CN108169129B - 一种实现微球单排列进样的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微流控芯片技术领域,具体的说是涉及一种实现微球单排列进样的方法。将细管插入至十字微芯片通道内,其中任意一个通道内插入一端为拉尖的细管,向拉尖的细管内输送待输送微球悬浮液,向拉尖毛细管垂直的两根细管内输送鞘液,将待输送微球悬浮液通过拉尖毛细管向其相对的细管内形成微球单排列聚焦流,进而实现微球单排列的进样。本发明的微流控装置可以解决微球单排列聚焦过程中各向受力不均造成的聚焦信号不稳定问题,为微球检测提供一种微型化进样方式。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域,具体的说是涉及一种实现微球单排列进样的方法。
背景技术
有机污染快速检测系统是基于有机污染物印迹微球识别与分析的,针对微球的粒径、检测信号的稳定性等要求,首先要求构建适用于10~15μm微球样液的进样装置,同时解决进样快速稳定、微球单排列、检测区域光学性能稳定三大关键问题。
微流控技术是兴起于上世纪90年代的热门交叉学科,具有快速、稳定、控制性好等特点。我国于2001年启动了十五大重大项目“微流控生物分析系统基础研究”,2002年科技部启动了兴奋剂微流体生物芯片工程;2007年,启动973计划“微流控学在化学和生物医学中的应用基础研究”;2014年国家基金委重点支持了“液芯型光纤微流控器件中光与液流作用机理及在线检测应用”等相关领域的研究。到目前为止,我国学者发表的以“微流控”为关键词发表的SCI论文数目仅次于美国,位居世界第二。研究领域主要针对微流控芯片加工和表面处理技术、工艺;微流体操控技术、方法和理论;微流控芯片取样、试样引入和前处理、反应技术;微流控芯片光谱、电化学、质谱检测技术研究;基于微流控原理的液滴分析、毛细管电泳、流动注射分析、生物传感器分析系统研究,以及纳米技术和仿生技术在微流控系统中的应用;基于微流控技术的微型化分析仪器研制;微流控系统在生物分析、单细胞分析、蛋白质组研究、临床检验、高通量筛选中的应用等。我国的微流控技术的研究水平在国际上处于较先进的地位,在部分研究领域已具有一定的国际领先优势。
微流控芯片分析系统的应用研究主要集中在细胞分析、药物筛选、疾病诊断领域较多,Taylor等设计了微流控细胞培养芯片,用于研究神经细胞极化生长的轴突部分的生物学特性;Balagaddc等设计了一种微流控芯片,通过对菌体密度的反馈来控制菌体数量的电路,监控微生物重要指标的变化;Nagrath等发明了一种芯片,通过对芯片中许多微柱进行循环癌细胞的抗体修饰,高效率选择性地从癌症患者的血液中发现癌症特征细胞,用于诊断早期癌症具有重大的应用价值。但微流控技术的应用研究仍侧重于基础理论,在分析化学与高通量分析综合领域的实际应用有待拓展。
由于微流控技术具有高通量、快速、光学性能稳定的特点,其作为进样装置、细胞计数与分析方面也有应用尝试。赵建龙等研制了荧光微芯片分析检测器,基本实现了细胞检测系统的微型化、集成化;方群等以微流控芯片与正交光路激光诱导荧光检测激素为基础,研制了微流控高通量引入系统;郑小林等研制了用于细胞电阻检测的微流控芯片;Gawad S.等人研制的微流控芯片采用微电极技术成功的实现了细胞的技术与分选。
此外,微流控芯片系统微型化、集成化和自动化的特点使得它适合应用于现场和个体分析,在有机污染物即时检验领域的应用前景广阔。
然而,目前的研究是通过控制微流控芯片中样品流液与鞘液流通道的夹角,从而控制液流聚焦;PMMA等材质加工芯片的工艺限制了通道的形状为方形,致使通道内的聚焦作用力难以均衡;主要用于液流聚焦和气泡形成,对于微球类具有一定形状和重力的实体,由于动量守恒理论,流体向出口方向的驱动力均来自样品流,驱动力过大会导致进样口承受压力过大液体容易从进样口溢出;驱动力过小,导致液流前向动量不足,样品液停滞不前,难以形成稳定连续的单排列聚焦流。
发明内容
