CN108226473A - 一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用 - Google Patents
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用,属于有机金属催化及生物检测技术领域,为解决生物蛋白标记物检测体系存储不方便、容易受到外部条件影响、检测方法应用范围被限制等问题,本发明采取了以下技术方案:1)在载体上包被抗体A;2)加入被测抗原生物蛋白标记物;3)加入过渡金属催化剂修饰的标记抗体B;4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液,过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号,通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。实现对检测样品的超快、灵敏检测,具有操作简便、检测快速、准确性好、成本低、灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及有机金属催化及生物检测技术领域,具体地说,涉及过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。
背景技术
生物蛋白标记物的检测被认为是各种疾病检测及诊断的基石,因此开发灵敏、稳定、准确、低价的蛋白标记物检测方法具有十分重要的意义。目前,关于疾病标记物的检测技术主要是利用了抗原抗体特异性结合的原理,其中最经典的方法是酶联免疫吸附法。该方法是基于抗原抗体的特异性结合并引入酶标抗体,最终通过检测酶催化反应的程度对抗原或抗体进行定量检测的方法。然而,在检测过程中使用酶标抗体作为催化放大系统,不仅储存不方便,而且酶的活性容易受到外部条件的影响。酶催化反应对实验条件的苛刻要求限制了这种检测方法的广泛应用。
发明内容
为解决上述生物蛋白标记物检测体系存储不方便、容易受到外部条件影响、检测方法应用范围被限制等问题,本发明提供一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。
为实现上述目的,本发明采取了以下技术方案。
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。
包括以下步骤:1)在载体上包被能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的包被抗体A;2)加入被测抗原生物蛋白标记物,使被测抗原生物蛋白标记物与固定在载体上的包被抗体A特异性结合;3)加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B,使标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合;4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液,过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号,通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。
步骤1)所述载体为聚苯乙烯酶标板、磁珠;所用磁珠包含氨基磁珠、羧基磁珠、环氧磁珠、生物素链酶亲或素磁珠中的一种或二种以上,其中氨基磁珠或羧基磁珠负载蛋白前需首先采用戊二醛或水溶性的碳二亚胺缩合剂进行活化;包被抗体A通过化学吸附固定在载体上或通过化学反应连接在载体上后用牛血清白蛋白(BSA)封闭。
所述聚苯乙烯酶标板可采用96孔酶标板、48孔酶标板、384孔酶标板等不同孔数的酶标板,酶标板均包含可拆与不可拆两种型号,酶标板的颜色包含黑色、白色以及无色透明色。
步骤2)具体为:向步骤1)所得载体中加入待测抗原生物蛋白标记物溶液,在37℃条件下孵育1-3h。
步骤3)具体为:向步骤2)所得载体中加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B,在37℃条件下孵育1-3h。
步骤3)中所述过渡金属催化剂修饰的方法为:取过渡金属催化剂溶于10-100mM的磷酸缓冲溶液中,使过渡金属催化剂浓度为0.01-1.00mg/mL,调节pH为7.2-7.5,加入终浓度为0.5-2.0mg/mL的NHS,向上述体系中加入5mg·mL-1标记抗体B,加入量为每10mL所述体系加入标记抗体B1-5μL,摇床混合12-24h;向所得体系中分别加入1-5%(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)和1-5%(v/v)的甲酸,每10mL所述体系二者加入量均为200μL,25℃摇床上混合12h,得到过渡金属催化剂标记抗体溶液,置于4℃条件下保存备用。
