CN108244330A - 动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法，结果表明采用本发明的方法可改变乳清蛋白的二级结构、使其巯基二硫键发生了相互转化、表面疏水性显著增大。结构的改变可引起乳清蛋白功能特性的改善。经高压均质处理后，乳清蛋白及其乳液的平均粒径会减小，而溶解性、起泡性、乳化稳定性则显著提高。150MPa的均质处理可以显著提升乳清蛋白功能性，在此压力下乳清蛋白溶解性由63.15%提升至71.61%，乳化稳定性则由195min提升至467min，使其功能性得到改善。动态高压均质技术在乳清蛋白加工领域中具有广阔的应用前景。

Description

动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法。

背景技术

蛋白质是许多食物的主要结构和功能性成分，如肉类、奶酪、蛋清和大部分谷类。现阶段，在食品加工业的发展中，蛋白质被越来越多的运用于食品加工中，如蛋白饮料、膨化食品等，这是因为通过运用基于化学、物理或酶法的不同处理方法，可以对蛋白质进行结构修饰，从而改善蛋白质的功能性质，以满足食品加工的需求。

乳清蛋白(wheyprotein，WP)在牛奶中的含量约为0.7％。分离乳清蛋白(WPI，蛋白含量≥90％)和浓缩乳清蛋白(WPC，蛋白含量60％-85％)作为乳清蛋白中最具代表性的两种产品，因其具有较高的营养价值和优良的加工特性，从而广泛的运用于食品加工业之中。乳清蛋白的主要成分是β－乳球蛋白(56％-60％)﹑α－乳白蛋白(18％-24％)﹑血清白蛋白(6％-12％)和免疫蛋白(6％～12％)以及乳铁蛋白、生长因子和过氧化物酶等活性物质。乳清蛋白不仅是一种优质的完全蛋白质，也是百余种活性多肽的有效肽源。为了满足不同的加工需求，则需要对乳清蛋白进行改性，目前针对乳清蛋白的改性方法较为常见的有酶解、分馏法以及热处理等。

近年来越来越多的学者提出运用非热加工技术有选择性地改变蛋白质的结构和功能特性，从而获得具有特定靶向功能的蛋白质，以满足不同食品加工的需求。非热技术中，超高压均质技术(ultra-highpressurehomogenization，UHPH)引起了学者们相当大的关注，动态超高压均质处理是一种新型的特殊的物理改性手段，它利用物料在高压均质机的反应腔中受到的强烈剪切、高速撞击、剧烈震荡、压力瞬间释放等的动力作用，使生物大分子如蛋白质、淀粉等的结构发生变化，从而导致其功能性质发生一定的改变。这一技术已用于改善花生球蛋白、大豆蛋白和酪蛋白的功能特性。然而动态超高压技术提高乳清蛋白功能特性的应用研究却鲜有报道，本文运用动态超高压均质技术对乳清蛋白进行处理，研究其结构及功能性质的变化，以提高乳清蛋白的功能特性，拓宽其应用领域，为蛋白质水解的预处理提供思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种改变乳清蛋白溶解度、起泡性、乳化性以及热性质等性能的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法，包括以下步骤：用去离子水配制浓度为10mg/mL的乳清蛋白溶液，乳清蛋白溶液在30-40℃水浴锅中保温5min，用无菌均质器中档拍打2min使乳清蛋白分散于去离子水中，用高压均质机进行150MPa流动状态下的超高压均质处理。

优选的，所述高压均质机购自于英国SFP公司，产品型号FPG12805。

本发明产生的有益效果是：动态超高压均质处理对乳清蛋白平均粒度、巯基二硫键、表面疏水性以及二级结构都有一定的影响，从而改变了溶解度、起泡性、乳化性以及热性质等蛋白质的功能性质。研究结果表明，150MPa的动态高压均质处理可显著改善乳清蛋白溶解性、起泡性、乳化稳定性和其他功能性质。即动态高压均质处理可以影响蛋白质结构，改善其功能性质。

