CN108192832B - 一株新型青风藤内生真菌qty及其在生物防治中的应用 - Google Patents

一株新型青风藤内生真菌qty及其在生物防治中的应用 Download PDF

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    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom

Abstract

本发明公开了一株新型青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY在生物防治领域中的应用。本发明的青风藤内生真菌QTY是从秦岭药用植物青风藤中分离、纯化而得，与畸腔菌科(Morosphaeriaceae)的Acrocalymma cycadis同源度最高，为94％，为一株新菌种，命名为Acrocalymma sp.QTY。于2018年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018058。该内生真菌QTY对苹果炭疽病原菌、苹果腐烂病原菌、小麦赤霉病原菌、番茄灰霉病原菌、番茄早疫病原菌、水稻稻瘟病原菌和马铃薯干腐病原菌均有很强的抑制作用，对以上植物病原菌的相对抑制率分别为：100％，96％，92％，100％，96％，100％和100％，因此可将其应用于生物防治领域，对以上病原菌引起的植物病害进行防治。

Description

一株新型青风藤内生真菌QTY及其在生物防治中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株新型青风藤内生真菌(Acrocalymmasp.) QTY在生物防治领域中的应用，特别是其在抗植物病害方面的应用。
背景技术
植物病害是由植物病原菌引起的影响农业健康发展的常见灾害之一，其防治技术主要包括化学防治和生物防治。化学防治由于其带来的药物残留，环境污染和食品安全等问题而逐渐被生物防治所取代。生物防治是一种利用微生物自身或其次级代谢产物来抑制病原微生物的生长繁殖，从而对病害进行有效防治的技术方法。由于其具有低成本和环境友好的优点，因此符合可持续发展的理念而成为植物病害防治领域的研究热点。
植物内生菌是指长期定殖于健康植物内部并与植物协同进化的一类微生物。由于其特殊的生长环境和与植物密切的关系，作为具有巨大开发潜能的生防资源，植物内生菌相对其他生防因子具有明显的优势，如对病害防治特异性强，不影响有益生物，保护生态自然平衡等。据文献报道，目前已筛选出的具有生防潜力的植物内生菌有：从马铃薯根部分离得到的能够抑制环腐病菌的内生假单胞菌(Pseudomonas sp.)；从水稻的根茎部分离出的能够抑制水稻病原菌异丝绵霉和刺腐霉的内生假单胞菌(Pseudomonas sp.)和内生鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)；从棉花中分离得到的能抑制立枯菌的内生芽孢杆菌(Bacillus sp.)；从玉米中筛选出的能够抑制串珠镰刀菌的内生阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；从雷公藤中获得的内生真菌能够抑制稻瘟病菌。从以上报道来看，获得的生防内生菌主要集中在常见的细菌种属，且抗菌谱相对也较窄，而新颖的具有广谱抗菌的生防内生真菌尚未见报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一株新型的具有生物防治潜力的青风藤内生真菌。
本发明的另一目的在于提供所述青风藤内生真菌在生物防治领域中的应用，特别是对多种植物病原菌的抑制。所述多种植物病原菌优选苹果炭疽病原菌，苹果腐烂病原菌，小麦赤霉病原菌，番茄灰霉病原菌，番茄早疫病原菌，水稻稻瘟病原菌及马铃薯干腐病原菌。
为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终从陕西省宝鸡市秦岭山上药用植物青风藤中分离、纯化获得了一株新型的具有生物防治潜力的青风藤内生真菌。
进一步地，本发明人将挑选的青风藤内生真菌菌落进行鉴定，菌种鉴定采用真菌ITS 测序，得到长为493bp的ITS基因序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示。与Genbank中已登录的基因序列进行比对后，采用邻接法(Neighbor-Joining)的Complete Deletion模式构建系统发育树，结果显示该菌株与畸腔菌科(Morosphaeriaceae)的无性型腔孢菌Acrocalymma cycadis系统位置最接近，同源度为94％，根据同源度小于95％可以判断该菌种为一株新菌种。
另外，本发明人将分离得到的新菌种命名为青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY，于2018年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: M2018058，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编 430072。