步骤3)所述过渡金属催化剂的分子结构为:
中的一种或二种以上,其金属中心M为钌(Ru)、铱(Ir)、铑(Rh)或铁(Fe)中的一种或二种以上,配体结构R为羧基(—COOH)、氨基(—NH2)或叠氮(—N3)偶联基团中的一种或二种以上,可对蛋白分子进行修饰,X为H2O、Cl或Br中的一种或二种以上,催化剂负离子包括六氟磷酸根(PF6 -)、四氟硼酸根(BF4 -)、硫酸根(SO4 2-)或硝酸根(NO3 -)中的一种或二种以上,催化剂二氮类配体分别为邻二氮杂菲、2,2’-二联吡啶或2,2’-二联嘧啶、烟酰胺、苯基亚胺中的一种或二种以上。
步骤3)中标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合,从而将过渡金属催化剂固定在载体上。
步骤3)所述过渡金属催化剂能够在氢源,如甲酸、柠檬酸、苯硼酸、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、三(2-羧乙基)膦TCEP存在下,催化步骤4)所述氧化还原调控荧光探针分子中的氧化还原官能团还原,同时探针分子荧光强度发生改变。由于不同浓度的过渡金属催化剂所引起的荧光强度的变化程度是不同的,采用荧光光谱仪对体系荧光强度的变化进行测量可实现对待测样品的定量分析。
步骤3)所述金属催化以甲酸、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、异丙醇/异丙醇钠、异丙醇/氢氧化钠、水合肼或硼氢化钠作为氢源,可促使过渡金属催化剂分子中的H2O、Cl或Br转换为H,进而可催化探针分子中的氧化基团发生还原,产生荧光变化。
步骤4)具体为:向步骤3)所得载体中加入氧化还原荧光检测液20-100℃反应10-100min后,检测荧光强度。
步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的组成为:有机溶剂(包括二甲基亚砜DMSO或N,N-二甲基甲酰胺DMF或乙醇或甲醇或乙腈或二氧六环)10-90%(V/V),水90-10%(V/V),有机溶剂与水的体积和为100%(V/V);最终浓度在1-1000μM的氧化还原荧光探针分子;最终浓度为10-1000mM的甲酸、最终浓度为10-1000mM的甲酸钠;pH为3-10。
步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的配制方法为:将氧化还原荧光探针分子溶于有机溶剂(包括二甲基亚砜DMSO或N,N-二甲基甲酰胺DMF或乙醇或甲醇或乙腈或二氧六环)与水的混合溶剂(含10%-90%V/V的DMSO)中,使氧化还原荧光探针分子的最终浓度保持在1-1000μM,向混合溶剂中分别加入甲酸和甲酸钠,保持溶液中甲酸和甲酸钠的最终浓度均为10-1000mM,调节混合液pH=3-10;各成分超声混合均匀后,置于4℃条件下保存备用。
步骤4)所述荧光探针为氧化还原调控型探针,分子结构为:
中的一种或二种以上;探针分子均含有氧化还原活性官能团,其氧化还原活性官能团包含对苯醌、邻苯醌、辅酶Q0、硝基、羰基、叠氮,探针分子荧光团包括罗丹明、萘酰亚胺、香豆素,同时,根据荧光响应过程,探针可分为还原型荧光“开-关”探针(包括探针分子P-1、P-2)和还原型荧光“关-开”探针(包括探针分子P-3、P-4、P-5)两种类型。
有益效果
本发明将氧化还原调控荧光探针与过渡金属催化剂相结合,同时基于特异的抗原-抗体免疫反应,建立灵敏、快速的金属催化荧光调控生物蛋白标记物体外检测方法。
所述荧光调控体系利用过渡金属催化剂催化荧光探针分子中氧化还原活性官能团(醌、硝基、羰基、烟酰胺)的氧化还原性质,诱导探针分子结构或电子分布发生改变,从而使荧光探针分子产生一个从无到有或从强到弱的荧光变化,所述荧光强度的变化可通过荧光光谱仪或酶标仪直接判断和测量。
本发明的目的在于针对传统免疫检测技术中存在的不足,开发新的荧光蛋白检测手段。基于传统的蛋白免疫反应,以高效、稳定、廉价的有机过渡金属催化反应代替酶催化反应,并引入氧化还原荧光调控体系,提供一种基于过渡金属催化荧光特异性响应的生物蛋白标记物检测方法。它能实现对检测样品的超快、灵敏检测,具有操作简便、检测快速、准确性好、成本低、灵敏度高的优点,可在生物标记蛋白体外检测及临床研究中发挥重要作用,其优点主要有:
(1)以高效、稳定、廉价的有机金属催化反应代替酶催化反应,并应用于生物蛋白标记物检测中,不仅降低了生物蛋白标记物体外检测的成本,同时实现了对检测信号的有效放大,而且解决了酶催化反应对实验条件要求苛刻、稳定性差、易失活等问题。
(2)将氧化还原型荧光探针引入到生物蛋白标记物体外检测体系中,分别采用了从500-700nm之间不同发射波长的荧光探针进行生物蛋白标记物体外检测体系的构建,可适用于多种不同形式的生物蛋白标记物检测,具有灵敏性高、可适用范围广等优势。