附图说明

图1为压力水平对乳清蛋白溶解性的影响；

图2为压力水平对乳清蛋白起泡性和起泡稳定性的影响；

图3为压力水平对乳清蛋白乳化性和乳化稳定性的影响；

图4为压力水平对乳清蛋白乳液平均粒度的影响；

图5为压力水平对乳清蛋白巯基二硫键含量的影响；

图6为压力水平对乳清蛋白表面疏水性的影响。

具体实施方式

2实验材料和方法

2.1试验材料

乳清蛋白购于上海源叶生物科技有限公司；甘氨酸、Tris、DTNB、三氯乙酸、AN、无水乙醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司；β-巯基乙醇购于成都贝斯特试剂有限公司。

2.2试验设备

FPG12805高压均质机：SFP公司；IKAT25基本型高速分散机：德国IKA；ZetasizerNano ZS90：英国马尔文仪器有限公司；Chirascan圆二色谱仪：AppliedPhotophysics Ltd；无菌均质器：宁波新芝生物科技股份有限公司；UNIC 7200：美国尤尼柯；离心机：德国SIGMA；Kjeltec TM8400全自动凯氏定氮仪：FOSS Denmark；电热恒温鼓风干燥箱：上海三发科学技术有限公司；SHA-C数显水浴恒温振荡器：江苏省金坛市华峰仪器有限公司；差热式扫描仪Q200：美国TA公司；Alpha 1-2LDplus真空冷冻干燥仪：德国CHRIST公司。

2.3乳清蛋白溶液的制备

用去离子水配制10mg/mL的乳清蛋白溶液，在30-40℃水浴锅中保温5min，用无菌均质器中档(80次/min)拍打2min使乳清蛋白分散于去离子水中。2.4乳清蛋白溶解性的测定

参照2.3中的方法配制10mg/mL的乳清蛋白溶液，进行0.1、25、50、100、150、200、250MPa的动态超高压均质处理，使用凯式定氮法测定总蛋白含量。经10000r/min离心15min，沉淀不溶性蛋白，并测定上清液中乳清蛋白含量，计算上清液中乳清蛋白占总蛋白含量的百分数，衡量其溶解性，计算公式如下：

2.5乳清蛋白起泡性的测定

参照2.3中的方法配制10mg/mL的乳清蛋白溶液，进行0.1、25、50、100、150、200、250MPa的动态超高压均质处理，取100mL经动态超高压处理过的乳清蛋白溶液，用高速分散均质机9500r/min分散2min，记录泡沫体积V₀，静置30min，记录泡沫体积V₃₀。

2.6乳清蛋白乳化性的测定

参照2.3中的方法配制10mg/mL的乳清蛋白溶液，进行0.1、25、50、100、150、200、250MPa的动态超高压均质处理，取12mL经动态超高压均质处理过的蛋白

溶液与4mL大豆油混合，用高速分散均质机13500r/min乳化2min，制成乳清蛋白乳液，随后立即从烧杯底部取50μL乳状液与5mL 0.1g/100mL SDS溶液混合，500nm下测吸光度A₀，静置30min后按相同方法测定乳状液的吸光度A₃₀。

式中：T＝2.303；乳化性(EA)，m²/g；乳化稳定性(ES)，min；c为乳状液形成前蛋白浓度，g/mL；φ是光程(0.01)，θ为乳状液中油的体积分数(0.25)。2.7乳清蛋白乳液平均粒径的测定

采用动态激光光散射法(DLS)能快速简单地测粒径分布情况(平均粒径、多分散指数)。参照2.6中的方法配制的经动态超高压均质处理后的乳清蛋白乳液，然后用Zeta-sizer ZS90纳米粒径仪测量乳清蛋白乳液粒径，每个处理组测量3次。

2.8巯基二硫键含量的测定

游离巯基含量(SHF)：取动态超高压处理后的蛋白液0.5mL，加入Tris-Gly-8MUrea溶液(0.086mol/L Tris，0.09mol/L Gly，0.004mol/L EDTA，8mol/L尿素)2.5mL，再加入0.02mL4mg/mL的DTNB(5,5’-二硫双-2-硝基苯甲酸)溶液，迅速混匀后于25℃条件下恒温反应30min，用分光光度计测定其在λ＝412nm下吸光度值(A412)，同时以未加蛋白液的对照样代替样品进行空白值的测定。

