CN108192877A - 一种蛋氨酸亚砜氧化酶mical1突变蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用，通过将大量癌症患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1的突变蛋白，根据该人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为癌症的基因诊断提供指引作用，实现癌症的早诊断、早发现和相关治疗。

Description

一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用。
背景技术
蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1是目前发现的可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。它不仅可以在细胞内发挥清除氧化因素的作用，还可以对已经发生蛋白质氧化进行有效修复，增加它的水平和活性可以延长多种生物的寿命。
人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1发生突变会对人类健康造成影响，研究发现，在对某些癌症(该癌症包括肺癌、肝癌、胰腺癌和白血病)患者的外周血进行基因测序的过程中，均发现患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1发生了突变，因此，对人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变的检测对判断人体是否患有癌症具有一定的指引作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用。
本发明技术方案包括：
第一方面，提供一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
第二方面，提供一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1的突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，提供一种基因芯片，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据所述人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的核苷酸序列，与人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。
优选地，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
第四方面，提供一种特异性识别人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的单克隆抗体，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
第五方面，提供一种用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
优选地，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
第六方面，提供一种基于上述任一所述ELISA试剂盒检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的方法，包括：
a、使用所述包被缓冲液对上述单克隆抗体进行稀释，并将稀释后的所述单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育；
b、使用所述样品稀释液将检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育；
e、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育，并加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。
优选地，进一步包括：空白对照实验。
本发明提供了一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用，将大量癌症患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1的突变蛋白，根据该人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为癌症的基因诊断提供指引作用，实现癌症的早诊断、早发现和相关治疗。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明实施例一提供的一种比对结果示意图；
图2是本发明实施例一提供的一种基因芯片布局图；
图3是本发明实施例二提供的一种显色结果示意图；
图4是本发明实施例二提供的另一种显色结果示意图；
图5是本发明实施例五提供的为蛋白含量的标准曲线；
图6是本发明实施例五提供的Western blot检测结果示意图；
图7是本发明实施例六提供的为蛋白含量的标准曲线；
图8是本发明实施例六提供的Western blot检测结果示意图；
图9是本发明实施例七提供的为蛋白含量的标准曲线；
图10是本发明实施例七提供的Western blot检测结果示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、基因芯片的制备
首先，可以根据申请号为“201710429915.8”、专利名称为“一种突变蛋白的检测方法及装置”的中国发明专利中描述的检测方法，确定出人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；相应地，根据该编码基因确定出人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其次，根据人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其编码基因，按照如下方式实现基因芯片的制备。
1、核苷酸探针的设计
(1)核苷酸探针的设计：核苷酸探针根据人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的核苷酸序列，与人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确定，并根据如下探针的设计原则，设计出针对人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的特异性的核苷酸探针。