(3)利用金属催化反应代替传统的酶催化过程,由于过渡金属催化剂相对于酶具有更好地耐热性,可通过温度控制反应速度,大大缩短了反应时间,可在生物蛋白标记物体外检测及临床研究中发挥重要作用。
本发明以几种高效、稳定的过渡金属催化加氢还原反应为基础,同时结合氧化还原调控型荧光探针,建立了一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系的生物蛋白标记物体外检测新方法。
附图说明
图1为采用酶标板作为抗原、抗体的载体,基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用的流程图;图中的标号分别为:
1、酶标板;2、包被抗体;3、抗原;
4、标记抗体;5、过渡金属催化剂;6、氧化还原“开-关”型荧光探针。
图2为采用磁珠作为抗原、抗体的载体,基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用的流程图;图中的标号分别为:
1、酶标板;2、包被抗体;3、抗原;
4、标记抗体;5、过渡金属催化剂;6、氧化还原“开-关”型荧光探针。
图3为采用酶标板作为抗原、抗体的载体,基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用的流程图。图中的标号分别为:
1、酶标板;2、包被抗体;3、抗原;
4、标记抗体;5、过渡金属催化剂;6、氧化还原“关-开”型荧光探针。
图4为采用磁珠作为抗原、抗体的载体,基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用的流程图。图中的标号分别为:
1、酶标板;2、包被抗体;3、抗原;
4、标记抗体;5、过渡金属催化剂;6、氧化还原“关-开”型荧光探针。
具体实施方式
以下结合附图继续介绍本发明基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用的具体实施方式。应当指出,本发明的实施不限于以下所述的实施方式。
图1所示的流程具体为:
将包被抗体2通过化学吸附固定在酶标板1上,进一步,包被抗体2固定的酶标板特异性的结合被测抗原3,并进一步与过渡金属催化剂5修饰的标记抗体4相连接,催化剂通过氨基羧基缩合反应或“Click”反应偶联实现对标记抗体的修饰;通过过渡金属催化剂与抗原的对应关系,越多的抗原可以结合更多的过渡金属催化剂,同时单个催化剂又可催化大量荧光探针分子产生荧光信号,从而实现对抗原的标记及信号放大;最后,向过渡金属催化剂标记的酶标板1中加入氧化还原荧光检测液(检测液的氧化还原荧光“开-关”型探针分子为6),通过检测氧化还原荧光检测液的荧光强度可实现对抗原3的定量检测。
图2所示的流程具体为:
首先,将包被抗体2通过化学反应连接在磁珠1上,进一步,包被抗体2固定的磁珠特异性的结合被测抗原3,并进一步与过渡金属催化剂5修饰的标记抗体4相连接,催化剂通过氨基羧基缩合反应或“Click”反应偶联实现对标记抗体的修饰;通过过渡金属催化剂与抗原的对应关系,越多的抗原可以结合更多的过渡金属催化剂,同时单个催化剂又可催化大量荧光探针分子产生荧光信号,从而实现对抗原的标记及信号放大;最后,向过渡金属催化剂标记的磁珠1中加入氧化还原荧光检测液(检测液的氧化还原荧光“开-关”型探针分子为6),通过检测氧化还原荧光检测液的荧光强度可实现对抗原3的定量检测。
图3所示的流程具体为:
首先,将包被抗体2通过化学吸附固定在酶标板1上,进一步,包被抗体2固定的酶标板特异性的结合被测抗原3,并进一步与过渡金属催化剂5修饰的标记抗体4相连接,催化剂通过氨基羧基缩合反应或“Click”反应偶联实现对标记抗体的修饰;通过过渡金属催化剂与抗原的对应关系,越多的抗原可以结合更多的过渡金属催化剂,同时单个催化剂又可催化大量荧光探针分子产生荧光信号,从而实现对抗原的标记及信号放大;最后,向过渡金属催化剂标记的酶标板1中加入氧化还原荧光检测液(检测液的氧化还原荧光“关-开”型探针分子为6),通过检测氧化还原荧光检测液的荧光强度可实现对抗原3的定量检测。
图4所示的流程具体为:
首先,将包被抗体2通过化学反应连接在磁珠1上,进一步,包被抗体2固定的磁珠特异性的结合被测抗原3,并进一步与过渡金属催化剂5修饰的标记抗体4相连接,催化剂通过氨基羧基缩合反应或“Click”反应偶联实现对标记抗体的修饰;通过过渡金属催化剂与抗原的对应关系,越多的抗原可以结合更多的过渡金属催化剂,同时单个催化剂又可催化大量荧光探针分子产生荧光信号,从而实现对抗原的标记及信号放大;最后,向过渡金属催化剂标记的磁珠1中加入氧化还原荧光检测液(检测液的氧化还原荧光“开-关”型探针分子为6),通过检测氧化还原荧光检测液的荧光强度可实现对抗原3的定量检测。
以下实施例中,参考以上附图的,其流程与相应附图所示流程相同。
