CN108220417B - 可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品及应用 - Google Patents

可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品及应用，包括阳性参考品、阴性参考品；所述阳性参考品包含来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150‑200bp区间内的DNA片段和DNA保护剂；所述阴性参考品包含有非来源于所述核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150‑200bp区间内的DNA片段和DNA保护剂；所述的TN1选自T21、T18、T13中的一种或几种；所述DNA保护剂包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐。本发明提供的质控品通过向每个参考品中加入保护剂，抑制了质控品中参考品的DNA降解，使其更稳定，更易保存，延长了有效期。

Description

可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品及应用
技术领域
本发明涉及产前诊断技术领域，特别是涉及可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品及应用。
背景技术
染色体非整倍体，是指细胞中染色体数目非正常配子染色体数目的整数倍，即细胞中某一条或几条染色体数目的增加或减少。人类染色体非整倍体的危害极其严重，是导致自发流产、胚胎停育、先天性出生缺陷、智力低下、生长发育迟缓、多发畸形的主要原因之一。常见的常染色体非整倍体疾病包括21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征,在新生儿中的发病率分别为1/800-1/600，1/7000-1/3500，1/6000-1/5000。
当前，染色体非整倍体引起的三体综合征缺乏有效的治疗手段。因此，通过产前筛查与产前诊断积极开展出生缺陷预防工作是实现优生优育和提高人口质量的重要保障。常用的筛查诊断方法包括传统的无创、有创产前诊断技术及无创产前基因检测技术。其中，传统的无创性产前诊断技术有遗传学超声检查、唐氏血清学筛查等方法。无创性检查，易于被孕妇及其家庭接受，但具有较高的漏检率。传统的有创性产前诊断方法包括羊水穿刺、绒毛取样、经皮脐血管穿刺术、植入前胚胎遗传学诊断、胎儿镜等。此类方法通过获取胎儿的羊水、绒毛、脐血或胎儿组织进行诊断，其检测准确率高，是进行染色体非整倍体产前诊断的金标准。但是这些侵袭性的产前诊断技术可能造成0.5％-1％流产风险。
由于传统方法和分子诊断方法的局限性，多年来科学家致力于寻找一种无创、经济、准确的产前诊断方法。1997年，Lo等人首次证明孕妇外周血血浆和血清中存在着稳定的胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)，后续研究证实这种游离DNA占全部碎片化DNA的10％-20％，这个发现为无创产前DNA检测技术开辟了新的道路。cffDNA在母体血浆中的含量与孕周存在一定的关系，胎儿cffDNA最早可出现在妊娠第4周的母体外周血中，当孕周大于10周时，几乎所有孕妇的外周血中都能检测到胎儿cffDNA。通常，cffDNA片段长度约为150-200bp，当胎儿染色体数目发生改变时，该染色体的cffDNA比例就会超出正常范围。因此，通过数据分析统计染色体DNA片段在血浆中的比例，可获得染色体数目信息。随着下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)的发展，其测序结果可分析出DNA片段的长度分布，进而将胎儿DNA与母体区分开来，且相对于传统测序技术具有通量高、成本低的特点，一次测序可以产生巨大数据量，使得单个核酸测序的成本则急剧下降，加速了cffDNA的研究进展。这种革命性的方法为全球无数的孕妇提供了无创性产前诊断的可能性。
无创产前诊断NIPT(Non-invasive Prenatal Testing)技术对母体外周血浆中的胎儿游离DNA进行测序，并将测序结果进行生物信息学分析，可以从中得到胎儿的遗传信息，进而判断胎儿是否患有染色体非整倍体疾病。相比传统诊断方式，NIPT技术具有以下优势：①检出率高：相比绒毛取样、羊水穿刺、血清学筛查等传统技术，NIPT准确性高，且漏诊率更低，风险更低；②操作简便：仅需抽取适量孕妇外周血，无需高难度的穿刺手术便可获得检测材料；③时间周期：检测周期短，一般一周左右出具准确检测报告，为孕妇后续进一步确诊预留充足时间；④检测全面：除了能同时检测21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征，还能检测XXY(克兰费尔特综合征)和XO(特纳综合征)等性染色体整倍体缺陷和大片段非整倍体基因缺陷筛查；⑤适用人群广：12-24孕周孕妇均可检测，检测结果不受孕妇年龄、种族等影响。NIPT因无创、安全、早期、准确、快速的特点得到普遍认可和推广。
目前，高通量基因测序检测21、18、13三体综合征试剂盒性能评价用的质控品普遍存在核酸降解严重的问题，远远不能满足实际操作中对质控品有效期的需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种核酸降解少的可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，该质控品有效期长，能够满足实际操作中对质控品有效期的需求。
一种可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，包括阳性参考品、阴性参考品；所述阳性参考品包含来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段和DNA保护剂；
