CN108196022A - 一种测定消毒后废水中消毒副产物联合生物毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定消毒后废水中消毒副产物联合生物毒性的方法，属于毒性检测领域。由于目前检测手段的限制，无法识别出所有的消毒副产物并将其分离出来。由于消毒副产物的毒性评价方法不健全，针对此特点本发明选用斑马鱼作为模式生物，通过斑马鱼体内的抗氧化酶变化情况来确定消毒前后污水的亚急性毒性，最后通过消毒前后污水的毒性来确定水体中消毒副产物的综合生物毒性。操作简单，可定量化评价。

Description

一种测定消毒后废水中消毒副产物联合生物毒性的方法
技术领域
本发明涉及一种测定消毒后废水中消毒副产物联合生物毒性的方法，属于毒性检测领域。
背景技术
再生水回用是一种有效的缓解水资源短缺的途径，其中污水厂二级出水是主要的回用水之一。消毒过程通常作为再生水回用的最后一道工序，虽然消毒可以去除病原体、微生物等，但同时也会生成大量的消毒副产物(DBPs)。研究表明DBPs具有致癌性、遗传毒性和细胞毒性等特征。所以有必要对DBPs的毒理学作用机制及作用效果进行研究。
对于DBPs的毒性研究多集中于单一DBP的毒性，但污水中包含多种DBPs，受到分析检测手段的限制无法将所有DBPs逐一检测、分离，通过配水的方法实现毒性测试。总有机卤(TOX)可以代表卤代消毒副产物的总体水平，所以本发明用TOX代表总DBPs。目前对于DBPs的毒性作用机制主要采用发光细菌抑制率、斑马鱼胚胎致畸率来进行毒性实验，但是以上指标均为急性毒性，且由于生物种之间的差异，用来模拟DBPs作用于人体的效果缺乏可信性，因此需要寻找新方法来评价污水中DBPs的生物毒性。斑马鱼具有个体小、易于大规模养殖、繁殖率高、成本低等优点、且与人类基因有87％的相似度，所以本发明用幼年斑马鱼作为模式生物，通过对比消毒前后污水的生物毒性来测定DBPs的生物毒性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种评价消毒后废水中消毒副产物生物毒性的方法，是将驯养后的斑马鱼暴露在消毒前和消毒后的废水环境中，暴露15d时测定消毒前后废水中的TOX，以TOX作为评价消毒副产物总量的指标，并通过对比斑马鱼体内抗氧化酶指标来评价消毒副产物的生物毒性。
在本发明的一种实施方式中，所述抗氧化酶指标是指过氧化氢酶(CAT)活性和醛基(MDA)含量。
在本发明的一种实施方式中，所述驯养是将斑马鱼在脱氯自来水中驯养14d。
在本发明的一种实施方式中，所述消毒后废水是经过次氯酸钠消毒24h后加入终止剂硫代硫酸钠终止反应的污水。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)驯养斑马鱼；
(2)设置两组空白组：空白1将斑马鱼暴露在曝气24h后的脱氯自来水中，空白2将斑马鱼暴露在加入次氯酸钠24h后再加入终止剂的脱氯自来水中；设置两组暴露组：暴露组1将斑马鱼暴露在未消毒的废水中；暴露组2将斑马鱼暴露在次氯酸钠消毒24h后加入终止剂硫代硫酸钠的废水中；
(3)分别向各组中加入20条斑马鱼，于第15d测定暴露组1和暴露组2水体中TOX浓度，并测定斑马鱼体内的BCA蛋白含量，醛基(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性；
(4)总消毒副产物定量：消毒后废水中总DBPs浓度＝暴露组2和暴露组1的TOX差值，即(TOX暴露2-TOX暴露1)；