实施例1
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在甲胎蛋白(AFP)检测中的应用(流程可参考图1),所采用酶标板1为聚苯乙烯酶标板,所用包被抗体2为单克隆AFP抗体,所使用的过渡金属催化剂为羧基修饰五甲基环戊二烯基铱络合物六氟磷酸盐[(η5-C5Me5)Ir(bpyCOOH)(H2O)](PF6)2,所使用的荧光探针为醌还原型探针,标记抗体为多克隆AFP抗体4,抗原3采用AFP抗原,所述氧化还原荧光探针检测液为含有荧光分子6的荧光检测液。过渡金属催化剂结构式为:
以下结合附图1对具体步骤进行说明:
(1)采用酶标板1作为抗原、抗体的载体。所述酶标板1可采用96孔酶标板、48孔酶标板、384孔酶标板等不同孔数的酶标板,酶标板均包含可拆与不可拆两种型号,酶标板的颜色包含黑色、白色以及无色透明色。
(2)制备氧化还原荧光探针检测液。
①采用“开-关”型探针P-3作为氧化还原调控荧光探针,探针分子的荧光调控机理如下:探针分子P-3中的对苯醌氧化还原基团本身处于醌氧化型态,为缺电子状态,因此探针具有强的荧光信号;然而,当探针分子中的对苯醌被还原为其氢醌还原态后,由于氢醌为富电子基团,易发生电子转移(ET)导致罗丹明荧光团发生荧光淬灭,仅显示微弱的荧光信号。
②氧化还原荧光检测液的配置。
将氧化还原荧光探针分子P-3溶于二甲基亚砜DMSO与水的混合溶剂(含10%-90%DMSO)中,使氧化还原荧光探针分子P-3的最终浓度保持在1-1000μM,向混合溶剂中分别加入甲酸和甲酸钠,保持溶液中甲酸和甲酸钠的最终浓度均为10-1000mM,调节混合液pH=3-10;各成分超声混合均匀后,置于4℃条件下保存备用。
③对制得的氧化还原荧光检测液的测试
取100μL氧化还原荧光检测液,注入10μL的20-50μM硼氢化钠溶液,反应10min后,用450-560nm可见光激发,可观察到明显的橙红色荧光产生,采用荧光分光光度仪测试,在520nm处有强的荧光,即认为该氧化还原荧光检测液具有灵敏的氧化还原荧光响应性能,可应用于免疫检测。
(3)制备过渡金属催化剂修饰标记抗体
①称取1.0-10mg羧基修饰过渡金属催化剂溶于10mL 10-100mM的磷酸缓冲溶液中(pH=7.4),加入5-20mg NHS室温振荡30min后,接着向反应液中加入1-5μL 5mg·mL-1的AFP多克隆抗体,将混合好的溶液置于摇床上混合12-24h。接着向得到的过渡金属催化剂标记抗体溶液中加入200μL 1-5%牛血清白蛋白(BSA)以及200μL 1-5%甲酸对没有结合甲胎蛋白多克隆抗体的部分催化剂以及NHS进行消耗,进行封闭,25℃摇床上混合12h,后置于4℃条件下保存备用。
②对制得的过渡金属催化剂标记抗体的测试
Ⅰ、经抗体活性测试,证明过渡金属催化剂标记抗体保持了原有的抗体活性。
Ⅱ、结论:制备的过渡金属催化剂标记抗体可用于免疫检测。
注:以上各步骤可一并做,也可以分开做,是为进行荧光检测的前序部分或者准备部分。
(4)以甲胎蛋白(AFP)为例进行免疫检测
①将AFP的单克隆抗体2溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中(4μg·mL-1),在酶标板1的每个孔中加入100μL的上述溶液,4℃条件下过夜。
②用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗步骤①的酶标板3-5次,加入100-400μL 1%的牛血清白蛋白(BSA)封闭。
③用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗步骤②的酶标板3-5次,加入不同浓度的甲胎蛋白(AFP),在37℃条件下孵育1-3h。
④用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗步骤③的酶标板3-5次,加入100-200μL步骤(3)制备的过渡金属催化剂标记抗体,在37℃条件下孵育1-3h。
⑤用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗步骤(4)的酶标板3-5次,加入100μL步骤(2)制备的氧化还原荧光检测液,20-100℃反应10-100min后,通过荧光光谱进行定量检测。
检测实施例1中荧光强度的表征意义(检测原理)
(1)当甲胎蛋白浓度较高时,结合相应量的过渡金属催化剂标记抗体,加入氧化还原荧光检测液后,在相同条件下,可更快的催化较多的探针分子P-3发生还原,产生较强的荧光淬灭,因此检测氧化还原荧光检测液仅获得较弱荧光信号。
(2)当甲胎蛋白浓度较低或者浓度为0时,酶标板所结合的催化剂浓度较低或者为0,从而只有较少量的探针分子P-3发生还原或者没有探针分子P-3发生还原,氧化还原荧光检测液的荧光强度也相对较强。