其中，核苷酸探针设计的原则如下：
①核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值，上下波动5℃；
②核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过4个；
③G+C含量为40％-60％，减少非特异性杂交保证杂交的特异性；
④核苷酸探针分子内部稳定二级结构配对碱基长度少于4bp，这样可以保证不会因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影响杂交效率；
⑤经同源比较与其他序列的相似性小于40％；
⑥经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。
其中，人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白对应的氨基酸序列与人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1，其中，图1中的Query序列是人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白对应的氨基酸序列，Sbjct序列是人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白对应的氨基酸序列，根据图1可知，人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白相对于人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白，有一处氨基酸序列发生了缺失，并有一处发生了插入。根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，以及图1的比对结果，为了能够特异性识别待检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1是否发生了突变，那么在选取核苷酸探针时，可以按照如下几种方式中的任一种方式设计核苷酸探针：
①选取插入位置的插入核苷酸序列生成核苷酸探针；
②在插入位置之前，和/或，在插入位置之后，各选择若干个核苷酸序列，将选择的若干个序列核苷酸与插入位置的插入核苷酸序列共同生成核苷酸探针，其中，生成的核苷酸探针中相邻核苷酸的先后顺序与其在突变蛋白对应的核苷酸序列中的顺序一致；
③在插入位置之前选择若干个核苷酸序列，与在插入位置的开始位置处选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；
④在插入位置之后选择若干个核苷酸序列，与在插入位置的结束位置处选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；
⑤在缺失位置之前与缺失位置之后各选择若干个核苷酸序列(碱基顺序不变)，生成核苷酸探针；
在本实施例中，根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设计原则，按照上述方式⑤设计一种优选地核苷酸探针如SEQ ID NO:3所示，该核苷酸探针为：ccagaacagc tcgtt
(2)核苷酸探针的合成：通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。
2、检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1是否发生突变的基因芯片的制备
为了保证检测对象样品的质量，还需在基因芯片上设计空白对照、阳性对照和阴性对照。其中，该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。在图2中，□为空白对照，○为阴性对照，为阳性对照，为实验组。
其中，实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。
对于空白对照、阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、以及阳性对照所需点样的阳性内参质控探针设计如下：
空白对照：是不含任何基因片段的空白点样液作为芯片制备过程中的污染监控指标。
阴性内参质控探针：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标，阴性内参质控探针包括的核苷酸个数可以与核苷酸探针的碱基个数相同。本发明实施例中，基因芯片所需的阴性内参探针序列可以为：tgatgctgataattgcat。
阳性内参质控探针：是一段与检测基因有同源性的其他基因片段，在人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白中，选择与核苷酸探针对应的序列不同，且可以与核苷酸探针碱基的个数相同，也可以与核苷酸探针碱基的个数不同的一段核苷酸序列作为阳性内参质控探针。优选地，选取核苷酸个数与核苷酸探针碱基的个数相同的阳性内参质控探针。本发明实施例中，基因芯片所需的阳性内参探针序列可以为：tggcaagctc gggaa。
需要说明的是，在基因芯片的点样过程中，按照基因芯片的布局点入阴性内参探针和阳性内参探针溶液；空白对照所用的试剂为1倍的点样缓冲液(10％海藻糖溶液)。
实施例二、基因芯片的应用
1、样品处理
(1)采集检测对象的血液1-3mL。
(2)取DEPC处理的1.5mL EP管，将其作为被检测样品处理管，在管中加入检测对象的血液300μL，再加入Trizol 700μL，充分混匀，室温放置10min。
(3)加入200μL的氯仿，盖紧管盖，用力震荡，室温放置3-5min，置于离心机中，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去离心管中所有上清。
(4)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清。
(5)用1mL 75％的乙醇清洗一次，7500r/min离心15min，小心吸去所有上清，在超净台中干燥15min，加入10μL DEPC处理水溶解。
(6)所得产物为RNA，如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGENKit纯化总RNA。
2、cDNA第一链和第二链一步法合成
(1)取2μg RNA于1.5mL的离心管中配置如下反应溶液：
总RNA 2μg最多6.5μL
T7 Promotor primer 5μL
RNase-free Water XμL
总体积 11.5μL