总巯基(SH_T)含量：吸取0.2mL蛋白液，加入Tris-Gly-10MUrea溶液1.0mL，β-巯基乙醇0.02mL于25℃下恒温1h，再加入10mL 12％的TCA(三氯乙酸)溶液，继续保温1h，之后3000rpm离心10min，沉淀再用12％的TCA溶液洗涤并离心，重复两次后在离心的残渣中加3mL Tris-Gly-8Murea溶解，再加0.03mL DTNB溶液，迅速混匀后25℃恒温反应30min，用分光光度计测定其412nm下的吸光度值(A412)，同时以未加蛋白液的对照样代替样品进行空白值的测定。

巯基及二硫键的计算公式如下：

其中73.53＝10⁶/(1.36×10⁴)，1.36×10⁴是Ellman′s试剂的摩尔消光系数；A₄₁₂为λ＝412nm下吸光度值；C为样品的蛋白质浓度，单位为mg/mL。

2.9表面疏水性的测定

采用ANS(8-苯胺基-1-萘磺酸)荧光探针法，用pH6.25的磷酸缓冲液配制不同浓度的蛋白质溶液(0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％和0.2％)和8.0mmol/L的8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalene-sulfonate,ANS)溶液。检测前取20μL ANS溶液加到4mL蛋白质溶液中，混合均匀，迅速测定混合液的荧光强度(FI')及未加ANS溶液的样品荧光强度(FI0)。激发波长为338nm，发射波长为496nm。FI'与FI0的差值记为FI，以蛋白质浓度为横坐标，FI为纵坐标作图，曲线的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数H0。

2.10二级结构的测定

采用圆二色谱仪测定，以去离子水为空白，采用厚度0.1cm的石英比色皿，分辨率为0.2nm，狭缝宽度为1.0nm，灵敏度为20mdeg，响应时间为0.25s，远紫外区域(190-250nm)扫描，扫描速度50nm/min，并通过自带软件在线分析乳清蛋白的α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等二级结构构象单元含量，每个样品扫描三次。

2.11热性质分析

采用差示扫描量热仪对乳清蛋白的热性质情况进行分析。仪器用铟校准。将经过动态超高压均质处理后的乳清蛋白溶液进行冷冻干燥，取适量冻干后的乳清蛋白粉末放入铝制样品盘中，密封。以空铝盒为空白，载气为氮气，扫描速度10℃/min，扫描范围30-100℃，获得其DSC图谱，计算其变性温度和焓变值，确定乳清蛋白的热稳定性和聚集程度的变化。

2.12数据统计分析

应用SPSS 17.0和Origin 8.0对实验数据进行统计分析和作图，数据用平均值±标准偏差表示。

3.结果讨论

3.1压力水平对乳清蛋白溶解性的影响

蛋白质的溶解性指蛋白质在水溶液中溶解的性能，它是蛋白质功能性质的“第一必需”性质，是其他功能的基础，也是蛋白质水化作用的重要体现。不同压力水平下乳清蛋白溶解度的变化如图1所示，由图1可知，经动态高压均质处理后乳清蛋白的溶解性有一定程度的提高，随着压力水平的增大乳清蛋白溶液溶解性先升高后降低。这可能是因为，乳清蛋白在反应腔中受到的各种动力作用使乳清蛋白粒径变小，增大了与水的接触面积，并且经高压均质处理后，乳清蛋白内聚合的链被打散开，使乳清蛋白溶解度变大；但达到一定压力后，乳清蛋白不但聚合的链被打开，其内部包含的大部分疏水结构和小部分亲水结构也被暴露出来，表面疏水结构的增多使蛋白质与水之间的结合减少，从而使乳清蛋白溶液溶解性变小。