所述阴性参考品包含有非来源于所述核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段和DNA保护剂；
所述DNA保护剂包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐。
在其中一些实施例中，所述金精三甲酸铵盐在所述参考品中的浓度为100-500μM、所述甘氨酸在所述参考品中的浓度为80-180mM、所述苯丁抑制素盐酸盐在所述参考品中的浓度为20-60nM。
在其中一些实施例中，所述金精三甲酸铵盐在所述参考品中的浓度为200-400μM，所述甘氨酸在所述参考品中的浓度为80-120mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述参考品中的浓度为30-50nM。
在其中一些实施例中，所述金精三甲酸铵盐在所述参考品中的浓度为250μM，所述甘氨酸在所述参考品中的浓度为100mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述参考品中的浓度为40nM。
在其中一些实施例中，非来源于所述核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段，选自如下情况中的至少一种：
核型正常孕妇血浆游离DNA；
核型分析结果为47、TN2人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；所述的TN2选自T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T14、T15、T16、T17、T19、T20、T22、XXY、X0、XXX、XYY中一种或几种。
在其中一些实施例中，所述的TN1选自T21、T18、T13中的一种或几种。
在其中一些实施例中，还包括检测限参考品、微缺失微重复参考品、嵌合体参考品、重复性参考品；
所述检测限参考品包含来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；
所述微缺失微重复参考品包含来自染色体微缺失微重复人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；
所述嵌合体参考品包含来自TN1嵌合体的人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；
所述重复性参考品来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段。
在其中一些实施例中，所述检测限参考品、微缺失微重复参考品、嵌合体参考品、重复性参考品中一种或几种参考品还含有所述DNA保护剂。
本发明还公开了包括上述的质控品的试剂盒。
本发明还公开了上述的质控品在染色体非整倍体检测试剂盒的质量鉴定中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的质控品通过向每个参考品中加入金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐，并进一步控制金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸加入后在质控品中的浓度分别为100-500μM、80-180mM、20-60nM，抑制了质控品中DNA降解，使其更稳定，更易保存，延长了有效期。
附图说明
图1为A1组DNA检测结果图；
图2为B1组DNA检测结果图；
图3为A2组DNA检测结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的无创产前筛查胎儿染色体非整倍体检测试剂盒的质控品作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的5条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、可稳定保存的染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒的质控品及其 制备
本实施例提供成套的可稳定保存的染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒的质控品，不仅包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品，还包括微缺失微重复参考品、嵌合体参考品、重复性参考品。
1、阳性参考品及其制备
阳性参考品用于质控待质控试剂盒的阳性检出率，其制备方法包括如下步骤：
①DNA提取：分别选取并提取染色体核型结果为47的T21人基因组DNA、染色体核型结果为47的T18人基因组DNA、染色体核型结果为47的T13人基因组DNA；该步骤可采用现有常规提取方法，例如采用市售核酸提取和纯化试剂盒(磁珠法)依照其说明书进行DNA的提取；
②DNA扩增：分别对步骤①所提取的人基因组DNA进行扩增得到扩增产物；该步骤采用的扩增条件为：95℃5min；95℃15s、55℃30s、72℃1min，10个循环，4℃保存)；本步骤可基于sigma WGA 4试剂盒实现；
③扩增产物浓度测定：利用Qubit2.0及Qubit dsDNA HS Assay Kit对所扩增的DNA产物进行浓度测定；
④DNA打断及回收：利用超声波破碎仪Bioruptor Pico将DNA打断，利用AgencourtAMPure XP PCR PURIFICATION磁珠依照其说明书回收大小为150bp-200bp区间的DNA片段；
DNA打断的具体操作包括：超声30s然后停止超声放置30s，算是一个循环，每个扩增产物进行十个循环(共计10min)。十个循环完成后涡旋振荡继续按照前述步骤进行十个循环，反复三次；但本申请的DNA打断的方式不限于此，也可以采用生物学方式，例如Fragmentase进行酶切使扩增产物片段化；