为解决微球单排列与荧光信号采集问题,本发明目的在于提供一种实现微球单排列进样的方法。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种实现微球单排列进样的方法,将细管插入至十字微芯片通道内,其中任意一个通道内插入一端为拉尖的细管,向拉尖的细管内输送待输送微球悬浮液,向拉尖毛细管垂直的两根细管内输送鞘液,将待输送微球悬浮液通过拉尖毛细管向其相对的细管内形成微球单排列聚焦流,进而实现微球单排列的进样。
所述一端为拉尖的细管插入十字微芯片位置为插入至十字微芯片的十字交汇入口处、十字交汇中心处、十字出口处或超过十字出口处100μm。
所述一端为拉尖的细管插入十字微芯片位置为插入至十字微芯片的十字交汇入口处或十字交汇中心处。
所述拉尖毛细管位于十字交汇入口处时,悬浮液流速为4mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:15~2:35时,可获得聚焦宽度为10-15μm的微球单排列液流;拉尖毛细管位于十字交汇中心处时,悬浮液流速为6mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:15~2:45时,可获得聚焦宽度为10-15μm的微球单排列液流;拉尖毛细管位于十字交汇出口处时,悬浮液流速为5mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:25~2:70时,可获得聚焦宽度为20-30μm的微球单排列液流;拉尖毛细管位于超过十字出口处100μm时,悬浮液流速为3mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:25~2:80时,可获得聚焦宽度为10-20μm的微球单排列液流。
所述微球悬浮液为将2~8mg微球置于10~15mL鞘液中,超声15-20min,待用,悬浮液可稳定2小时;其中,鞘液为5-7gTriton100、300-350g乙醇、0.4-0.8gNaOH超纯水定容至1000mL配制而成的水溶液。根据测试需求,可将使用鞘液将配置好的悬浮进行稀释。
具体制作:
(1)设计与毛细管外壁相适应的十字微芯片,利用激光刻蚀法加工,微通道内径为330-350μm,将制备好的玻璃心片切割为2cm见方的基础芯片;
(2)将与十字芯片内径相适应的毛细管(外径为350μm,内径为200μm)一端拉尖,去掉部分包衣,插入十字芯片一端通道,在显微镜下完成毛细管出口端位置设置和同轴后使用玻璃胶固定毛细管,利用细管将毛细管与微球悬浮液输送泵连接;
(3)将与十字芯片内径相适应的三根毛细管(外径为350μm,内径为200μm)去掉部分包衣,插入十字芯片另外三个通道内,在显微镜下完成同轴后使用玻璃胶固定毛细管,采用细管将与拉尖毛细管垂直的两根毛细管与鞘液输送泵连接,与拉尖毛细管相对的通道及相连毛细管为出口端。
(4)称取一定量微球,在超声条件下,使其悬浮液中达到稳定悬浮2小时。
(5)利用注射泵或蠕动泵将悬浮液和溶液注入(3)所制备的芯片中,利用激光诱导激发测定微球荧光信号。
所用细管材质为石英毛细管,去掉保护包衣后外径与玻璃十字芯片内径一致;所述拉尖毛细管与微球悬浮液输送泵连接;与拉尖毛细管垂直的两根毛细管用于聚焦鞘液的注入;微球拉尖毛细管相对的通道作用在于形成微球单排列聚焦流,同时用于微球荧光信息激发与采集窗口。所述拉尖毛细管出口端直径为85~100μm。利用激光诱导装置,激发和测定形成单排列微球的荧光信号。
所述为微球为聚苯乙烯微球、分子印迹微球、聚苯乙烯表面印迹微球或聚苯乙烯表面印迹量子点标记微球,其中,微球直径为5-20μm。本发明所具有以下有益效果:
1.本发明进样方法中所用的芯片材料为玻璃,廉价易得,具有一定耐腐蚀性,不易吸附微球悬浮液和鞘液成分,具有良好的光学性能,能够与激光共聚焦系统联用,实现微球的携带信号的采集。
2.本发明进样方法中进一步通过微芯片中毛细管的不同进样位置,改变微球悬浮液与鞘液的比例达到微球单排列聚焦效果,增加了涉及的灵活性和多样性。
3.本发明涉及的微球进样方法可为有机污染物现场监测设备的小型化提供良好的技术支撑。