(3)本发明能利用过渡金属催化剂标记抗体在对甲胎蛋白(AFP)的检测中实现用荧光法检测甲胎蛋白。但是,采用实施例1的方法容易产生较强的背景荧光干扰,从而影响检测的灵敏性和稳定性。
实施例2
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在肝癌病人和非肝癌病人血清样本检测中的应用(流程可参考附图1),所采用酶标板1为聚苯乙烯酶标板,所用包被抗体2为单克隆AFP抗体,标记抗体为多克隆AFP抗体4,所使用的催化剂为羧基修饰五甲基环戊二烯基铱络合物六氟磷酸盐[(η5-C5Me5)Ir(bpyCOOH)(H2O)](PF6)2,所使用的荧光探针为醌还原型探针P-3,抗原3采用肝癌病人和非肝癌病人血清样本,所述氧化还原荧光探针检测液为含有荧光分子6的荧光检测液。以下结合附图1对具体步骤进行说明:
其步骤基本同实施例1。
实施例2与实施例1所不同的是:实施例2步骤(4)的基本内容为:
(4)以肝癌病人和非肝癌病人血清样本为例进行免疫检测
③用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗步骤(2)的酶标板3-5次,加入100μL用磷酸盐缓冲液稀释100倍的肝癌病人和非肝癌病人的血清样本,在37℃条件下培养1h。
步骤(4)①、②、④、⑤的内容同实施例1。
检测实施例2中荧光强度的表征意义
(1)阳性样本——肝癌病人的血清样本,由于其甲胎蛋白含量较高,显示较弱的荧光。而阴性样本——非肝癌病人的血清样本,由于甲胎蛋白含量较少,荧光强度非常强。
(2)通过与甲胎蛋白的浓度标准曲线进行比对,本发明能够更加方便、准确地检测到每一例待测血清样本中甲胎蛋白的含量。
(3)实施例2证明:在免疫吸附试验中,通过不同浓度过渡金属催化剂引起的氧化还原荧光检测液荧光强度的变化,能实现临床样本的检测,但检测的稳定性较差。
实施例3
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在甲胎蛋白(AFP)检测中的应用(可参考附图4),所采用磁珠1为50-500nm羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠等,所采用包被抗体2为单克隆AFP抗体,抗原3采用AFP抗原,所使用的催化剂为五甲基环戊二烯基铱络合物氟硼酸盐[(η5-C5Me5)Ir(bpymCOOH)(H2O)](BF4)2,所使用的荧光探针为“关-开”型氧化还原调控探针P-7,所述氧化还原荧光检测液为含有“关-开”型探针分子6的荧光检测液。过渡金属催化剂结构为:
以下结合附图4对具体步骤进行说明:
(1)配体偶联磁珠的制备(以羧基磁珠为例进行说明)
①取100μL羧基修饰磁珠1转移到1mL离心管中,磁性分离除去上清液,用200μL咪唑-HCl缓冲液(10-1000mM,pH=7.0)洗涤1-5次,然后移除上清液。
②将新鲜配制的100μLN-羟基琥珀酰亚胺水溶液(0.1-0.5M)和100μLN-羟1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液(0.1-1M)加入到离心管中,漩涡混匀使磁珠1充分悬浮,后置于25℃条件下反应1-5h,期间应保持磁珠1的悬浮状态。
③磁性分离除去反应液后,向装有磁珠1的离心管中加入50-200μg生物配体(合适用量及浓度需要根据具体实验进行优化,保持溶液的pH≈8.0,可加入0.01-0.05%的表面活性剂(Tween 20)以提高磁珠1的分散性),轻摇至混匀。
④用锡箔纸包裹后置于温度25℃恒温箱中偶联2-10h;在偶联期间保持磁珠1的悬浮状态。
⑤磁性分离去除上清液,向磁珠溶液中加入200μL牛血清白蛋白(BSA)与磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2,含1-10%的BSA)重悬磁珠1,25℃条件下反应1h,封闭磁珠1表面的非特异性反应位点;该期间应始终保持磁珠1的悬浮状态;将装有磁珠的离心管置于磁分离架上磁性分离去除上清液,每次用200μL牛血清白蛋白(BSA)溶液(pH=7.2)洗涤3次以上,重新悬浮于保存液中(可根据需要来确定保存溶液的加入量,以调整配体磁珠1的浓度),于4℃条件下保存备用。
氨基磁珠偶联配体的步骤与羧基磁珠偶联配体的步骤(1)基本相同,不同的是:
①将购买的氨基修饰磁珠混合均匀后,取100μL 10mg/mL磁珠转移到1mL离心管中,磁吸去除上清液,用200μL PBS溶液(50mM PBS,pH=7.4)进行磁性分离洗涤2次,然后移除上清液;
②加入新鲜配制的100μL戊二醛溶液(15%)到离心管中,漩涡混匀使磁珠充分悬浮,用锡箔纸包裹后25℃反应1h,该期间保持磁珠的悬浮状态;
步骤③、④、⑤的内容与氨基磁珠偶联配体的步骤(1)相同。