通过该步骤，获得了如下片段：来源于染色体核型结果为47的T21人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段、来源于染色体核型结果为47的T18人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段、来源于染色体核型结果为47的T13人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段；
⑤分离外周血血浆：分离染色体核型分析结果为46，XX的正常未孕女性的外周血血浆，利用血浆游离DNA提取试剂盒(磁珠法)依照其说明书提取外周血浆中游离的DNA，使用Qubit2.0及Qubit dsDNA HS Assay Kit测定该DNA的浓度；
⑥DNA片段与外周血血浆混合:将上述打断回收的大小为150bp-200bp区间的DNA片段以10％的质量百分比与上述正常未孕女性的外周血血浆混合，得到混合物；
⑦参考品制备：对上述混合物中加入金精三甲酸铵盐(终浓度控制在100-500μM)、甘氨酸(终浓度控制在80-180mM)、苯丁抑制素盐酸盐(终浓度控制在20-60nM)制备阳性参考品，具体地，向步骤⑥所得混合物Ⅰ中加入金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐，获得T21阳性参考品，其中所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐在所得T21阳性参考品中的浓度分别为250μM、100mM、40nM；向步骤⑥所得混合物Ⅱ加入金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐，获得T18阳性参考品，其中所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐在所得T18阳性参考品中的浓度分别为250μM、100mM、40nM；向步骤⑥所得混合物Ⅲ加入金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐，获得T13阳性参考品，其中所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐在所得T13阳性参考品中的浓度分别为250μM、100mM、40nM。
2、阴性参考品及其制备：
阴性参考品用于质控待质控试剂盒的阴性检出率。本实施例提供的阴性参考品包括核型正常阴性参考品、核型非整倍体(TN)阴性参考品。
1)核型正常阴性参考品为含有核型正常孕妇血浆游离DNA的核型正常未孕女性血浆，其制备如下：
①DNA提取：选取并提取核型正常胎儿孕妇血浆游离DNA；后续步骤(②DNA扩增、③扩增产物浓度测定、④DNA打断及回收、⑤分离外周血血浆、⑥DNA片段与外周血血浆混合、⑦参考品制备)同上述“1、阳性参考品及其制备”。
2)核型非整倍体阴性参考品的制备：
①DNA提取：分别选取并提取染色体核型结果为47，TN(TN可为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T14、T15、T16、T17、T19、T20、T22、XXY、X0、XXX、XYY)人基因组DNA，对步骤①所得上述每种(TN)染色体核型结果的人基因组DNA进行的后续步骤(②DNA扩增、③扩增产物浓度测定、④DNA打断及回收、⑤分离外周血血浆、⑥DNA片段与外周血血浆混合、⑦参考品制备)同上述“1、阳性参考品及其制备”。
本实施例提供成套的阴性参考品，包括核型正常阴性参考品、核型非整倍体阴性参考品(23种)，在实际使用的过程中，质控品中的阴性参考品的种类选n，n是整数且满足1≤n≤24。
3、检测限参考品及其制备
检测限参考品用于质控待质控试剂盒的检测限，本实施例提供的检测限参考品包括T21检测限参考品、T18检测限参考品、T13检测限参考品。
T21检测限参考品包括T21检测限参考品a、T21检测限参考品b，其中T21检测限参考品a中源于染色体核型结果为47的T21人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数为3.5％，T21检测限参考品b中源于染色体核型结果为47的T21人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数为5％。T21检测限参考品a、T21检测限参考品b的制备均与“1、阳性参考品及其制备”操作相同，仅是150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数的改变。
T18检测限参考品包括T18检测限参考品a、T18检测限参考品b，其中T18检测限参考品a中源于染色体核型结果为47的T18人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数为3.5％，T18检测限参考品b中源于染色体核型结果为47的T18人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数为5％。T18检测限参考品a、T18检测限参考品b的制备均与“1、阳性参考品及其制备”操作相同，仅是150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数的改变。
T13检测限参考品包括T13检测限参考品a、T13检测限参考品b，其中T13检测限参考品a中源于染色体核型结果为47的T13人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数为3.5％，T13检测限参考品b中源于染色体核型结果为47的T13人基因组DNA扩增产物的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数为5％。T13检测限参考品a、T13检测限参考品b的制备均与“1、阳性参考品及其制备”操作相同，仅是150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数的改变。
