX活性显著上升，这有助于加快对自由基的清除，可能是和厚朴酚减轻脑损伤的药理学机理之一。

附图说明：图9为和厚朴酚脂质体对血管性痴呆大鼠的GSH-Px含量的影响情况。

5、和厚朴酚注射用冻干脂质体对高血压高血脂的血管性痴呆动物模型血脂含量的影响。在治疗结束时，禁食12小时后将所有大鼠静脉采血，血样在3000 rpm/min条件下离心10min，分离血清，检测血脂主要指标。血清总胆固醇( TC) 的检验方法为酶法，高密度脂蛋白( HDL-C) 和低密度脂蛋白( LDLC)的检验方法为直接一步法，这三项血脂生化指标均由吉林大学药学院全自动生化分析仪进行测定。高血脂模型组大鼠血清中的TC，TG，LDL-C含量明显增加，而HDL-C的含量明显降低，与正常组大鼠比较有显著差异（P<0.01）；给予和厚朴酚脂质体和阳性药干预后，血清中的TC，TG，LDL-C 含量有所降低，HDL-C 的量有所增加，与高血脂模型组比较有显著性差异（P<0.01），中剂量组和低剂量组和厚朴酚脂质体组的血清中的TC，TG，LDLC含量有所降低，HDL-C 的量也有所增加，与高血脂模型组比较有差异（P<0.05）。目前，关于和厚朴酚对心血管系统的保护作用、抗血栓作用等报道较多，而对和厚朴酚脂质体针对高血脂作用的研究鲜有报道。本研究在采用高血脂伴有高血压血管性痴呆大鼠模型的治疗试验后，检测和厚朴酚脂质体对高血脂的治疗作用以及和厚朴酚的降血脂作用，为开发应用和厚朴酚脂质体提供可靠的实验依据，对未来应用和厚朴酚脂质体在高血脂型血管性痴呆疾病时提供更多的研究基础。

附图说明：图10高血压伴有高血脂的大鼠血管性痴呆动物模型在和厚朴酚脂质体治疗后血脂各项考察指标情况

6、和厚朴酚注射用冻干脂质体治疗高血压伴有高血脂双侧颈总动脉阻断法制备的血管性痴呆动物模型的分子机制研究

将大鼠脑海马组织样本用RNA试剂盒提取总RNA。引物序列如下：

①Bcl- 2基因引物序列: forward，5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′；reverse，5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG- 3′。

②Bax基因引物序列: forward，5′-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG- 3′；reverse，5′-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAAC- A- 3′。

逆转录反应在PCR扩增仪上按反转录试剂说明书进行cDNA的合成，反应参数为：反转录反应42度15min，反转录酶的失活反应95度2 min。PCR反应采用 SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）kit 试剂，在荧光定量PCR仪上进行 PCR反应，考察Bcl-2和Bax的基因表达量，通过考察Bax和Bcl-2的mRNA的表达情况，判断和厚朴酚对神经细胞的保护作用。结果显示使用了和厚朴酚脂质体治疗后，Bax的mRNA的表达较模型组偏低（P<0.05），而Bcl-2的mRNA的表达较模型组偏高（P<0.05）。其中高剂量组相对于阳性药组的Bax偏高，Bcl-2偏低具有显著性差别（P<0.05）。推断和厚朴酚脂质体高剂量组具有更好的治疗效果，其治疗高血压高血脂血管性痴呆疾病的分子机制可能是通过抑制Bax基因表达，上调Bcl-2基因表达抑制神经元细胞凋亡，抑制血管性痴呆的发生发展。

附图说明：图11和厚朴酚脂质体治疗高血压高血脂血管性痴呆后，Bax与Bcl-2基因的表达情况分析（高血压高血脂2-血管阻断法造模）

实施例二：和厚朴酚脂质体对4-血管阻断法制备的血管性痴呆模型的治疗效果评价和作用机理研究。

（一）实验动物

本实验应该选用成熟的，健康大鼠（吉林大学实验动物中心提供）。鼠笼内要求数目合理，选用锯末做垫层，选用全价营养颗粒饲料及高压高温灭菌消毒水喂养，鼠笼所置的房间湿度50%左右，温度保持23℃左右通风换气良好。实验的各项操作条件需遵循吉林大学实验动物中心的相关规定执行。

（二）主要需要的实验药物

和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液，北京大学药学院提供；美金刚灌胃水溶液，吉林大学药学院购买并配置提供。