本发明分离得到的青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY在马铃薯琼脂培养基上具有如下的形态：28℃培养两周菌落直径可达20mm，有稀疏的气生菌丝，菌落边缘羽毛状，培养基正反面为灰白色。
本发明分离得到的青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY的发酵培养基优选为麦芽汁培养基，察氏培养基，综合PDA培养基，萨氏培养基，改良马丁培养基。发酵方法包括如下步骤：将青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY接种于上述任一种发酵培养基，在23℃-30℃、摇床转速为120rpm-200rpm条件下发酵培养15-30d。
在进一步的试验中，本发明人通过抗植物病原真菌活性评价试验发现，所述青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY可拮抗多种植物病原菌的生长，因此本发明提供了上述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用。尤其提供了青风藤内生真菌QTY应用于植物病原菌引起的植物病害的防治。
进一步优选地，如上所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其中的植物病原菌选自如下的一种或多种：苹果炭疽病原菌，苹果腐烂病原菌，小麦赤霉病原菌，番茄灰霉病原菌，番茄早疫病原菌，水稻稻瘟病原菌，马铃薯干腐病原菌。
进一步优选地，如上所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其包含以下步骤：将青风藤内生真菌QTY在发酵培养基中培养后制备的发酵液或发酵粗提液施用于植物发病部位。
再进一步优选地，如上所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其中所述的酵培养基优选为麦芽汁培养基、察氏培养基、综合PDA培养基、萨氏培养基或改良马丁培养基。
再进一步优选地，如上所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其中所述的发酵液是将青风藤内生真菌QTY接种于所述发酵培养基后，在23℃-30℃，摇床转速为120rpm-200rpm条件下发酵培养15-30d而得。
再进一步优选地，如上所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其中所述的发酵粗提液为发酵液的乙酸乙酯浸提萃取液、甲醇浸提萃取液或正丁醇浸提萃取液。
再进一步优选地，如上所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其中所述的发酵液或发酵粗提液以喷施或滴灌的方式被施用于植物发病部位。
本发明相对于现有技术，具有如下优点和显著进步性：
(1)本发明首次从青风藤中分离筛选出具有生物防治潜力的新型内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY，构建系统发育树后发现其与畸腔菌科(Morosphaeriaceae)的无性型腔孢菌Acrocalymma cycadis系统位置最接近，同源度为94％，根据同源度小于95％可以判断该菌种为一株新菌种。
(2)本发明的青风藤内生真菌(Acrocalymma sp.)QTY具有广谱抗菌的能力，对多种植物病原菌如苹果炭疽病原菌，苹果腐烂病原菌，小麦赤霉病原菌，番茄灰霉病原菌，番茄早疫病原菌，水稻稻瘟病原菌及马铃薯干腐病原菌均具有显著地抑制作用，可用于上述病原菌引起的植物病害的生物防治。
附图说明
图1是基于青风藤内生真菌QTY的ITS基因序列采用邻接法建立的系统发育树；
图2是青风藤内生真菌QTY抗苹果炭疽病原菌的平板形态效果图；
图3是青风藤内生真菌QTY抗苹果腐烂病原菌的平板形态效果图；
图4是青风藤内生真菌QTY抗小麦赤霉病原菌的平板形态效果图；
图5是青风藤内生真菌QTY抗番茄灰霉病原菌的平板形态效果图；
图6是青风藤内生真菌QTY抗番茄早疫病原菌的平板形态效果图；
图7是青风藤内生真菌QTY抗水稻稻瘟病原菌的平板形态效果图；
图8是青风藤内生真菌QTY抗马铃薯干腐病原菌的平板形态效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明和解释本发明，而不应视为限定本发明的保护范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的一般文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：青风藤内生真菌QTY的分离与鉴定