待质控试剂盒对质量分数为3.5％的参考品检出率不低于50％，对质量分数为5％的参考品全部检出。
4、微缺失微重复参考品及其制备
微缺失微重复参考品用于质控待质控试剂盒对微重复微缺失样本的检出准确率。本实施例提供的微缺失微重复参考品包括Y染色体微缺失微重复参考品、18号染色体微缺失微重复参考品、3号染色体微缺失微重复参考品、5号染色体微缺失微重复参考品、15号染色体微缺失微重复参考品、8号染色体微缺失微重复参考品、16号染色体微缺失微重复参考品、1号染色体微缺失微重复参考品。
Y染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在Y染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成Y染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
1号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在1号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成1号染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
3号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在3号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成3号染色体微缺失微重复参考品。
5号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在5号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成5号染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
8号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在8号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成8号染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
15号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在15号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成15号染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
16号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在16号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成16号染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
18号染色体微缺失微重复参考品的制备为：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取存在18号染色体微缺失微重复的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成18号染色体微缺失微重复参考品，其中步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数需调整为5％。
微缺失微重复参考品符合率满足微缺失重复参考品中的染色体中20Mb以上的微缺失重复样本全部检出，不得检出T21、T18、T13阳性。
本实施例提供的微缺失微重复参考品包括8种，在实际使用的过程中，质控品中的微缺失微重复参考品的种类n是整数且满足1≤n≤8。
5、嵌合体参考品及其制备
嵌合体参考品用于质控待质控试剂盒的嵌合体样本的检出准确率。本实施例提供的嵌合体参考品包括T21嵌合体参考品、T18嵌合体参考品和T13嵌合体参考品。
1)T21嵌合体参考品包括T21-3嵌合体参考品、T21-7嵌合体参考品。T21-3嵌合体参考品的制备包括：参照“1、阳性参考品及其制备”的步骤①提取嵌合比例为30％的T21嵌合体的人基因组DNA，然后根据“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦制成T21-3嵌合体参考品。T21-7嵌合体参考品的制备除将“1、阳性参考品及其制备”步骤①提取人基因组DNA的种类替换为嵌合比例为70％的T21嵌合体的人基因组DNA之外，其他操作同“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦。
2)T18嵌合体参考品包括T18-3嵌合体参考品、T18-7嵌合体参考品。T18-3嵌合体参考品的制备除将“1、阳性参考品及其制备”步骤①提取人基因组DNA的种类替换为嵌合比例为30％的T18嵌合体的人基因组DNA之外，其他操作同“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦。T18-7嵌合体参考品的制备除将“1、阳性参考品及其制备”步骤①提取人基因组DNA的种类替换为嵌合比例为70％的T18嵌合体的人基因组DNA之外，其他操作同“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦。
3)T13嵌合体参考品包括T13-3嵌合体参考品、T13-7嵌合体参考品。T13-3嵌合体参考品的制备除将“1、阳性参考品及其制备”步骤①提取人基因组DNA的种类替换为嵌合比例为30％的T13嵌合体的人基因组DNA之外，其他操作同“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦。T13-7嵌合体参考品的制备除将“1、阳性参考品及其制备”步骤①提取人基因组DNA的种类替换为嵌合比例为70％的T13嵌合体的人基因组DNA之外，其他操作同“1、阳性参考品及其制备”的步骤②至步骤⑦。