其中，RNase-free Water的加入量XμL，是根据总体积11.5μL减去T7Promotorprimer的加入量5μL，再减去总RNA的加入量计算得来的。
(2)在65℃下保温10min，并冰浴5min，预先将5×First Strand Bμffer在65℃下预热5min。
(3)配置如下cDNA合成体系：
5×First Strand Buffer 4μL
0.1M DTT 2μL
10mM dNTP mix 1μL
MMLV RT 1μL
RNase OUT 0.5μL
总体积 8.5μL
(4)将上述8.5μL混合均匀后加入变性后冰浴的RNA中。
(5)用枪头混匀之后离心。
(6)40℃反应2h。
3、aaUTP标记cRNA合成
NTP的配置：
分装成10管备用，注：50％PEG(聚乙二醇)使用之前40℃保温1min。同时按如下操作配置Transcription mix；
(1)配置Transcription mix
RNase-free Water 5.7μL
4×Transcription Buffer 20μL
NTP 16μL
0.1M DTT 6μL
50％PEG 6.4μL
aa-UTP(25mM) 4μL
Inorganic Pyrophosphatase 0.6μL
T7 RNA Polymerase 0.8μL
总体积 60μL
(2)加入55μL 2×GEx Hybridization Buffer。
(3)PCR仪中热盖60℃，40℃反应2h。
4、cRNA纯化
QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。
(1)加入20μLRNase free水，加入350μL BufferRLT并充分混匀。
(2)加入250μL无水乙醇，Tip头充分混匀。
(3)将共计700μL含总RNA的溶液转入套在2mL离心管内的RNeasy柱子内≥8000g离心15-30s，弃去滤过液。
(4)吸取500μLBuffer RPE到RNeasy mini柱子内≥8000g离心洗涤15-30s弃去滤过液再用500μLBuffer RPE在≥8000g离心洗涤2min弃去滤过液和2mL的套管将RNeasymini柱子转入一新的1.5mL Eppendorf管中。
(5)吸取30μL RNase free的水静置1min，≥8000g离心洗脱1min。
(6)重复步骤(5)一次。
5、cRNA浓度测定
用分光光度计分析cRNA浓度。需要测定260nm和280nm处的吸光值来确定样品的浓度和纯度，A260/A280应接近2.0为较纯的cRNA(比值在1.9-2.1也可)。
6、cRNA样品荧光标记；
(1)取上述cRNA 4μg并浓缩至6.6μL。
(2)加10μL DMSO混匀。
(3)加3.4μL的0.3M pH为9.0的碳酸氢钠(NaHCO3)并混匀。
(4)将上述20μL cRNA混合物加入到荧光染料Cy3中并混匀。25℃保温1h。
(5)加9μL的4M Hydroxylamine混匀后25℃保温15min。
7、荧光标记cRNA样品纯化
具体步骤同本实施例的步骤4中cRNA纯化的过程，本步骤不在赘述。
8、cRNA样品片段化和芯片杂交4x44K microarrays
(1)按下表配制片段化混合液然后在60℃温浴30min进行片段化。
Cy3 cRNA绿色荧光 875ng
10×Blocking Agent 11μL
25×Fragmentation Buffer 2.2μL
Nuclease-free water XμL
总体积 55μL
(2)加入55μL 2×GEx Hybridization Buffer。
(3)取100μL杂交液滴加到芯片皿上，同时按芯片布局如图2所示分别滴加在空白、阴性、阳性、实验组位置上。盖上芯片并密封于杂交盒中，60℃滚动杂交16h。
9、芯片洗涤
洗液1(1L)配置：
DEPC-H2O 700mL
20*SSPE 300mL
20％N-Lauroylsarcosine 0.25mL
洗液2(1L)配置：
DEPC-H2O 997mL
20*SSPE 3.0mL
20％N-Lauroylsarcosine 0.25mL
洗液3：Stabilization and Drying Solution
(1)取出芯片于洗液1中洗涤1min；
(2)再将芯片放入洗液2中洗涤1min(37℃)；
(3)最后将芯片于洗液3中洗涤30s。
10、芯片扫描
将芯片在扫描仪中进行扫描，根据扫描结果确定检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变。请参考图3和图4，图3所示的结果中，阴性对照无绿色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组为绿色荧光，那么表明检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白发生了突变。图4所示的结果中，阴性对照为无色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组无绿色荧光，那么表明检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白未发生突变。
实施例三、特异性识别人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的单克隆抗体的制备
1、根据人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的碱基序列(如SEQ ID NO:2所示)设计上游引物如SEQ ID NO:4所示，以及，下游引物如SEQ ID NO:5所示：
上游引物(P)：gctgctgact ttgccaccc
下游引物(F)：gccctgggcc cctgtcccc
2、检测对象的DNA为模板进行PCR扩增
以检测对象的DNA为模板进行PCR扩增，获得人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白基因完整片段，并连接pMD19-T Vector(Takara公司)，进行测序。然后由专门的生物公司制备抗体，是一种人源化或嵌合型抗体。将制备的抗体采用ELISA法测定含量。
实施例四、用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒
本实施例中，ELISA试剂盒的组成为：包被有实施例三所述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
其中，上述各个组成的参数至少可以为如下一种参数：
ELISA酶标板可以为96孔的ELISA酶标；