环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠偶联配体的步骤相同,与羧基磁珠偶联配体的步骤(1)不同的是,不需要②的操作,步骤①、③、④、⑤的内容与羧基磁珠偶联配体的步骤(1)相同。
(2)制备氧化还原荧光探针检测液。
①以“关-开”型探针P-7作为氧化还原调控荧光探针,探针分子P-7的荧光调控机理如下:探针分子P-7中的氧化还原活性官能团三甲基对苯醌本身处于其氧化状态,罗丹明110荧光团螺环处于关闭状态,没有荧光;然而,当其分子结构中的醌被还原为对苯酚后,探针分子中的酰胺键便会发生断裂,生成一种新的苯并环戊内酯,同时罗丹明110的螺环打开,产生强的荧光信号。
②氧化还原荧光检测液的配置。
将氧化还原荧光探针分子P-7溶于二甲基亚砜DMSO与水的混合溶剂(含10%-90%DMSO)中,使氧化还原荧光探针分子P-7的最终浓度保持在1-1000μM,向混合溶剂中分别加入甲酸和甲酸钠,保持溶液中甲酸和甲酸钠的最终浓度均为10-1000mM,调节混合液pH=3-10;各成分超声混合均匀后,置于4℃条件下保存备用。
③对制得的氧化还原荧光检测液的测试
取100μL氧化还原荧光检测液,注入10μL的20-50μM硼氢化钠溶液,反应10min后,用450-560nm可见光激发,可观察到明显的绿色荧光产生,采用荧光分光光度仪测试,在520nm处有强的荧光,即认为该氧化还原荧光检测液具有灵敏的氧化还原荧光响应性能,可应用于免疫检测。
(3)制备过渡金属催化剂标抗体(同实施例1)。
注:以上各步骤可一并做,也可以分开做,是为进行荧光检测的前序部分或者准备部分。
(4)以甲胎蛋白(AFP)为例进行免疫检测
①取AFP的单克隆抗体2修饰的磁珠115μL(10mg/mL)放到100μL离心管中,用牛血清白蛋白(BSA)溶液洗涤1-2次后,加入不同浓度的AFP 3,在37℃条件下孵育1-3h;该期间利用垂直混合仪进行颠倒混匀,保持磁珠1的悬浮状态。
②用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗步骤①的磁珠11-2次,加入100-200μL步骤(3)制备的过渡金属催化剂标记抗体,在37℃条件下孵育1-3h。
③用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗步骤②的磁珠11-2次,加入100μL步骤(2)制备的氧化还原荧光检测液,30-60℃静置30min后,通过荧光光谱仪进行荧光测试。
检测实施例3中荧光强度的表征意义
(1)当甲胎蛋白浓度较高时,结合相应量的过渡金属催化剂标记抗体,加入氧化还原荧光检测液后,在相同条件下,可更快的催化较多的探针分子P-7发生还原,产生荧光,因此氧化还原荧光检测液会产生较强的荧光。
(2)当甲胎蛋白浓度较低或者浓度为0时,磁珠所结合的催化剂浓度较低或者为0,从而只有较少量的探针分子P-7发生还原或者没有探针分子P-7发生还原,氧化还原荧光检测液的荧光强度也相对较弱或者是没有荧光。
(3)因此,本发明能利用过渡金属催化剂标记抗体在对甲胎蛋白(AFP)的检测中实现用荧光法检测甲胎蛋白。
实施例4
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在肝癌病人和非肝癌病人血清样本检测中的应用(流程可参考附图4),所采用磁珠1为羧基,所用包被抗体2为单克隆AFP抗体,标记抗体为多克隆AFP抗体4,所使用的催化剂为五甲基环戊二烯基铱络合物氟硼酸盐[(η5-C5Me5)Ir(bpymCOOH)(H2O)](BF4)2,所使用的荧光探针为醌还原型探针P-7,抗原3采用肝癌病人和非肝癌病人血清样本,所述氧化还原荧光探针检测液为含有荧光分子6的荧光检测液。以下结合附图4对具体步骤进行说明:
其步骤基本同实施例1。
所述荧光探针分子为氧化还原荧光“关-开”探针分子6,采用磁珠1作为抗原、抗体的载体,其步骤基本同实施例3。
实施例4与实施例3所不同的是:实施例4步骤(4)的基本内容为:
(4)以肝癌病人和非肝癌病人血清样本为例进行免疫检测
①取AFP单克隆抗体2修饰的磁珠115μL(10mg/mL)放到100μL离心管中,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤1-2次后,加入100μL用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释100倍的肝癌病人和非肝癌病人的血清样本,在37℃条件下孵育1-3h;该期间利用垂直混合仪进行颠倒混匀,保持磁珠1的悬浮状态。
步骤(4)②和③的内容同实施例3。
检测实施例4中荧光强度的表征意义
(1)阳性样本——肝癌病人的血清样本,由于其甲胎蛋白含量较高,显示较强的荧光。而阴性样本——非肝癌病人的血清样本,由于甲胎蛋白含量较少,荧光强度非常弱。