嵌合体参考品满足70％嵌合体参考品全部检出，30％嵌合体可为检出或者未检出。
6、重复性参考品及其制备
重复性参考品用于质控待质控试剂盒的重复性。本实施例提供的重复性参考品包括T23重复性参考品、T18重复性参考品、T13重复性参考品。
T23重复性参考品的制备：除需将步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数调整为7％之外，其余操作均同“1、阳性参考品及其制备”。
T18重复性参考品：除需将步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数调整为7％之外，其余操作均同“1、阳性参考品及其制备”。
T13重复性参考品：除需将步骤⑥中的150bp-200bp区间的DNA片段的质量分数调整为7％之外，其余操作均同“1、阳性参考品及其制备”。
实施例2和实施例3
实施例2是实施例1的变化例，变化之处仅在于质控品各参照品所含金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐的浓度分别为100μm、80mM、20nM。
实施例3是实施例1的变化例，变化之处仅在于质控品各参考品所含金精三甲酸铵盐、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐的浓度分别为500μm、180mM、60nM。
实施例4、可稳定保存的染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒的质控品的准 确性、稳定性验证及降解情况
1、准确性
为确定实施例1的可稳定保存的染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒的质控品的准确性，按照常规无创产前筛查胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(可逆末端终止测序法)说明书，使用实施例1的无创产前筛查胎儿染色体非整倍体检测试剂盒的质控品。对整套质控品进行测序分析，结果如表1。
根据表1，该质控品分别符合相对应的核型结果，且重复性参考品％chrN值的变异系数小于0.5％。
表1
Figure BDA0001530970130000141
Figure BDA0001530970130000151
参照上述操作的基础上，经多次重复试验验证，实施例2和实施例3的准确性与实施例1相同。
2、稳定性
为确定实施例1的可稳定保存的染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒的质控品的稳定性，随机抽取三套实施例1的质控品，按照无创产前筛查胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(可逆末端终止测序法)说明书，使用实施例1的质控品。结果如表2所示。
根据表2，三套质控品的检测结果相同，说明三套成套质控品之间的检测结果无差异，且检测结果完全正确。
由于检测的三套质控品是随机抽取的，根据检测结果可推知其他成套质控品之间的检测结果也是一致的，表明该成套质控品性能稳定，且三套重复性参考品％chrN值的变异系数均小于0.5％。
表2
Figure BDA0001530970130000161
Figure BDA0001530970130000171
参照上述操作的基础上，经多次重复试验验证，实施例2和实施例3的稳定性与实施例1相同。
3、降解情况
为确定实施例1的加入金精三甲酸铵、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐的质控品的贮存稳定性及150bp-200bp区间的DNA片段DNA的降解情况，本实施例设置如下比较组：
(1)A1组和B1组比较
A1组：将实施例1成套质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后置于37℃下存放；
B1组：参照实施例1质控品的制备方法制备B1质控品，该B1质控品与实施例1质控品的区别仅在于所含每种参考品均未加入金精三甲酸铵、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐，将比较质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后置于37℃下存放。
通过Agilent 2100生物分析仪分别测定A1组、B1组DNA片段大小，依此判断质控品的贮存稳定性及降解情况。
检测结果显示，B1组没有150bp-200bp的DNA片段，A1组有150bp-200bp的DNA片段，说明B1组的DNA片段完全降解，未加入保存剂的质控品的稳定性差，易降解。
(2)A1组和A2组比较
A1组：将实施例1成套质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后置于37℃下存放；
A2组：将实施例1成套质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后置于-80℃下存放；
使用Agilent 2100生物分析仪分别测定A1组、A2组DNA片段大小。
结果显示，两组DNA片段均在150bp-200bp之间，说明加入的DNA保存剂具有维持质控品的稳定，防止质控品降解，延长质控品的有效使用期的作用。
上述A1、A2、B1于存放2周时进行取样检测，结果见图1、图2、图3。
(3)A2组、A3组、A4组、B2组、B3组、B4组、B5组
A2组：将实施例1成套质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃；
A3组：将实施例2成套质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃；