3.2压力水平对乳清蛋白起泡性的影响

一种物质的起泡性质是指它在气——液界面形成坚韧的薄膜使起泡并入和稳定的能力，包括起泡性和起泡稳定性。不同压力水平下乳清蛋白起泡性和起泡稳定性的变化如图2所示。由图2可知，随着压力水平的增大，乳清蛋白的起泡性呈先升高后降低的趋势，而乳化稳定性则呈现先降低后升高再降低的趋势，这和Plancken的研究结果基本一致。蛋白质分子是典型的两亲结构，因而可以在气-液界面中表现出较强的界面活性，具有一定程度的降低界面张力的作用，从而在搅拌中能形成泡沫。高压均质处理提高了乳清蛋白的溶解性，降低了界面张力，从而提高了乳清蛋白的起泡性，同时高压均质处理也可以使蛋白质结构展开，从而提高其泡沫的产生。但随着压力水平的进一步提高，高压均质处理破坏了乳清蛋白内部的疏水亲水基团和带电极性基团的平衡，进而不利于蛋白质膜在气——水界面的平衡，不利于泡沫的形成与维持。

3.3压力水平对乳清蛋白乳化性的影响

蛋白质的乳化性是指蛋白质作为一种乳化剂降低油-水表面的界面张力将油水结合为乳状液的能力，乳化稳定性则是指蛋白质维持这种乳状液而使油-水两相不分离的能力。不同压力水平下乳清蛋白乳化性和乳化稳定性变化如图3所示。可知随着压力水平的增大，乳清蛋白乳化性呈先减小后上升的趋势，在常压下其乳化性最大，而乳化稳定性则呈先减小后增大又减小的趋势，在150MPa时其乳化稳定性最大。乳清蛋白经处理后，由于机械作用和热效应的相互影响，使分子链段柔性降低，蛋白质发生部分变性，使蛋白与油滴不易结合，导致乳化性下降。乳化稳定性则是与时间和乳化液颗粒直径大小有关的性质，乳化液的粒径越小稳定性越好，高压均质处理降低了乳化液的粒径并使溶液变得均匀，从而使乳化稳定性增大；而随着压力的进一步增大，溶液中出现大颗粒的聚集，破坏了蛋白质膜中分子间的相互作用，从而使乳化稳定性有所降低。

3.4压力水平对乳清蛋白乳液粒径的影响

不同压力水平对乳清蛋白乳液粒径的影响如图4所示，由图可知随着压力水平的增大，乳液平均粒径呈先减小后增大的趋势，在150MPa处达到最小值。由结果可知，一定程度的高压均质处理可以大大降低乳清蛋白乳液的平均粒度。在均质过程中，随着处理压力的增大，物料的破碎程度增大，使其平均粒径减小且粒径尺寸分布变窄，溶液变得更均匀；而随着压力的进一步增大，过高的压力以及产生的热效应使物料发生团聚效应，并开始产生部分大颗粒，从而使乳液平均粒度增大。

3.5压力水平对乳清蛋白巯基二硫键的影响

蛋白质中的巯基(-SH)和二硫键(S-S)，具有很高的反应活性，是蛋白质中的重要功能集团，对蛋白质功能性质的发挥有重要的作用：如凝胶的形成、蛋白质的成膜等。研究表明，一定的处理方式可使蛋白质中巯基和二硫键发生一定程度的相互转化，并使蛋白结构变得松散，从而引起蛋白质的变性。由图5可知，随着压力水平的增大乳清蛋白的巯基含量先增大后减小，二硫键含量则先减小后增大。乳清蛋白经一定压力的高压均质处理后，其蛋白质的空间结构被破坏，肽链展开，二硫键被切断，从而使埋藏在蛋白质内部的巯基暴露于蛋白质表面，而部分二硫键也被还原成巯基，使巯基含量增大；而在更高压力下巯基含量降低二硫键含量升高则可能是巯基的过度暴露以及过高的压力使蛋白质空间结构被压缩，从而一部分巯基被氧化成二硫键。