酶标二抗可以是稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗人IgG；其中，稀释倍数可以是8000倍。
包被缓冲液可以是1×PBS，pH:7.4；
ELISA酶标板洗涤液可以是含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；
显色液可以是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；
终止液可以是2mol/L的硫酸溶液。
实施例五
在本发明实施例中，将肺癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该肺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/mL，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h。
b、使用样品稀释液将肺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。
h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的吸光值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；其中，可以使用ELISA Calc软件绘制该标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以获知回归系数R2＝0.9956，因此，本次测定有效。将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得肺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测肺癌患者血清样品中蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图5，为吸光值的标准曲线。其中，X轴为吸光值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
1、制胶
(1)清洗玻璃板并擦干；
(2)参考分子克隆方法配制SDS-PAGE胶：
A.下层分离胶配制体系(Total Volum：15mL)
ddH2O 5.9mL
30％丙烯酰胺混合液 5.9mL
1.5mol/L Tris(PH8.8) 3.8mL
10％SDS 0.15mL
10％过硫酸铵 0.15mL
TEMED 0.006mL
B.上层积层胶浓缩配制体系(Total Volum：8mL)
(3)在每个胶板中加入相应体积的下层分离胶，再加入1mL的无菌ddH2O，压平分离胶，待分离胶凝固后，用滤纸吸干制胶板中剩余的水分，而后加入上层浓缩胶，插入梳子后等待上层浓缩胶凝固。
2、蛋白上样电泳：
(1)拔下梳子，做好孔道标记，加入5×SDS电泳缓冲液，随后给蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，沸水浴加热3-5min，上样；
(2)先用80V电压进行电泳，待条带跑过浓缩胶之后，换用100V电压跑大约100min。
3、转膜及孵育：
(1)先把PVDF膜在甲醇中活化约30s。分别将凝胶、海绵垫和PVDF膜预先在电转移缓冲液中平衡30min。按滤纸-胶-膜-滤纸的顺序夹好，按照黑面对黑面的原则放入转膜器中，加入制冷器(冰袋)，在冰中以150mA的电流跑约120min；
(2)完成后将膜取出，立刻放入5％的脱脂牛奶中，摇床上轻轻室温封闭1h；
(3)PBST清洗已封闭的膜，清洗3次，每次10min；
(4)加入稀释到相应倍数的一抗，4℃摇床过夜孵育；
(5)回收一抗，PBST清洗膜三次，每次10min；
(6)二抗(用3％的牛奶以1:5000-1:10000稀释)室温孵育膜2h；
(7)用PBST清洗膜三次，每次10min；
(8)Pierce ECLWestern Blotting Substrate试剂盒A、B液等体积混匀后，逐滴滴加在PVDF膜上；
(9)FluorChem E FE0511中曝光成像，实验用Image J分析。
其中，一抗是公司制备的人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白单克隆抗体，二抗是辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
j、Western blot检测结果分析：按照Western blot实验步骤显示结果，如图6所示，其中，图6中的Marker用于表征标记蛋白的大小。与空白对照相比，仅在实验组179KD附近出现明显条带，其中，蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的分子量大约为179KD，表明该肺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白确实存在突变。
实施例六
在本发明实施例中，将肝癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该肝癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/mL，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。
h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的吸光值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；其中，可以使用ELISA Calc软件绘制该标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以获知回归系数R2＝0.9958，因此，本次测定有效。将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得样品中肝癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测肝癌患者血清样品中蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图7，为吸光值的标准曲线。其中，X轴为吸光值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
j、Western blot检测结果分析