(2)通过与甲胎蛋白的浓度标准曲线进行比对,本发明能够更加方便、准确地检测到每一例待测血清样本中甲胎蛋白的含量。
(3)实施例4证明:在免疫吸附试验中,通过不同浓度过渡金属催化剂引起的氧化还原荧光检测液荧光强度的变化,能实现临床样本的检测,且的稳定性较高。
实施例5
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在C-反应蛋白(CRP)检测中的应用(流程可参考附图4),所采用磁珠1为50-500nm羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠等,所采用包被抗体2为单克隆CRP抗体,抗原3采用CRP抗原,所使用的催化剂为五甲基环戊二烯基钌络合物氟硼酸盐[(η5-C5Me5)Ru(bpymCOOH)(H2O)](BF4)2,所使用的荧光探针为“关-开”型氧化还原调控探针P-7,所述氧化还原荧光检测液为含有“关-开”型探针分子6的荧光检测液。过渡金属催化剂结构为:
以下结合附图4对具体步骤进行说明:
(1)配体偶联磁珠的制备(同实施例3)
(2)制备氧化还原荧光探针检测液(同实施例3)
(3)制备过渡金属催化剂标抗体(同实施例1)。
注:以上各步骤可一并做,也可以分开做,是为进行荧光检测的前序部分或者准备部分。
(4)以C-反应蛋白(CRP)为例进行免疫检测
①取CRP的单克隆抗体2修饰的磁珠115μL(10mg/mL)放到100μL离心管中,用牛血清白蛋白(BSA)溶液洗涤1-2次后,加入不同浓度的CRP 3,在37℃条件下孵育1-3h;该期间利用垂直混合仪进行颠倒混匀,保持磁珠1的悬浮状态。
②用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗步骤①的磁珠11-2次,加入100-200μL步骤(3)制备的过渡金属催化剂标记抗体,在37℃条件下孵育1-3h。
③用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗步骤②的磁珠11-2次,加入100μL步骤(2)制备的氧化还原荧光检测液,50-80℃静置10-60min后,通过荧光光谱仪进行荧光测试。
检测实施例5中荧光强度的表征意义
(1)当C-反应蛋白浓度较高时,结合相应量的过渡金属催化剂标记抗体,加入氧化还原荧光检测液后,在相同条件下,可更快的催化较多的探针分子P-7发生还原,产生荧光,因此氧化还原荧光检测液会产生较强的荧光。
(2)当C-反应蛋白浓度较低或者浓度为0时,磁珠所结合的催化剂浓度较低或者为0,从而只有较少量的探针分子P-7发生还原或者没有探针分子P-7发生还原,氧化还原荧光检测液的荧光强度也相对较弱或者是没有荧光。
(3)因此,本发明能利用过渡金属催化剂标记抗体在对C-反应蛋白的检测中实现用荧光法检测C-反应蛋白。
实施例6
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在C-反应蛋白(CRP)检测中的应用(流程可参考附图4),所采用磁珠1为50-500nm羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠等,所采用包被抗体2为单克隆CRP抗体,抗原3采用CRP抗原,所使用的催化剂为五甲基环戊二烯基铑络合物氟硼酸盐[(η5-C5Me5)Rh(bpymCOOH)(H2O)](BF4)2,所使用的荧光探针为“关-开”型氧化还原调控探针P-7,所述氧化还原荧光检测液为含有“关-开”型探针分子6的荧光检测液。过渡金属催化剂结构为:
以下结合附图4对具体步骤进行说明:
(1)配体偶联磁珠的制备(同实施例3)
(2)制备氧化还原荧光探针检测液(同实施例3)
(3)制备过渡金属催化剂标抗体(同实施例1)。
注:以上各步骤可一并做,也可以分开做,是为进行荧光检测的前序部分或者准备部分。
(4)以前列腺特异抗原(PSA)为例进行免疫检测
①取PSA的单克隆抗体2修饰的磁珠115μL(10mg/mL)放到100μL离心管中,用牛血清白蛋白(BSA)溶液洗涤1-2次后,加入不同浓度的PSA 3,在37℃条件下孵育1-3h;该期间利用垂直混合仪进行颠倒混匀,保持磁珠1的悬浮状态。
②用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗步骤①的磁珠11-2次,加入100-200μL步骤(3)制备的过渡金属催化剂标记抗体,在37℃条件下孵育1-3h。
③用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗步骤②的磁珠11-2次,加入100μL步骤(2)制备的氧化还原荧光检测液,40-60℃静置30-50min后,通过荧光光谱仪进行荧光测试。
检测实施例6中荧光强度的表征意义