本发明具有生物防治潜力青风藤内生真菌是从陕西省宝鸡市秦岭山上药用植物青风藤中分离纯化得到的。将挑选的菌落进行鉴定，菌种鉴定采用真菌ITS测序。真菌基因组DNA提取采用真菌基因组提取试剂盒。采用真菌ITS通用引物来扩增序列。通用引物为：上游引物：ITS1(tccgtaggtgaacctgcgg)，下游引物：ITS4(tcctccgcttattgatatgc)。 PCR扩增体系总体积为35μL：超纯水26.3μL，10×PCR Buffer 3.5μL，dNTP 0.7μL， 10μmol/L上游引物ITS11μL，10μmol/L下游引物ITS41μL，5U/μL Taq DNA Polymerase 0.5μL。另用超纯水代替模板DNA进行空白试验。PCR反应35个循环，95.0℃变性2 min后进入循环：95℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸1min。35个循环后72℃延伸5min。
用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳缓冲液为TAE，电泳条件为电压150v，电泳30min。通过EB染色在紫外灯下观察目的条带，浓度>30ng/μL为合格，合格产物用PCR胶回收试剂盒纯化，纯化产物直接测序，结果如下及序列表中SEQ ID NO:1所示。 tgatccgaggtcagcgtaaaaagggcttttggatgccaacgaaccagccgagagtacgcaatgtgctgcgctcaaagccgaattacca ggctgccaattactttaaggcgagtccacacgcaaaggcaggacaaacacccaacaccaagcaaagcttgagggttcaaatgacgct cgaacaggcatgccccatggaataccaaggggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacactacttat cgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttaataattaaattataatcagacgctgactgctatt acaaaaaggttgtttaaaatgtcctaacggggggcaagccccccgaggaaacgtgtggtactcatagacaaaggtagaaaacggtgt aaaccgaaatcagtaatgatccttccgcaggtcaccctacggaagga
由以上得到的长为493bp的ITS基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对后采用邻接法(Neighbor-Joining)的Complete Deletion模式构建系统发育树，用Bootstrap 进行检验，并重复1000次。如图1所示，可知该菌株与畸腔菌科(Morosphaeriaceae)的 Acrocalymma cycadis系统位置最接近，同源度为94％，根据同源度小于95％可以判断该菌种为一株新菌种。
根据上述ITS基因序列鉴定结果，本发明所筛选的青风藤内生真菌(Acrocalymmasp.)QTY应归属畸腔菌科(Morosphaeriaceae)，与Acrocalymma cycadis系统位置最接近，但同源度低于95％，判断为一株新属种。于2018年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: M 2018058。
实施例2：青风藤内生真菌QTY对苹果炭疽病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于28℃，摇床转速为180rpm下发酵培养20d，发酵培养基为麦芽汁培养基，配方及制作方法如下：生麦芽20g，煮开后再煮20 min，过滤除去麦芽，滤液加入蔗糖20g，蛋白胨1g，加水至1000mL；分装后121℃灭菌30min。将发酵好的菌液采用乙酸乙酯浸提萃取，萃取体积比为1:1，萃取三次，合并三次上层萃取液浓缩后获得乙酸乙酯粗提物。内生真菌粗提物采用菌丝生长速率抑制法进行抗植物病原真菌活性评价。方法如下：精确称量彻底干燥的内生真菌乙酸乙酯相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与PDA培养基混匀配制成浓度为2mg/mL的带药平皿。用直径为4mm的打孔器在活化好的植物病原真菌菌落边缘取菌饼，接种到带药平皿中，每个平皿放置三块菌饼，每个处理重复3次，并设只加丙酮不加药的PDA 平板作空白对照。于28℃倒置培养72h，采用十字交叉法测定菌落直径，取平均值，菌丝生长相对抑制率按照如下公式计算：
Figure BDA0001560113660000051
测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY对苹果炭疽病原菌的抑制活性如图2所示，其对病原菌的相对抑制率测得为100％。