其中，步骤i和步骤j与实施例五中的相同，在此不再赘述，请参考图8，图8中的Marker用于表征标记蛋白的大小。本实施例的实验显示结果，与空白对照相比，仅在实验组179KD附近出现明显条带，其中，蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的分子量大约为179KD，表明该肝癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白确实存在突变。
实施例七
在本发明实施例中，将胰腺癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该胰腺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/mL，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将胰腺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。
h、制作标准曲线，以标准品浓度为横坐标，标准品测定的吸光值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；其中，可以使用ELISA Calc软件绘制该标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以获知回归系数R2＝0.9975，因此，本次测定有效。将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得样品中胰腺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测胰腺癌患者血清样品中蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图9，为吸光值的标准曲线。其中，X轴为吸光值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
j、Western blot检测结果分析
其中，步骤i和步骤j与实施例五中的相同，在此不再赘述，请参考图10，图10中的Marker用于表征标记蛋白的大小。本实施例的实验显示结果，与空白对照相比，仅在实验组179KD附近出现明显条带，其中，蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的分子量大约为179KD，表明该胰腺癌患者的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白确实存在突变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司
<120> 一种蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 733
<212> PRT
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Ala Asp Phe Ala Thr His Gly Lys Leu Gly Lys Leu Glu Phe Ala
1 5 10 15
Gln Asp Ala His Gly Gln Pro Asp Val Ser Ala Phe Asp Phe Thr Ser
20 25 30
Met Met Arg Ala Glu Ser Ser Ala Arg Val Gln Glu Lys His Gly Ala
35 40 45
Arg Leu Leu Leu Gly Leu Val Gly Asp Cys Leu Val Glu Pro Phe Trp
50 55 60
Pro Leu Gly Thr Gly Val Ala Arg Gly Phe Leu Ala Ala Phe Asp Ala
65 70 75 80
Ala Trp Met Val Lys Arg Trp Ala Glu Gly Ala Glu Ser Leu Glu Val
85 90 95
Leu Ala Glu Arg Glu Ser Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Gln Thr Ser Pro
100 105 110
Glu Asn Met His Arg Asn Val Ala Gln Tyr Gly Leu Asp Pro Ala Thr
115 120 125
Arg Tyr Pro Asn Leu Asn Leu Arg Ala Val Thr Pro Asn Gln Val Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Asp Val Leu Ala Lys Glu Pro Val Gln Arg Asn Asn Asp
145 150 155 160
Lys Thr Asp Thr Gly Met Pro Ala Thr Gly Ser Ala Gly Thr Gln Glu
165 170 175
Glu Leu Leu Arg Trp Cys Gln Glu Gln Thr Ala Gly Tyr Pro Gly Val
180 185 190
His Val Ser Asp Leu Ser Ser Ser Trp Ala Asp Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Ala Leu Val Tyr Arg Leu Gln Pro Gly Leu Leu Glu Pro Ser Glu Leu
210 215 220
Gln Gly Leu Gly Ala Leu Glu Ala Thr Ala Trp Ala Leu Lys Val Ala
225 230 235 240
Glu Asn Glu Leu Gly Ile Thr Pro Val Val Ser Ala Gln Ala Val Val
245 250 255
Ala Gly Ser Asp Pro Leu Gly Leu Ile Ala Tyr Leu Ser His Phe His
260 265 270
Ser Ala Phe Lys Ser Met Ala His Ser Pro Gly Pro Val Ser Gln Ala
275 280 285
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Ala Val Leu Phe Leu Ser Lys Leu Gln Arg
290 295 300
Thr Leu Gln Arg Ser Arg Ala Lys Glu Asn Ala Glu Asp Ala Gly Gly
305 310 315 320
Lys Lys Leu Arg Leu Glu Met Glu Ala Glu Thr Pro Ser Thr Glu Val
325 330 335
