CN108226363A - 一种利用hplc检测尿激酶分子组分比的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿激酶分子组分比的HPLC检测方法，采用TSK‑GEL系列凝胶色谱柱，柱长300‑600mm，填料粒径5‑10μm；流动相由浓度为0.05‑0.3mol/L，pH为2.8‑5.0的磷酸盐缓冲液组成，检测波长275‑280nm。该方法样品无需特殊处理，配制成一定浓度的尿激酶样品溶液后，只需通过一次高效液相色谱检测，就能准确测定出尿激酶样品中高低分子量组分的相对含量，操作方法简单易行，准确度高，重现性好，高低分子量尿激酶组分的分离度大于1.5，能够满足实际检测中尿激酶样品质量控制的需要。与现有生物学方法相比，快捷、简便、经济。

Description

一种利用HPLC检测尿激酶分子组分比的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，特别涉及一种利用HPLC检测尿激酶分子组分比的方法。
背景技术
尿激酶，简称UK，是存在于尿中的一种蛋白水解酶，主要作用是激活血纤维蛋白溶酶原（纤溶酶原）成为有活性的血纤维蛋白溶酶（纤溶酶），从而使血纤维蛋白凝块（血栓）溶解。尿激酶对治疗脑血栓、心肌梗死等血栓病有良好的疗效，广泛应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成，具有良好的市场前景。人源性尿激酶主要有天然的高分子量尿激酶（54.7KD）和低分子量尿激酶（33KD）两种，高分子量尿激酶溶解血栓的临床效果比低分子量的尿激酶约高3 倍，国际上把尿激酶的相对分子量作为质量标准的重要指标之一。因此建立有效、便捷的尿激酶分子组分比的测定方法具有重大的实用价值。
目前，关于尿激酶分子组分比检测方法的报道较少，大部分为考马斯亮蓝法。如：中国药典收录的尿激酶分子组分比的检测方法为：取尿激酶，加水溶解并稀释制成每1ml中含2mg的溶液后，加入等体积的缓冲液[取浓缩胶缓冲液（F液）2.5ml、20%十二烷基硫酸钠溶液2.5ml、0.1%溴酚蓝溶液1.0ml与87%甘油溶液3.5ml，加水至10ml]，置水浴中3分钟，放冷，作为供试品溶液，取10μl，加至样品孔，照电泳法（通则0541第五法 考马斯亮蓝法染色）测定，计算高分子量尿激酶相对含量（%）。孙天霄等报道了采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，纤维蛋白平板法测定活力（生物化学杂志，1997，13（3）：344-349）。雷大卫等报道了采用考马斯亮蓝染色，SDS-PAGE染色区带的定量方法（贵阳医学院学报，1991，16（1）：39-42）。除此之外，祝一锋等报道了用Sephadex G100(超细)凝胶过滤法测定高分子量尿激酶比率：将尿激酶盐析或冻干后样品，用洗脱液溶解，制成浓度为3～8mg/ml的溶液，上样量为柱床体积的1%～2%,样品上样完毕，立即开始洗脱，流速控制在2ml/h左右，分管收集并记录流出液体积，同时检测流出液的UK活力和蛋白质浓度，由此计算H-UK和L-UK的分配系数Kav、比活和高分子尿激酶的比率（中国抗生素杂志，1998，23（5）：388-389）。但是，不管是考马斯亮蓝法还是凝胶过滤法，其操作步骤都十分繁琐，操作时间长，且精密度和准确度不足，重现性差。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种简单、快速、准确、重现性好的高效液相色谱法，可直接分离两种类型(高分子量为5400的H-UK和低分子量为3200的L-UK)的尿激酶组分，测定各自的比率，实现尿激酶样品的质量控制。
（1）本发明的尿激酶分子组分比的HPLC 检测方法，采用TSK-GEL系列凝胶色谱柱，柱长300-600mm，填料粒径 5-10μm；流动相由浓度为0.05-0.3mol/L，pH为2.8-5.0磷酸盐缓冲液组成，检测波长275-280nm；
（2）HPLC 检测方法具有定量准确、检测周期短等优点，是较为适于进行微量检测的方法之一。而要实现高分子量和低分子量尿激酶的HPLC单独定量检测就必须首先实现这两种物质之间的分离度R ≥ 1.5。经过研究发现，两种物质的分离度和流动相的组分，流动相的pH 值，流动相配比等多种因素相关，综合性考察各方面因素后得出上述检测方法，能够获得良好的分析结果。
（3）其中所述的磷酸盐缓冲液为《中华人民共和国药典》2015年版第四部，通则缓冲液部分记载的pH 值在2.8~5.0 范围内的磷酸盐缓冲液。
（4）作为优选方案，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L，缓冲盐浓度增大，导致尿激酶样品出峰时间延长，色谱峰展宽，分离度下降。
（5）作为优选方案，磷酸盐缓冲液的pH 值为2.8，用该pH 值的磷酸盐缓冲液组成的流动相，高低分子量尿激酶组分的分离效果相较于其他pH 值更优。
（6）作为优选方案，检测波长为279nm。选择该检测波长值，尿激酶组分的响应值高，无干扰。
（7）作为优选方案，流动相流速为0.5mL/min。流速过快会导致尿激酶组分太快出峰，分离度不好，过慢会导致峰形变宽而影响峰形，本发明的检测方法中0.5mL/min 的流速最为适合。
（8）作为优选方案，TSK-GEL系列凝胶色谱柱可以选择TSK-GEL 3000SW XL凝胶色谱柱；这种类型的色谱柱能够较好适用于本发明方法。
（9）作为优选方案，所述色谱柱内径为7.8mm，柱长为300mm，填料粒径为 5μm。尿激酶样品出峰时间适宜，峰形良好。
（10）作为优选方案，进样量为20μL，选择该进样量能够使尿激酶组分的响应高低适中，进一步增加检测方法的准确性。
（11）作为优选方案，还包括配制尿激酶样品溶液，注入色谱仪，进行HPLC 检测，记录色谱图，根据色谱峰峰面积计算供试样品中高分子量和低分子量尿激酶的分子组分比。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的尿激酶分子组分比的HPLC 检测方法，样品无需特殊处理，配制成一定浓度的样品溶液后，只需通过一次高效液相色谱检测，就能准确测定出尿激酶高低分子量组分的相对含量，操作方法简单易行，重现性好，准确度高，高分子量和低分子量尿激酶组分的分离度大于1.5，能够满足实际检测中尿激酶样品质量控制的需要。