3.6压力水平对乳清蛋白表面疏水性的影响

疏水相互作用是维持蛋白质三级结构的重要作用力，它对蛋白质的稳定性、构象和功能性具有十分重要的意义。水介质中，疏水相互作用指引非极性氨基酸残基倾向于聚集在蛋白质分子内部，从而使与睡直接接触的面积降至最低，但是疏水相互作用仍然可以出现在蛋白质分子表面，使其表面具有疏水性。不同压力水平对乳清蛋白表面疏水性的影响如图6所示，由结果可知随着压力水平的增大其表面疏水性呈先降低后升高的趋势。乳清蛋白未处理之前，其亲水物质和疏水物质是平衡统一的，其氨基酸残基非极性侧链被包埋在蛋白质分子内部。在经过高压均质处理后，蛋白质空间结构变得不紧凑，分子间的亲水区域被暴露，同时，在均质作用下，乳清蛋白溶液变得均匀，粒径变小，因此可以表面积增大，亲水区域暴露更多，造成表面疏水性降低；而随着压力进一步增大，蛋白质的结构遭到破坏，蛋白质分子发生解离和去折叠，疏水性侧链重新分布，使更多的残基暴露于蛋白质分子表面，表面疏水性随之增加。

3.7压力水平对乳清蛋白二级结构的影响

表1压力水平对乳清蛋白二级结构含量的影响

不用压力水平对乳清蛋白二级结构的影响如表1所示。由表1可知，随着压力水平的增大，乳清蛋白α-螺旋含量先增大后减小，α-螺旋是蛋白质中最常见和最稳定的二级结构，同时α-螺旋结构对压力处理较为敏感，这可能因为动态高压均质处理影响了蛋白质分子内氢键的稳定，而氢键则是维持α-螺旋稳定的重要部分，这说明了高压均质处理可以引起蛋白质结构的变化；β-折叠和β-转角的总和则先减小后增大，这一现象说明了在压力作用下，蛋白质分子发生了解离和重新聚合；而无规则卷曲含量则基本不变。从结果可知，动态高压均质处理可以破坏乳清蛋白的二级结构，改变蛋白质分子的构象，从而影响到蛋白质的三、四级结构，使其功能性质产生变化。

3.8压力水平对乳清蛋白热性质的影响

表2压力水平对乳清蛋白热性质的影响

蛋白质的热变性其实是个协同过程，即天然蛋白质向变性蛋白质转变时，会有大量的热量被吸收，变性初始温度和峰顶温度表征蛋白质的热稳定性；而吸热焓则是使蛋白质变性所需要的热量。不同压力水平对乳清蛋白热性质的影响如表所示。随着压力水平的增大，乳清蛋白变性初始温度、峰顶温度和吸热焓均呈先减小后增大的趋势，在150MPa时达到最小值，此时变性初始温度为48.13℃，峰顶温度为69.16℃，吸热焓为103.12J·g^-1。由结果可知随着压力的升高，其变性初始温度、峰顶温度和吸热焓均开始下降，说明动态高压均质处理降低了乳清蛋白的热稳定性，同时也降低了变性所需要的能量；当压力进一步升高时，其热稳定性和吸热焓也有所回升，但与未处理的乳清蛋白相比，其热稳定性还是有所降低。动态高压均质处理降低了乳清蛋白的热稳定性，也降低了变性所需要的能量，处理后的蛋白处于一种更不稳定的状态，原因可能说动态高压处理使蛋白质结构变得更松散，改变了蛋白质分子的构象，分子中部分相互作用力遭到破坏，从而使乳清蛋白分子发生部分变性。

Claims (2)

1.动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法，其特征在于，包括以下步骤：用去离子水配制浓度为10 mg/mL的乳清蛋白溶液，乳清蛋白溶液在30-40℃ 水浴锅中保温5min，用无菌均质器中档拍打2min使乳清蛋白分散于去离子水中，用高压均质机进行150MPa流动状态下的超高压均质处理。

2.如权利要求1所述动态超高压均质处理对乳清蛋白进行改性的方法，其特征在于，所述高压均质机购自于英国SFP公司，产品型号FPG12805。