（三）主要实验仪器与实验试剂

动物手术台 吉林大学药学院

AB104-N 型电子天平 美国Mettler-Toledo Group

Olympus BX-40显微镜 日本 Olympus

BMJ－Ⅲ包埋机 江苏常州中威生物机械制造有限公司

恒冷箱切片机 德国莱卡公司

Shandon pathcentre脱水机 英国Shandon公司

电泳仪系统 美国 BIO-RAD 公司

液氮罐 CMR8031 美国Thermo公司

-80℃超低温冰箱 日本三洋公司

高速冷冻离心机 美国 BECKMEN 公司

721分光光度计 Bio－Photometer，Epentoff公司

可调式移液器套 德国Ependorf Research plus公司

10%水合氯醛溶液 吉林大学药学院

0.9%氯化钠注射液 吉林大学药学院

8万单位庆大霉素注射液 吉林大学药学院

肾上腺素检测试剂盒，多巴胺检测试剂盒，5-羟色胺检测试剂盒，5-羟吲哚乙酸含量检测试剂盒，RT-PCR试剂盒均购自美国西格玛公司。

（四）4-血管阻断法制备的血管性痴呆大鼠模型的制备

本项目组在传统的4-血管阻断法基础上进行改良，用直径不到1mm的电凝针灼烧双侧翼小孔内的椎动脉，使之永久性闭塞，再可逆地反复夹闭和再通双侧颈总动脉。改良后的4-血管阻断法避免了分离、结扎大鼠双侧椎动脉，操作更简单，损伤更小。

（五）造模后动物分组及给药情况

4-血管阻断法制备的血管性痴呆模型后，在大鼠腿部肌注庆大霉素注射液0.30mL，用以术后抗炎治疗。A组作为高剂量给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，尾部静脉注射和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液（给药量150ug/kg，以和厚朴酚含量计算）。B组作为中剂量给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，尾部静脉注射和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液（给药量30ug/kg，以和厚朴酚含量计算）。C组作为低剂量给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，取尾部静脉注射和厚朴酚注射用冻干脂质体注射液（给药量6ug/kg，以和厚朴酚含量计算）。A（High dose group），B（Middle dose group），C（Low dose group）三组给药为每天注射给药，一直给药到实验结束。D组（Control group）作为阴性空白对照组，取健康的大鼠即可。E组（Model group）作为阳性空白对照组，给予双侧颈总动脉结扎模型制备，但不给予药物治疗。F组（Positive group）作为阳性给药组，按上述操作给予造模及术后抗炎后，采用灌胃的给药方式给予美金刚水溶液2mL（给药量5mg/kg，以美金刚含量计算，溶于羧甲基纤维素钠溶液中给药），每日上午灌胃给药，一直给药到实验结束。每组27-30只大鼠，饲养过程精心细致，确保每组至试验结束时最少25只大鼠，单项药效学实验评价时，采集样本最少为15只。

（六）和厚朴酚脂质体在4-血管阻断法模型的药效学实验研究

以上各组大鼠给药完毕后均分类放回笼子中，然后进行常规的饮食饮水。大鼠造模并且给药后，将其分类放回笼子中，饲养14天，期间进行正常的饮食饮水，14天后进行行为学检测，行为学检测后将其处死，处死前20min进行神经缺损评分，评分后马上取出脑组织，在冰浴上分离出海马区，左侧进行相关生化检测和荧光定量PCR分析，剩余放入液氮中冷冻保存以备重复检测，右侧放入福尔马林溶液浸泡后行病理切片并进行病理分析。

1、大鼠行为学检测（Morris水迷宫实验）

1.1、定位航行实验

方法同实验一，对通过安全平台的次数，有效停留时间，有效停留距离分别进行分析作图。与阴性空白对照组比较，阳性空白对照组大鼠在原安全台周围10厘米范围内的游泳距离和游泳时间显著缩短，通过安全台次数显著减少（P<0.05），显示了造模成功地模拟了关于上述指标的病症表现。通过和厚朴酚脂质体的治疗后，可见治疗组有比较好的治疗效果，其中和厚朴酚注射用冻干脂质体高剂量组能显著延长高血压高血脂大鼠在原安全台周围10厘米范围内的游泳距离和游泳时间，并显著增加通过安全台的次数（P<0.05）。证明了和厚朴酚改善行为学和学习记忆功能的特点。

附图说明：图12和厚朴酚脂质体治疗后大鼠在定位航行实验中的结果

图13大鼠通过安全平台的次数

图14大鼠在安全台的有效停留时间（单位：秒）

图15大鼠的有效停留距离（单位：m）

2、和厚朴酚注射用冻干脂质体对4-阻断血管性痴呆动物模型的脑组织中去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）的影响。多巴胺是NA的前体物质，是下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质，中枢神经系统中多巴胺的浓度受精神因素的影响，神经末梢的GnRH和多巴胺间存在着轴突联系并相互作用，以及多巴胺有抑制GnRH分泌的作用。结果见表1。