4.本发明的进样方式形成用于有机污染物识别的微球,粒径在10~15μm,微流控芯片微米尺寸的通道适合于单微球排列的引入。
附图说明
图1为基础十字芯片照片。
图2为本发明实施例提供的4种不同进样毛细管位置芯片显微镜照片(含聚焦流宽度),其中,A为拉尖毛细管位于芯片十字入口处,B为拉尖毛细管位于芯片十字中心,C拉尖毛细管位于芯片十字出口处,D尖毛细管位于芯片十字出口外100μm处。
图3为本发明实施例提供的利用本发明方法对微球进行单排列后采集到的微球荧光信号图,其中,A为空白信号,B为苯乙烯乙酰甲胺磷印迹量子点标记微球信号。
图4为本发明实施例提供的毒死蜱印迹荧光微球浓度与采集荧光信号数量关系。
具体实施方式
下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明具体为(1)利用激光刻蚀法制作十字通道微玻璃芯片;(2)在十字通道微芯片中插入末端拉尖毛细管,毛细管与通道同轴设置,毛细管尖端位于十字芯片不同位置并利用玻璃胶固定,构成不同微球聚焦要求的芯片;(3)以微芯片为核心,与注射泵连接,通过确定不同毛细管尖端位置芯片的微球单排列液流条件,实现微球的单排列和荧光信号采集。本发明的微流控装置可以解决微球单排列聚焦过程中各向受力不均造成的聚焦信号不稳定问题,为微球检测提供一种微型化进样方式。
实施例1
不同进样毛细管位置实现微球单排列进样方法:
(1)设计十字芯片,采用激光刻蚀法获得内径为330μm、大小微2cm×2cm的十字芯片,如图1所示。
(2)将与十字芯片内径相适应的毛细管一端拉尖,尖端内径为85μm,去掉部分包衣,插入上述十字芯片任一一端通道,在显微镜下完成毛细管出口端位置设置和同轴后使用玻璃胶固定毛细管,拉尖一端插入位置分别为:十字入口处、十字中心、十字出口处、十字出口处100μm,如图2所示,利用细管将毛细管与微球悬浮液输送泵连接;
(3)将与十字芯片内径相适应的三根毛细管去掉部分包衣,插入十字芯片另外三个通道内,在显微镜下完成同轴后使用玻璃胶固定毛细管,采用细管将与拉尖毛细管垂直的两根毛细管与鞘液输送泵连接,与拉尖毛细管相对的通道及相连毛细管为出口端。
(4)称取2mg聚苯乙烯乙酰甲胺磷印迹量子点标记微球,加入含鞘液10mL形成的鞘液中,超声20min,形成微球悬浮液,通入尖端毛细管中。
(5)设置微球悬浮液流速和鞘液流速,分别获得微球单排列聚焦流(参见图2),其中,拉尖毛细管位于十字交汇入口处时,悬浮液流速为6mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:35;
拉尖毛细管位于十字交汇中心处时,悬浮液流速为7mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:45;
拉尖毛细管位于十字交汇出口处时,悬浮液流速为10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:70;
拉尖毛细管位于超过十字出口处100μm时,悬浮液流速为9mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:80。
由图2可见,所述拉尖毛细管位于十字交汇入口处时,获得聚焦宽度为10-15μm的微球单排列液流(图2A);拉尖毛细管位于十字交汇中心处时,获得聚焦宽度为10-15μm的微球单排列液流(图2B);拉尖毛细管位于十字交汇出口处时,获得聚焦宽度为20-30μm的微球单排列液流(图2C);拉尖毛细管位于超过十字出口处100μm时,获得聚焦宽度为10-20μm的微球单排列液流(图2D)。
(6)利用激光共聚焦系统对经芯片单排列聚焦后微球所携带荧光信号进行检测,获得预期信号值,如图3所示,其中图3A为空白信号值,图3B为微球信号值。
终上所述,利用本装置可以形成微球单排列并采集单个微球的荧光信号。
实施例2
利用本方法测试了不同浓度毒死蜱荧光印迹微球。
(1)利用上述方法中的拉尖毛细管位于十字交汇中心处的芯片,搭建测试系统;