(5)判断消毒副产物的生物毒性：暴露组1的酶活指标相比空白1有显著差异，暴露组2酶活指标相比空白2有显著差异，且(CAT2-CAT空白2)相比(CAT1-CAT空白1)显著抑制，(MDA2-MDA空白2)相比(MDA1-MDA空白1)显著增加，则认为实验用水有亚急性生物毒性，反之无亚急性毒性。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)驯养斑马鱼：以平均体长1.93±0.2cm，平均体重0.25±0.05g的幼年斑马鱼为用于评估的生物，用曝气48h后的自来水驯养14d，水温为(25±1)℃，光暗比为12h:12h，溶解氧(DO)保持在7.0mg.L-1以上，驯养期间斑马鱼死亡率小于5％方可用于下一步骤；驯养期间每天喂食一次，暴露在废水前24h停止喂食，暴露在废水的0～15天内不喂食；
(2)亚急性毒性测试：设置两组空白组，空白1实验用水为曝气24h后的脱氯自来水，空白2实验用水为加入次氯酸钠24h后再加入终止剂的脱氯自来水；设置两组暴露组，暴露组1实验用水为未消毒的废水；暴露组2为次氯酸钠消毒24h后加入终止剂硫代硫酸钠的废水；实验时间为15d；
(3)于第15d测定暴露组1和暴露组2水体中TOX浓度，并测定斑马鱼体内的BCA蛋白含量，醛基(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性；消毒后废水中总DBPs浓度为暴露组2和暴露组1的TOX差值(TOX暴露2-TOX暴露1)；
(4)判断消毒副产物的生物毒性的判据为：暴露组1的酶活指标相比空白1有显著差异，暴露组2酶活指标相比空白2有显著差异，且(CAT2-CAT空白2)相比(CAT1-CAT空白1)显著抑制，(MDA2-MDA空白2)相比(MDA1-MDA空白1)显著增加，则认为实验用水有亚急性生物毒性，反之无亚急性毒性。
在本发明的一种实施方式中，所述废水采用次氯酸钠消毒，反应时间24h；反应温度25℃；NaClO投加量按照Cl：DOC＝5:1投加；24h后测定余氯，按照摩尔比120％投加硫代硫酸钠(Na2S2O3)终止氯化反应。
本发明还要求保护所述评价方法在环境领域的应用。
本发明的有益效果，废水经过消毒后产生了大量的消毒副产物，但是由于目前检测手段的限制，无法将所有DBP分离出来分别进行毒性评价。所以废水中DBPs的生物毒性评价一直是一个空缺。本发明选用斑马鱼作为模式生物，通过斑马鱼体内的抗氧化指标(CAT酶活和MDA含量)变化情况来确定污水的亚急性毒性，暴露组1去掉空白1代表了污水本身的毒性；暴露组2去掉空白2代表了污水本身的毒性加上新生成DBPs的毒性；(暴露组2-空白2)与(暴露组1-空白1)之间的毒性差异就代表了DBPs的总体毒性。可定量化评价。
附图说明
表1为消毒前后二级出水中不同实验组TOX含量；
图1为第15d时二级出水消毒前后对斑马鱼体内CAT活性的影响；注：不同字母表示不同暴露组的显著性差异(P<0.05)；
图2为第15d时二级出水消毒前后对斑马鱼体内MDA含量的影响；注：不同字母表示不同暴露组的显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
实施例1利用斑马鱼作为模式生物测定消毒后MBR工艺出水中消毒副产物的生物毒性
实验用水为无锡某城镇污水处理厂二级出水，工艺流程为厌/缺/好-膜生物反应器(AAO-MBR)。取回的水样立即用0.45μm的滤膜过滤，常规指标在24h内测定完毕。
(1)选用NaClO作为消毒剂对污水进行消毒，消毒前将NaClO配置成质量浓度为5g/L的储备液置于棕色瓶中避光待用。消毒实验在不透光的密封聚乙烯塑料桶中进行。反应时间为24h；反应温度为25℃；消毒剂投加量为Cl：DOC＝5:1。24h后测定余氯，按照摩尔比120％投加硫代硫酸钠(Na2S2O3)终止氯化反应。