附图说明
图1：1# 样品色谱图；
图2：2# 样品色谱图；
图3：3# 样品色谱图。
具体实施方式
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的技术方案，这些实施方式并不对本发明构成进一步限定。本领域技术人员根据现有知识对本发明进行等同替换或相应的逻辑改进，均属于本发明的范围。以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为美国戴安U3000；色谱柱为TSK gel G3000SW XL 7.8mm I.D.× 300mm；进样体积为20μl。当然，也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的凝胶色谱柱、以及其他进样体积，都能达到本发明的目的。
1.设备信息
色谱仪：戴安高效液相色谱仪U3000；
色谱柱：TSK gel G3000SW XL 7.8 mm I.D. × 300mm，5μm；
检测器：紫外检测器；
进样量：20μl；
柱温：室温。
2. 高效液相色谱法对尿激酶分子组分比检测方法考察
2.1 尿激酶样品溶液的配制
尿激酶样品溶液（3mg/mL）：精密称取尿激酶样品15mg，用纯化水溶解，定容至5mL。
2.2 缓冲溶液的配制
磷酸盐缓冲液：精密称取一定量的磷酸氢二钠，用纯化水溶解，用磷酸调pH值，得到一定浓度、一定pH的磷酸盐缓冲液。
2.3检测波长的确定
取尿激酶的试验液在紫外可见分光光度计上进行全波长扫描。结果表明，尿激酶在200nm和279nm有两处吸收峰，因为200nm处存在边缘吸收，因此最终选择279nm 作为HPLC的检测波长。
2.4流动相的选择
在流动相中，缓冲液的浓度，pH，流速等对于尿激酶高低分子量组分的分离都存在影响。
2.4.1 缓冲液浓度的选择
配制不同浓度的磷酸盐缓冲液作为流动相，将配制好的尿激酶样品溶液，各进样5 针比较，结果如表1所示。
表1：不同浓度的磷酸盐缓冲液的结果对比
缓冲液浓度（mol/L） 高分子量尿激酶保留时间（min） 低分子量尿激酶保留时间（min） 分离度（R）
0.05 17.557 18.893 1.62
0.1 17.770 19.013 1.44
0.2 19.193 20.217 1.18
0.3 19.760 20.590 1.02
通过数据可以看出，随着流动相中磷酸盐缓冲液浓度的增加，尿激酶组分的保留时间延长，分离度降低。因此，本实施例后续试验选择0.05 mol/L作为磷酸盐缓冲液的浓度。
2.4.2 缓冲液pH值选择
配制不同pH的磷酸盐缓冲液作为流动相，将配制好的尿激酶样品溶液，各进样 5 针比较，结果见表2。
表2：不同pH的磷酸盐缓冲液的结果对比
缓冲液pH值 高分子量尿激酶保留时间（min） 低分子量尿激酶保留时间（min） 分离度（R）
2.8 21.543 23.037 1.63
3 19.253 20.150 1.37
4 18.813 19.770 1.14
5 17.770 19.013 1.08
通过数据可以看出，随着磷酸盐缓冲液pH值的增大，尿激酶组分的保留时间缩短，分离度显著下降，考虑到色谱柱的耐受性，本实施例后续试验选择2.8作为磷酸盐缓冲液的pH值。
2.4.3 流速选择
配制0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH=2.8）作为流动相，采用不同的流速，将配制好的尿激酶样品溶液，各进样 5 针比较，结果见表3。
表3：不同流速的结果对比
流速（mL/min） 高分子量尿激酶保留时间（min） 低分子量尿激酶保留时间（min） 分离度（R）
0.4 21.857 23.577 1.64
0.5 17.470 18.853 1.62
0.6 14.580 15.733 1.58
0.7 12.497 13.487 1.55
通过数据可以看出，随着流速的增加，尿激酶组分的保留时间显著缩短，分离度有所下降，综合考虑时间因素和分离度，本实施例后续试验选择0.5 mL/min作为流动相的流速。

Claims (9)

1.一种尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，采用TSK-GEL系列凝胶色谱柱，柱长300-600mm，填料粒径 5-10μm；流动相由浓度为0.05-0.3mol/L，pH为2.8-5.0的磷酸盐缓冲液组成，检测波长275-280nm。
2.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，色谱柱为TSK-GEL 3000SW XL凝胶色谱柱。
3.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，所述色谱柱内径为7.8mm，柱长为300mm，填料粒径为 5μm。
4.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L。
5.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的pH 值为2.8。
6.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，检测波长为 279nm。
7.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，流动相流速为 0.5mL/min。
8.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，进样量为20μL。
9.根据权利要求1所述的尿激酶分子组分比的 HPLC 检测方法，其特征在于，还包括配制尿激酶样品溶液，注入色谱仪，进行HPLC 检测，记录色谱图，根据色谱峰峰面积计算供试样品中高分子量和低分子量尿激酶的分子组分比。
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