(2)取4mg毒死蜱荧光印迹微球悬浮于10ml悬浮液溶液中,使用鞘液将悬浮液进行稀释,稀释后微球浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml,分别注入芯片进行分离检测,获得微球荧光值与浓度的关系,如图4所示。
有图可以看出,微球在本设计的芯片中能够形成单排列,在激光共聚焦系统的激发下产生荧光,其采集到的荧光微球数量与浓度呈现良好的线性关系。本方法可应用于有机物印迹荧光微球的检测。
Claims (2)
1.一种实现微球单排列进样的方法,其特征在于:将毛细管插入至十字微芯片通道内,其中任意一个通道内插入一端为拉尖的毛细管,向拉尖的毛细管内输送待输送微球悬浮液,向与拉尖的毛细管垂直的两根毛细管内输送鞘液,将待输送微球悬浮液通过拉尖的毛细管向与其相对的毛细管内形成微球单排列聚焦流,进而实现微球单排列的进样;
所述一端为拉尖的毛细管插入十字微芯片位置为插入至十字微芯片的十字交汇入口处、十字交汇中心处、十字交汇出口处或超过十字交汇出口处100μm;
所述拉尖的毛细管位于十字交汇入口处时,悬浮液流速为4mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:15~2:35时,获得聚焦宽度为10-15μm的微球单排列液流;拉尖的毛细管位于十字交汇中心处时,悬浮液流速为6mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:15~2:45时,获得聚焦宽度为10-15μm的微球单排列液流;拉尖的毛细管位于十字交汇出口处时,悬浮液流速为5mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:25~2:70时,获得聚焦宽度为20-30μm的微球单排列液流;拉尖的毛细管位于超过十字交汇出口处100μm时,悬浮液流速为3mm/s~10mm/s,且悬浮液流速:鞘液流速=2:25~2:80时,获得聚焦宽度为10-20μm的微球单排列液流;
所述微球悬浮液为将2~8mg微球置于10~15mL鞘液中,超声15-20min,待用,悬浮液稳定2小时;其中,鞘液为5-7gTriton100、300-350g乙醇、0.4-0.8gNaOH、超纯水定容至1000mL配制而成的水溶液;
所述微球为聚苯乙烯微球、分子印迹微球、聚苯乙烯表面印迹微球或聚苯乙烯表面印迹量子点标记微球,其中,微球直径为5-20μm;
所述十字微芯片的具体制作过程如下:
(1)设计与毛细管外壁相适应的十字微芯片,利用激光刻蚀法加工,微通道内径为330-350μm,将制备好的玻璃芯片切割为2cm见方的基础芯片;
(2)将与十字微芯片内径相适应的毛细管一端拉尖,去掉部分包衣,插入十字微芯片一端通道,在显微镜下完成拉尖的毛细管出口端位置设置和拉尖的毛细管与通道同轴设置后使用玻璃胶固定毛细管,利用细管将拉尖的毛细管与微球悬浮液输送泵连接;与拉尖的毛细管垂直的两根毛细管用于聚焦鞘液的注入;与插入拉尖的毛细管的通道相对的通道作用在于形成微球单排列聚焦流,同时用于微球荧光信息激发与采集窗口;
(3)将与十字微芯片内径相适应的三根毛细管去掉部分包衣,插入十字微芯片另外三个通道内,在显微镜下完成同轴设置后使用玻璃胶固定毛细管,采用细管将与拉尖的毛细管垂直的两根毛细管与鞘液输送泵连接,与插入拉尖的毛细管的通道相对的通道及与该相对的通道相连的毛细管为出口端;
(4)称取一定量微球,在超声条件下,使其在悬浮液中稳定悬浮2小时;
(5)利用注射泵或蠕动泵将微球悬浮液和鞘液注入步骤(3)所制备的芯片中,利用激光诱导激发测定微球荧光信号。
2.按权利要求1所述的实现微球单排列进样的方法,其特征在于:所述一端为拉尖的毛细管插入十字微芯片位置为插入至十字微芯片的十字交汇入口处或十字交汇中心处。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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