A4组：将实施例3成套质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃；
B2组：参照实施例1质控品的制备方法制备B2质控品，该B2质控品与实施例1质控品的区别仅在于所含每种参考品所含金精三甲酸铵、甘氨酸、苯丁抑制素盐酸盐的浓度分别为20μM金精三甲酸铵盐、200mM甘氨酸、15nM苯丁抑制素盐酸盐，将B2质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃。
B3组：参照实施例1质控品的制备方法制备B3质控品，该B3质控品与实施例1质控品的区别仅在于所含每种参考品只有100mM的甘氨酸、40nM的苯丁抑制素盐酸盐，将B3质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃。
B4组：参照实施例1质控品的制备方法制备B4质控品，该B4质控品与实施例1质控品的区别仅在于甘氨酸被半胱氨酸代替，将B4质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃；
B5组：参照实施例1质控品的制备方法制备B4质控品，该B4质控品与实施例1质控品的区别仅在于甘氨酸被ε-聚赖氨酸代替，将B4质控品的所有参考品混合在一起形成混合物，然后存放在-80℃。
上述各组在存放的过程中进行定期检测，检测DNA片段的降解情况，结果显示，A1和A2组在存放3年6个月的情况下DNA片段降解不明显，这说明质控品的有效期为3年6个月；跟A1、A2组相比，A3、A4组质控品的有效期分别为34个月、36个月，说明加入250μM的金精三甲酸铵盐、100mM的甘氨酸、40nM的苯丁抑制素盐酸盐DNA保存效果最佳。B2、B3、B4、B5组质控品的有效期分别为20个月、18个月、27个月、27个月，显著降低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，其特征在于，包括阳性参考品、阴性参考品；
所述阳性参考品包含来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段和DNA保护剂；
所述阴性参考品包含有非来源于所述核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段和DNA保护剂；
所述DNA保护剂由金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐组成；
所述金精三甲酸铵盐在所述参考品中的浓度为200-400μM、所述甘氨酸在所述参考品中的浓度为80-120mM、所述苯丁抑制素盐酸盐在所述参考品中的浓度为30-50nM；
所述的TN1选自T21、T18、T13中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，其特征在于，所述金精三甲酸铵盐在所述参考品中的浓度为250μM，所述甘氨酸在所述参考品中的浓度为100mM，所述苯丁抑制素盐酸盐在所述参考品中的浓度为40nM。
3.根据权利要求1或者2所述的可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，其特征在于，非来源于所述核型分析结果为47、TN1人基因组DNA的扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段，选自如下情况中的至少一种：
核型正常孕妇血浆游离DNA；
核型分析结果为47、TN2人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；所述的TN2选自T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T14、T15、T16、T17、T19、T20、T22、XXY、X0、XXX、XYY中一种或几种。
4.根据权利要求1或者2所述的可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，其特征在于，还包括检测限参考品、微缺失微重复参考品、嵌合体参考品、重复性参考品；
所述检测限参考品包含来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；
所述微缺失微重复参考品包含来自染色体微缺失微重复人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；
所述嵌合体参考品包含来自TN1嵌合体的人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段；
所述重复性参考品来自核型分析结果为47、TN1人基因组DNA扩增产物的150-200bp区间内的DNA片段。
5.根据权利要求4所述的可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，其特征在于，所述检测限参考品、微缺失微重复参考品、嵌合体参考品、重复性参考品中一种或几种参考品还含有所述DNA保护剂。
6.根据权利要求5所述的可稳定保存的染色体非整倍体检测试剂盒的质控品，其特征在于，所述检测限参考品包括T21检测限参考品、T18检测限参考品、T13检测限参考品；
所述微缺失微重复参考品包括Y染色体微缺失微重复参考品、18号染色体微缺失微重复参考品、3号染色体微缺失微重复参考品、5号染色体微缺失微重复参考品、15号染色体微缺失微重复参考品、8号染色体微缺失微重复参考品、16号染色体微缺失微重复参考品、1号染色体微缺失微重复参考品；
所述嵌合体参考品包括T21嵌合体参考品、T18嵌合体参考品和T13嵌合体参考品；
所述重复性参考品包括T23重复性参考品、T18重复性参考品、T13重复性参考品。
7.包括权利要求1至6任一项所述的质控品的试剂盒。
8.权利要求1至6任一项所述的质控品在染色体非整倍体检测试剂盒的质量鉴定中的应用。
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