(2)选择平均体长1.93±0.2cm，平均体重0.25±0.05g的幼年斑马鱼，用曝气48h后的自来水驯养14d，水温为(25±1)℃，光暗比为12h:12h，溶解氧(DO)保持在7.0mg/L以上，驯养期间斑马鱼死亡率小于5％方可用于实验。驯养期间每天喂食一次，及时清除粪便及食物残渣。为了防止食物对实验的影响，实验前24h停止喂食，实验期间不喂食。
预实验：设置A、B、C和D四个实验组，A组实验用水为未消毒的二级出水；B组实验用水为消毒后的二级出水；C组为空白对照1，实验用水为曝气48h后的自来水；D组为空白对照2，向曝气48h后的自来水中投加与B组一样计量的NaClO，反应24h后测定余氯，然后按照摩尔比120％投加Na2S2O3终止氯化反应，反应后的自来水作为D组实验用水。每组设置3个平行样。每组中随机投入6条幼年斑马鱼，实验时间为96h，采用静态置换法每天定时置换二分之一的实验用水，每12h记录死亡数。96h后并未观察到任何一组斑马鱼死亡，因此，消毒前后污水对幼年斑马鱼均无急性毒性。
亚急性毒性实验：同样设置A、B、C和D四组，实验装置为25cm×30cm×40cm的玻璃鱼缸，有效容积25L。A组实验用水为二级出水，设置A1、A2和A3实验组，体积分数分别为25％、50％和100％；B组实验用水为消毒后的二级出水，设置B1、B2和B3实验组，体积分数同A组(NaClO投加量按照Cl:DOC＝5:1)；C组空白对照1和D组空白对照2实验用水同预实验。7个鱼缸中每缸随机投入50条幼年斑马鱼，实验周期为15d，采用静态置换法每天置换二分之一的实验用水，分别于1d、2d、3d、6d、10d和15d测定斑马鱼体内的BCA蛋白含量、CAT活性、MDA含量。
表1为消毒前后二级出水中TOX测定结果，因为二级出水中DBPs种类繁多，故以TOX代表卤代DBPs的整体情况。A1、A2和A3组TOX浓度分别(0.14±0.03)×106μg/L、(0.23±0.04)×106μg/L和(0.51±0.07)×106μg/L，均低于国家再生水利用景观环境用水水质标准；但B1、B2和B3组TOX浓度分别为(9.33±0.75)×106μg/L、(14.24±0.92)×106μg/L和(32.73±1.28)×106μg/L，远超过城市污水再生利用标准。
如图1所示，当暴露15d时，A、B两组CAT活性均受到显著抑制，是由于污染物质对斑马鱼的抗氧化系统造成了损伤；且B组相比A组显著降低，主要是由于B组水体中存在大量的DBPs类物质，加剧了抗氧化损伤。随着体积分数的增加，B组相比A组的CAT抑制率越高，(CATA-CAT空白1)-(CATB-CAT空白2)/(CATA-CAT空白1)分别为9.49％、15.47％和29.21％，与TOX的浓度呈正相关，相关系数为0.97。
如图2所示，当暴露15d时，A、B两组MDA含量均受到显著诱导，是由于污染物质使斑马鱼受到了脂质过氧化损伤；且B组相比A组更显著，主要是由于B组水体中存在大量的DBPs类物质，加剧了抗氧化损伤。随着体积分数的增加，B组相比A组的MDA诱导率越高，(MDAA-MDA空白1)-(MDAB-MDA空白2)/(MDAA-MDA空白1)分别为28.21％、73.74％和104.68％，与TOX的浓度呈正相关，相关系数为0.93。说明随着体积分数的增加，生成的DBPs越多，对斑马鱼的生物毒性越大。
表1
注：体积分数指污水的体积分数。

Claims (8)