Pro Pro Asp Pro Glu Pro Gly Val Pro Leu Thr Pro Pro Ser Gln His
340 345 350
Gln Glu Ala Gly Ala Gly Asp Leu Cys Ala Leu Cys Gly Glu His Leu
355 360 365
Tyr Val Leu Glu Arg Leu Cys Val Asn Gly His Phe Phe His Arg Ser
370 375 380
Cys Phe Arg Cys His Thr Cys Glu Ala Thr Leu Trp Pro Gly Gly Tyr
385 390 395 400
Glu Gln His Pro Gly Asp Gly His Phe Tyr Cys Leu Gln His Leu Pro
405 410 415
Gln Thr Asp His Lys Ala Glu Gly Ser Asp Arg Gly Pro Glu Ser Pro
420 425 430
Glu Leu Pro Thr Pro Ser Glu Asn Ser Met Pro Pro Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Pro Thr Ala Ser Gln Glu Gly Ala Gly Pro Val Pro Asp Pro Ser Gln
450 455 460
Pro Thr Arg Arg Gln Ile Arg Leu Ser Ser Pro Glu Arg Gln Arg Leu
465 470 475 480
Ser Ser Leu Asn Leu Thr Pro Asp Pro Glu Met Glu Pro Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Pro Arg Ser Cys Ser Ala Leu Ala Arg His Ala Leu Glu Ser Ser
500 505 510
Phe Val Gly Trp Gly Leu Pro Val Gln Ser Pro Gln Gly Ala Gly Gly
515 520 525
Ser Arg Thr Ser Gln Phe Phe Phe Ser Ala Leu Val Ala Met Glu Lys
530 535 540
Glu Glu Lys Glu Ser Pro Phe Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Val
545 550 555 560
Pro Leu Asp Ser Asp Val Glu Gln Ala Leu Gln Thr Phe Ala Lys Thr
565 570 575
Ser Gly Thr Met Asn Asn Tyr Pro Thr Trp Arg Arg Thr Leu Leu Arg
580 585 590
Arg Ala Lys Glu Glu Glu Met Lys Arg Phe Cys Lys Ala Gln Thr Ile
595 600 605
Gln Arg Arg Leu Asn Glu Ile Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu Glu Ala
610 615 620
Glu Gly Val Lys Leu Glu Leu Ala Leu Arg Arg Gln Ser Ser Ser Pro
625 630 635 640
Glu Gln Leu Val Asp Lys Lys Asn Ser Leu Val Ala Glu Glu Ala Glu
645 650 655
Leu Met Ile Thr Val Gln Glu Leu Asn Leu Glu Glu Lys Gln Trp Gln
660 665 670
Leu Asp Gln Glu Leu Arg Gly Tyr Met Asn Arg Glu Glu Asn Leu Lys
675 680 685
Thr Ala Ala Asp Arg Gln Ala Glu Asp Gln Val Leu Arg Lys Leu Val
690 695 700
Asp Leu Val Asn Gln Arg Asp Ala Leu Ile Arg Phe Gln Glu Glu Arg
705 710 715 720
Arg Leu Ser Glu Leu Ala Leu Gly Thr Gly Ala Gln Gly
725 730
<210> 2
<211> 2199
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 2
gctgctgact ttgccaccca tggcaagctc gggaaactag agtttgccca ggatgcccat 60
gggcagcctg atgtctctgc ctttgacttc acgagcatga tgcgggcaga gagttctgct 120
cgtgtgcaag agaagcatgg cgcccgcctg ctgctgggac tggtggggga ctgcctggtg 180
gagcccttct ggcccctggg cactggagtg gcacggggct tcctggcagc ctttgatgca 240
gcctggatgg tgaagcggtg ggcagagggc gctgagtccc tagaggtgtt ggctgagcgt 300
gagagcctgt accagcttct gtcacagaca tccccagaaa acatgcatcg caatgtggcc 360
cagtatgggc tggacccagc cacccgctac cccaacctga acctccgggc agtgaccccc 420
aatcaggtac gagacctgta tgatgtgcta gccaaggagc ctgtgcagag gaacaacgac 480
aagacagata cagggatgcc agccaccggg tcggcaggca cccaggagga gctgctacgc 540
tggtgccagg agcagacagc tgggtacccg ggagtccacg tctccgattt gtcttcctcc 600
tgggctgatg ggctagctct gtgtgccctg gtgtaccggc tgcagcctgg cctgctggaa 660
ccctcagagc tgcaggggct gggagctctg gaagcaactg cttgggcact aaaggtggca 720