(1)当前列腺特异抗原PSA浓度较高时,结合相应量的过渡金属催化剂标记抗体,加入氧化还原荧光检测液后,在相同条件下,可更快的催化较多的探针分子P-7发生还原,产生荧光,因此氧化还原荧光检测液会产生较强的荧光。
(2)当前列腺特异抗原PSA浓度较低或者浓度为0时,磁珠所结合的催化剂浓度较低或者为0,从而只有较少量的探针分子P-7发生还原或者没有探针分子P-7发生还原,氧化还原荧光检测液的荧光强度也相对较弱或者是没有荧光。
(3)因此,本发明能利用过渡金属催化剂标记抗体在对前列腺特异抗原PSA的检测中实现用荧光法检测前列腺特异抗原PSA。
Claims (8)
1.一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于:包括以下步骤:1)在载体上包被能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的包被抗体A;2)加入被测抗原生物蛋白标记物,使被测抗原生物蛋白标记物与固定在载体上的包被抗体A特异性结合;3)加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B,使标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合;4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液,过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号,通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于:步骤1)所述载体为聚苯乙烯酶标板或磁珠;所用磁珠包含氨基磁珠、羧基磁珠、环氧磁珠、生物素链酶亲或素磁珠中的一种或二种以上,其中氨基磁珠或羧基磁珠负载蛋白前需首先采用戊二醛或水溶性的碳二亚胺缩合剂进行活化。
4.根据权利要求2所述应用,其特征在于:步骤3)中所述过渡金属催化剂修饰的方法为:取过渡金属催化剂溶于10-100mM的磷酸缓冲溶液中,使过渡金属催化剂浓度为0.01-1.00mg/mL,调节pH为7.2-7.5,加入终浓度为0.5-2.0mg/mL的NHS,向上述体系中加入5mg·mL-1标记抗体B,加入量为每10mL所述体系加入标记抗体B1-5μL,摇床混合12-24h;向所得体系中分别加入1-5%(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)和1-5%(v/v)的甲酸,每10mL所述体系二者加入量均为200μL,25℃摇床上混合12h,得到过渡金属催化剂标记抗体溶液,置于4℃条件下保存备用。
5.根据权利要求2所述应用,其特征在于:步骤3)所述过渡金属催化剂的分子结构为:
中的一种或二种以上,其金属中心M为钌(Ru)、铱(Ir)、铑(Rh)或铁(Fe)中的一种或二种以上,配体结构R为羧基(—COOH)、氨基(—NH2)或叠氮(—N3)偶联基团中的一种或二种以上,可对蛋白分子进行修饰,X为H2O、Cl或Br中的一种或二种以上,催化剂负离子包括六氟磷酸根(PF6 -)、四氟硼酸根(BF4 -)、硫酸根(SO4 2-)或硝酸根(NO3 -)中的一种或二种以上,催化剂二氮类配体分别为邻二氮杂菲、2,2’-二联吡啶或2,2’-二联嘧啶、烟酰胺、苯基亚胺中的一种或二种以上。
6.根据权利要求2所述应用,其特征在于:步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的组成为:有机溶剂10-90%(V/V),水90-10%(V/V),有机溶剂与水的体积和为100%(V/V);最终浓度在1-1000μM的氧化还原荧光探针分子;最终浓度为10-1000mM的甲酸、最终浓度为10-1000mM的甲酸钠;pH为3-10;上述有机溶剂为二甲基亚砜DMSO、N,N-二甲基甲酰胺DMF、乙醇、甲醇、乙腈或二氧六环中的一种或二种以上。
7.根据权利要求6所述应用,其特征在于:步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的配制方法为:将氧化还原荧光探针分子溶于有机溶剂与水的混合溶剂(含10%-90%V/V的有机溶剂)中,使氧化还原荧光探针分子的最终浓度保持在1-1000μM,向混合溶剂中分别加入甲酸和甲酸钠,保持溶液中甲酸和甲酸钠的最终浓度均为10-1000mM,调节混合液pH=3-10;各成分超声混合均匀后,置于4℃条件下保存备用;上述有机溶剂为二甲基亚砜DMSO、N,N-二甲基甲酰胺DMF、乙醇、甲醇、乙腈或二氧六环中的一种或二种以上。
8.根据权利要求2、6或7所述应用,其特征在于:步骤4)所述荧光探针为氧化还原调控型探针,分子结构为:
中的一种或二种以上。
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