1.一种评价消毒后废水中消毒副产物生物毒性的方法，其特征在于，将驯养后的斑马鱼暴露在消毒前和消毒后的废水环境中，暴露12～15d时测定消毒前后废水中的总有机卤(TOX)，以TOX作为评价消毒副产物总量的指标，并通过对比斑马鱼体内抗氧化酶指标来评价消毒副产物的生物毒性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗氧化酶指标是指过氧化氢酶活性和醛基含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述驯养是将斑马鱼在脱氯自来水中驯养14d。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒后废水是经过次氯酸钠消毒24h后加入终止剂硫代硫酸钠终止反应的污水。
5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)驯养斑马鱼；
(2)设置两组空白组：空白1将斑马鱼暴露在曝气24h后的脱氯自来水中，空白2将斑马鱼暴露在加入次氯酸钠24h后再加入终止剂的脱氯自来水中；设置两组暴露组：暴露组1将斑马鱼暴露在未消毒的废水中；暴露组2将斑马鱼暴露在次氯酸钠消毒24h后加入终止剂硫代硫酸钠的废水中；
(3)于第15d测定暴露组1和暴露组2水体中TOX浓度，并测定斑马鱼体内的BCA蛋白含量，醛基(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性；
(4)总消毒副产物定量：消毒后废水中总DBPs浓度＝暴露组2和暴露组1的TOX差值，即(TOX暴露2-TOX暴露1)；
(5)判断消毒副产物的生物毒性：暴露组1的酶活指标相比空白1有显著差异，暴露组2酶活指标相比空白2有显著差异，且(CAT2-CAT空白2)相比(CAT1-CAT空白1)显著抑制，(MDA2-MDA空白2)相比(MDA1-MDA空白1)显著增加，则认为实验用水有亚急性生物毒性，反之无亚急性毒性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)驯养斑马鱼：以平均体长1.93±0.2cm，平均体重0.25±0.05g的幼年斑马鱼为用于评估的生物，用曝气48h后的自来水驯养14d，水温为(25±1)℃，光暗比为12h:12h，溶解氧(DO)保持在7.0mg.L-1以上，驯养期间斑马鱼死亡率小于5％方可用于下一步骤；驯养期间每天喂食一次，暴露在废水前24h停止喂食，暴露在废水的0～15天内不喂食；
(2)亚急性毒性测试：设置两组空白组，空白1实验用水为曝气24h后的脱氯自来水，空白2实验用水为加入次氯酸钠24h后再加入终止剂的脱氯自来水；设置两组暴露组，暴露组1实验用水为未消毒的废水；暴露组2为次氯酸钠消毒24h后加入终止剂硫代硫酸钠的废水；实验时间为15d；
(3)分别向各组中加入20条斑马鱼，于第15d测定暴露组1和暴露组2水体中TOX浓度，并测定斑马鱼体内的BCA蛋白含量，醛基含量和过氧化氢酶活性；消毒后废水中总DBPs浓度为暴露组2和暴露组1的TOX差值(TOX暴露2-TOX暴露1)；
(4)判断消毒副产物的生物毒性的判据为：暴露组1的酶活指标相比空白1有显著差异，暴露组2酶活指标相比空白2有显著差异，且(CAT2-CAT空白2)相比(CAT1-CAT空白1)显著抑制，(MDA2-MDA空白2)相比(MDA1-MDA空白1)显著增加，则认为实验用水有亚急性生物毒性，反之无亚急性毒性。
7.根据权利要求1、4～7任一所述的方法，其特征在于，所述废水采用次氯酸钠消毒，反应时间24h；反应温度25℃；NaClO投加量按照Cl：DOC＝5:1投加；24h后测定余氯，按照摩尔比120％投加硫代硫酸钠终止氯化反应。
8.权利要求1～7任一所述方法在环境领域水体评价方面的应用。
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