gagaatgagc tgggcatcac accggtggtg tctgcacagg ccgtggtagc agggagtgac 780
ccactgggcc tcattgccta cctcagccac ttccacagtg ccttcaagag catggcccac 840
agcccaggcc ctgtcagcca ggcctcccca gggacctcca gtgctgtatt attccttagt 900
aaacttcaga ggaccctgca gcgatcccgg gccaaggaaa atgcagagga tgctggtggc 960
aagaagctgc gcttggagat ggaggccgag accccaagta ctgaggtgcc acctgaccca 1020
gagcctggtg tacccctgac acccccatcc caacaccagg aggccggtgc tggggacctg 1080
tgtgcacttt gtggggaaca cctctatgtc ctggaacgcc tctgtgtcaa cggccatttc 1140
ttccaccgga gctgcttccg ctgccatacc tgtgaggcca cactgtggcc aggtggctac 1200
gagcagcacc caggagatgg acatttctac tgcctccagc acctgcccca gacagaccac 1260
aaagcggaag gcagcgatag aggccctgag agtccggagc tccccacacc aagtgagaat 1320
agcatgccac caggcctctc aactcccaca gcctcgcagg agggggccgg tcctgttcca 1380
gatcccagcc agcccacccg tcggcagatc cgcctctcca gcccggagcg ccagcggttg 1440
tcctccctta accttacccc tgacccggaa atggagcctc cacccaagcc tccccgcagc 1500
tgctccgcct tggcccgcca cgccctggag agcagctttg tgggctgggg cctgccagtc 1560
cagagccctc aaggcgctgg aggcagtaga acgtctcagt tcttcttctc agctcttgtg 1620
gccatggaga aggaggaaaa agagagtccc ttctccagtg aagaggaaga agaagatgtg 1680
cctttggact cagatgtgga acaggccctg cagacctttg ccaagacctc aggcaccatg 1740
aataactacc caacatggcg tcggactctg ctgcgccgtg cgaaggagga ggagatgaag 1800
aggttctgca aggcccagac catccaacgg cgactaaatg agattgaggc tgccttgagg 1860
gagctagagg ccgagggcgt gaagctggag ctggccttga ggcgccagag cagttcccca 1920
gaacagctcg ttgacaagaa aaacagcctg gtggctgagg aggccgagct catgatcacg 1980
gtgcaggaat tgaatctgga ggagaaacag tggcagctgg accaggagct acgaggctac 2040
atgaaccggg aagaaaacct aaagacagct gctgatcggc aggctgagga ccaggtcctg 2100
aggaagctgg tggatttggt caaccagaga gatgccctca tccgcttcca ggaggagcgc 2160
aggctcagcg agctggcctt ggggacaggg gcccagggc 2199
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccagaacagc tcgtt 15
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgctgact ttgccaccc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccctgggcc cctgtcccc 19

Claims (9)

1.一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种基因芯片，其特征在于，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据所述人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的核苷酸序列，与人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
5.一种特异性识别人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
6.一种用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括：包被有权利要求5所述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
7.根据权利要求6所述用于检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
8.一种基于权利要求6或7所述ELISA试剂盒检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的方法，其特征在于，包括：
a、使用所述包被缓冲液对权利要求5所述单克隆抗体进行稀释，并将稀释后的所述单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育；
b、使用所述样品稀释液将检测对象的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育；
e、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育，并加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。
9.根据权利要求8所述ELISA试剂盒检测人的蛋氨酸亚砜氧化酶MICAL1突变蛋白的抗体的方法，其特征在于，进一步包括：空白对照实验。
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