实施例3：青风藤内生真菌QTY对苹果腐烂病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于25℃，摇床转速为150rpm下发酵培养20d，发酵培养基为察氏培养基，配方及制作方法如下：蔗糖30g，酵母膏1g，硝酸钠 3g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1g，加水至1000mL；分装后121℃灭菌30min。将发酵好的菌液采用乙酸乙酯浸提萃取，萃取体积比为1:1，萃取三次，合并三次上层萃取液浓缩后获得乙酸乙酯粗提物，精确称量彻底干燥的内生真菌乙酸乙酯相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与PDA培养基混匀配制成浓度为3 mg/mL的带药平皿，接种病原菌为苹果腐烂病原菌，病原菌的接种方法同实施例2，接种好的平板于25℃倒置培养96h。菌丝生长相对抑制率计算同实施例2。测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY对苹果腐烂病原菌的抑制活性如图3所示，其相对抑制率测得为96％。
实施例4：青风藤内生真菌QTY对小麦赤霉病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于30℃，摇床转速为200rpm下发酵培养15d，发酵培养基为综合PDA，配方及制作方法如下：土豆200g，葡萄糖20g，硝酸钠3g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1g，加水至1000mL；分装后121℃灭菌30min。将发酵好的菌液用甲醇浸提，加入等体积的甲醇，超声1h，过滤滤液浓缩后获得甲醇粗提物，精确称量彻底干燥的内生真菌甲醇相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与PDA培养基混匀配制成浓度为4mg/mL的带药平皿，接种病原菌为小麦赤霉病原菌，病原菌的接种方法同实施例2，接种好的平板于30℃倒置培养72 h。菌丝生长相对抑制率计算同实施例2。测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY 对小麦赤霉病原菌的抑制活性如图4所示，其相对抑制率测得为92％。
实施例5：青风藤内生真菌QTY对番茄灰霉病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于23℃，摇床转速为120rpm下发酵培养30d，发酵培养基为改良马丁培养基，配方及制作方法如下：蔗糖20g，蛋白胨5g，酵母膏2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，加水至1000mL；分装后121℃灭菌30min。将发酵好的菌液用正丁醇萃取，萃取体积比为1:1，萃取三次，合并三次上层萃取液浓缩后获得正丁醇粗提物，精确称量彻底干燥的内生真菌正丁醇相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与PDA培养基混匀配制成浓度为5mg/mL的带药平皿，接种病原菌为番茄灰霉病原菌，病原菌的接种方法同实施例2，接种好的平板于28℃倒置培养48h。菌丝生长相对抑制率计算同实施例2。测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY对番茄灰霉病原菌的抑制活性如图5所示，其相对抑制率测得为100％。
实施例6：青风藤内生真菌QTY对番茄早疫病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于25℃，摇床转速为180rpm下发酵培养15d，发酵培养基为萨氏培养基，配方及制作方法如下：葡萄糖40g，蛋白胨10g，水 1000ml，分装后121℃灭菌30min。将发酵好的菌液用正丁醇萃取，萃取体积比为1:1，萃取三次，合并三次上层萃取液浓缩后获得正丁醇粗提物，精确称量彻底干燥的内生真菌正丁醇相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与PDA培养基混匀配制成浓度为3 mg/mL的带药平皿，接种病原菌为番茄早疫病原菌，病原菌的接种方法同实施例2，接种好的平板于25℃倒置培养96h。菌丝生长相对抑制率计算同实施例2。测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY对番茄早疫病原菌的抑制活性如图6所示，其相对抑制率测得为96％。
实施例7：青风藤内生真菌QTY对水稻稻瘟病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于28℃，摇床转速为150rpm下发酵培养20d，发酵培养基为综合PDA，配方及制作方法同实施例4。将发酵好的菌液用乙酸乙酯萃取，萃取体积比为1:1，萃取三次，合并三次上层萃取液浓缩后获得乙酸乙酯粗提物，精确称量彻底干燥的内生真菌乙酸乙酯相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与 PDA培养基混匀配制成浓度为2mg/mL的带药平皿，接种病原菌为水稻稻瘟病原菌，病原菌的接种方法同实施例2，接种好的平板于30℃倒置培养72h。菌丝生长相对抑制率计算同实施例2。测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY对水稻稻瘟病原菌的抑制活性如图7所示，其相对抑制率测得为100％。