表1：和厚朴酚注射用冻干脂质体对脑组织中去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）的影响

由上表可以看出，阳性空白对照组与阴性空白对照组比较，脑组织中去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量明显降低，显示造模成功。和厚朴酚注射用冻干脂质体与阳性药对照组可明显升高血管性痴呆大鼠脑组织中NE、DA含量，且与阳性药组和阳性空白对照组具有显著的统计学差异（P<0.05）。

3、和厚朴酚注射用冻干脂质体对4-阻断血管性痴呆动物模型的脑组织中5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的影响。5-HT的检测运用试剂盒即5-羟色胺检测试剂盒检测，其基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性又保留酶的活性。5-HT试剂盒，5-羟色胺检测试剂盒在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。5-羟色胺检测试剂盒此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。5-羟色胺能增强记忆力，并能保护神经元免受“兴奋神经毒素”的损害。因此充足的5-羟色胺确实能在老化过程中防止脑损害发生。正常人体中的5-羟吲哚乙酸是很微量的，而当机体受血管性痴呆损伤及其他长时间痴呆或其他的相关因素刺激时，机体内的细胞异常增殖而引起人体的应激反应，体内的氨基酸代谢异常，导致尿液中5-羟吲哚乙酸的含量异常增高。本试剂与尿液中的5-羟吲哚乙酸混合后将发生特征性的显色反应。结果见表2。

表2：和厚朴酚注射用冻干脂质体对脑组织中5 -HT、5-HIAA的影响

由上表可以看出，阳性空白对照组与阴性空白对照组比较，脑组织中5-HT、5-HIAA含量明显降低。和厚朴酚注射用冻干脂质体和阳性药对照组可升高血管性痴呆大鼠脑组织中5-HT、5-HIAA含量，高剂量组在升高这两项含量时，与阳性药组对比具有显著性差异（P<0.05）。

4、和厚朴酚注射用冻干脂质体对4-阻断血管性痴呆动物模型的脑组织中海马CA1区病理形态学的影响

将事先放入福尔马林溶液中浸泡的海马组织进行取材固定并逐一进行编号。首先脱水透明：使用酒精作为脱水剂，将组织块儿中的水分脱去，然后置于二甲苯透明剂中透明。然后进行浸蜡包埋：将上一步处理好的组织块放在容器中，使用已融化的石蜡将其冷却凝固成块。然后进行切片与贴片：将凝固的蜡块放在切片机上固定，并且把它切成薄片，用加热的水烫平，然后置于载玻片上，用45℃恒温箱将其烘干。然后进行脱蜡：将二甲苯脱去的石蜡经过由高浓度到低浓度的酒精，放入蒸馏水中，准备进行染色。然后进行染色：

①使用苏木精水溶液，将放置于蒸馏水中的切片进行染色数分钟。

②将其放进酸水和氨水中脱色数分钟。

③然后放入蒸馏水中，放入之前用流水反复冲洗一个小时。

④各脱水10分钟，分别加入70％和90％的酒精中。

⑤放入酒精伊红染色液染色2-3分钟。

最后进行脱水透明和封固：将上个步骤已经染色的切片放入酒精中脱水，再经透明剂二甲苯透明。并将中性树胶滴在已风干的切片上，盖上盖玻片封固。将制备好的病理片在显微镜下观察结果并进行分析。和厚朴酚治疗组的高剂量组，中剂量组和阳性药物组（美金刚）大鼠海马CA1 区椎体细胞层结构排列规整，层次丰富，锥体神经细胞核圆形，核膜清楚，有核仁。模型组即阳性空白组大鼠海马CA1 区锥体细胞层次断裂紊乱，大量细胞核固缩、深染，退化变性、坏死，神经细胞有脱失现象。

附图说明：图16 各用药组海马CA1区的病理学形态

5、和厚朴酚注射用冻干脂质体治疗4-血管阻断法制备的血管性痴呆动物模型的分子机制研究

方法同实验一，检测Bax与Bcl-2的基因表达情况，本实验结果表明，无论是高血压高血脂的双侧颈总动脉阻断法还是4-血管阻断法制备动物模型，通过检测大鼠脑组织中Bcl-2基因和Bax基因的表达情况，可以得知和厚朴酚治疗血管性痴呆的分子机制为通过使Bcl-2 mRNA表达较模型组降低（P <0.05），Bax mRNA表达较模型组升高（P <0.05），以此来抑制神经细胞凋亡，恢复神经细胞自身的保护机制，从而发挥抗血管性痴呆的作用。

附图说明：图17和厚朴酚脂质体治疗高血压高血脂血管性痴呆后，Bax基因与Bcl-2基因的表达情况分析。

Claims (4)

1.和厚朴酚在制备用于治疗血管性痴呆药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中痴呆为血管性痴呆。

3.如权利要求1所述的应用，和厚朴酚提取于中药厚朴。

4.一种治疗血管性痴呆的药物，其特征在于其成份中包含和厚朴酚。