实施例8：青风藤内生真菌QTY对马铃薯干腐病原菌的抑制活性评价
将青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY于30℃，摇床转速为180rpm下发酵培养20d，发酵培养基为麦芽汁培养基，配方及制作方法同实施例2。将发酵好的菌液用甲醇浸提，加入等体积的甲醇，超声1h，过滤滤液浓缩后获得甲醇粗提物，精确称量彻底干燥的内生真菌甲醇相粗提物，用丙酮溶解，在无菌条件下与PDA培养基混匀配制成浓度为3mg/mL的带药平皿，接种病原菌为马铃薯干腐病原菌，病原菌的接种方法同实施例2，接种好的平板于28℃倒置培养96h。菌丝生长相对抑制率计算同实施例2。测定的青风藤内生真菌Acrocalymma sp.QTY对马铃薯干腐病原菌的抑制活性如图8所示，其相对抑制率测得为100％。
序列表
<110> 宝鸡文理学院
<120> 一株新型青风藤内生真菌QTY及其在生物防治中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 493
<212> DNA
<213> 青风藤内生真菌(Acrocalymma sp. QTY)
<400> 1
tgatccgagg tcagcgtaaa aagggctttt ggatgccaac gaaccagccg agagtacgca 60
atgtgctgcg ctcaaagccg aattaccagg ctgccaatta ctttaaggcg agtccacacg 120
caaaggcagg acaaacaccc aacaccaagc aaagcttgag ggttcaaatg acgctcgaac 180
aggcatgccc catggaatac caaggggcgc aatgtgcgtt caaagattcg atgattcact 240
gaattctgca attcacacta cttatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgccagaacc 300
aagagatccg ttgttgaaag ttttaataat taaattataa tcagacgctg actgctatta 360
caaaaaggtt gtttaaaatg tcctaacggg gggcaagccc cccgaggaaa cgtgtggtac 420
tcatagacaa aggtagaaaa cggtgtaaac cgaaatcagt aatgatcctt ccgcaggtca 480
ccctacggaa gga 493

Claims (10)

1.一株青风藤内生真菌（Acrocalymma sp.）QTY，其保藏编号为CCTCC NO: M 2018058。
2.根据权利要求1所述的青风藤内生真菌（Acrocalymma sp.）QTY，其特征在于，该菌株的ITS基因序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示。
3.权利要求1所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用。
4.根据权利要求3所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于，所述青风藤内生真菌QTY应用于植物病原菌引起的植物病害的防治。
5.根据权利要求4所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于，所述的植物病原菌选自如下的一种或多种：苹果炭疽病原菌，苹果腐烂病原菌，小麦赤霉病原菌，番茄灰霉病原菌，番茄早疫病原菌，水稻稻瘟病原菌，马铃薯干腐病原菌。
6.根据权利要求4所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于包含以下步骤：将青风藤内生真菌QTY在发酵培养基中培养后制备的发酵液或发酵粗提液施用于植物发病部位。
7.根据权利要求6所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于，所述的发酵培养基为麦芽汁培养基、察氏培养基、综合PDA培养基、萨氏培养基或改良马丁培养基。
8.根据权利要求7所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于，所述的发酵液是将青风藤内生真菌QTY接种于所述发酵培养基后，在23℃-30℃，摇床转速为120 rpm-200 rpm条件下发酵培养15-30 d而得。
9.根据权利要求6所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于，所述的发酵粗提液为发酵液的乙酸乙酯浸提萃取液、甲醇浸提萃取液或正丁醇浸提萃取液。
10.根据权利要求6所述青风藤内生真菌QTY在生物防治领域中的应用，其特征在于，所述的发酵液或发酵粗提液以喷施或滴灌的方式被施用于植物发病部位。
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