CN108142415B - 一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法 - Google Patents

一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法，其包括如下步骤：1)配制胶状线虫水悬液I；2)配制溶液II：以溶液II的总量为100％，包括的各组分如下：18v％至24v％甘油溶液，0.05v％至0.1v％％甲醛，0.3wt％至0.7wt％CaCl2、0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，余量为水；3)将胶状线虫水悬液I滴入到溶液II中，并伴随搅拌，形成的球状颗粒物即为所述昆虫病原线虫胶囊。

Description

一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法
技术领域
本申请涉及一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法。
背景技术
昆虫病原线虫是20世纪初发展起来的一种很有潜能的生物防治因子。在自然状态下，线虫能够主动寻找寄主，侵染期线虫从寄主的口器、肛门、气门、节间膜等自然孔口进入虫体内，释放其携带的共生菌，共生菌在昆虫体内大量繁殖并产生毒素和抑制物质，使昆虫在24-48h之内患败血症死亡；昆虫组织为线虫的生长发育提供营养，线虫经过几代的繁殖，将昆虫寄主体内的营养物质消耗殆尽，侵染期线虫就会携带着共生菌从寄主体内钻出，开始重新寻找新的寄主。根据昆虫病原线虫这一特殊的侵染特性，可知这一生防因子对于钻蛀性和土栖性害虫具有很好的控制效果。
近年来，线虫的应用范围及应用数量在逐渐扩大，线虫已广泛应用于土栖性害虫，如蛴螬、金针虫、地老虎、蝼蛄、根蛆、韭蛆等害虫的防治。因此，线虫的长期有效贮存和商品化剂型的研制开发是大规模应用昆虫病原线虫防治农林业害虫的必要条件。昆虫病原线虫的贮存方法很多，包括低温浅水贮存法、矿物油贮存法、液氮贮存法、滤纸低温贮存法、海绵贮存法、吸附脱水贮存法、胶囊贮存法、凝胶贮存法。其中只有吸附脱水贮存法、胶囊型贮存法和凝胶贮存法适宜商业大量贮存。
其中，胶囊剂在生物农药剂型的研发和应用中显示出明显的优势。首先通过一定的脱水方式使线虫进入低湿休眠的状态，降低其新陈代谢；其次，胶囊特殊的构造能够有效避免紫外线对线虫的杀伤问题，从而提高生物农药的杀虫效果。
目前，线虫胶囊在实际应用时需要采用相关溶剂溶解胶囊，方法比较繁琐。并且，线虫胶囊常常不能溶解完全，从而导致在喷施过程中容易堵塞喷施器具，使用效果不佳。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本申请之一提供了一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法，其包括如下步骤：
1)配制选自如下之一的胶状线虫水悬液I：
一)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，包括的各组分如下：0.8wt％至1.2wt％海藻酸钠，0.3v％至0.5v％亚油酸，0.1v％至0.3v％油酸，3wt％至9wt％葡萄糖，0.3wt％至0.5wt％果糖，0.3wt％至0.5％蔗糖，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，18v％至24v％甘油，0.05v％至0.1v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
二)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：0.8wt％至1.2wt％海藻酸钠，3wt％至9wt％葡萄糖，1.5wt％至2.5wt％果糖，1.5wt％至2.5wt％蔗糖，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，18v％至24v％甘油，0.05v％至0.1v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
三)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：0.8wt％至1.2wt％海藻酸钠，2wt％至3wt％玉米叶粉，18v％至24v％甘油，0.05v％至0.1v％甲醛，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
2)配制溶液II：以溶液II的总量为100％，包括的各组分如下：18v％至24v％甘油溶液，0.05v％至0.1v％％甲醛，0.3wt％至0.7wt％CaCl2，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，余量为水；
3)将胶状线虫水悬液I滴入到溶液II中，并伴随搅拌，形成的球状颗粒物即为所述昆虫病原线虫胶囊。
在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤4)，将步骤3)中的所述昆虫病原线虫胶囊滤出，置于90％-100％相对湿度下，14-18℃储存。
在一个具体实施方式中，在步骤1)中，配制选自如下之一的胶状线虫水悬液I：
一)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，包括的各组分如下：1wt％海藻酸钠，0.3v％至0.5v％亚油酸，0.25v％油酸，3wt％至9wt％葡萄糖，0.4wt％果糖，0.4wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
二)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，3wt％至9wt％葡萄糖，2wt％果糖，2wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
三)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，2wt％至3wt％玉米叶粉，18v％甘油，0.075v％甲醛，0.5wt％山梨酸钾，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫。
在一个具体实施方式中，在步骤1)中，配制选自如下之一的胶状线虫水悬液I：
一)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，包括的各组分如下：1wt％海藻酸钠，0.5v％亚油酸，0.25v％油酸，3wt％葡萄糖，0.4wt％果糖，0.4wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为2×104IJs/mL的线虫；
二)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，9wt％葡萄糖，2wt％果糖，2wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为2×104IJs/mL的线虫；
三)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，3wt％玉米叶粉，18v％甘油，0.075v％甲醛，0.5wt％山梨酸钾，其余量为水，以及浓度为2×104IJs/mL的线虫。
在一个具体实施方式中，2)配制溶液II：以溶液II的总量为100％，包括的各组分如下：18v％甘油溶液，0.075v％甲醛，0.5wt％CaCl2、0.5wt％山梨酸钾，余量为水。
在一个具体实施方式中，在步骤4)中，将所述胶状线虫水悬液I以15-35滴/min的速度滴入溶液II中。
在一个具体实施方式中，在步骤4)中，将所述胶状线虫水悬液I以15-20滴/min的速度匀速滴入溶液II中。
在一个具体实施方式中，所述水为蒸馏水、超纯水和去离子水中的至少一种。
本申请之二提供了一种根据本申请之一中任意一项所述的方法制备得到的昆虫病原线虫胶囊。
在一个具体实施方式中，昆虫病原线虫的数量为150条至250条。
在一个具体实施方式中，所述昆虫病原线虫胶囊的粒径为0.3cm或0.33cm。
在一个具体实施方式中，所述昆虫病原线虫胶囊的粒径为0.35cm、0.38cm或0.4cm。
在一个具体实施方式中，所述昆虫病原线虫胶囊的质量为0.02g至0.05g。
在一个具体实施方式中，所述昆虫病原线虫胶囊的质量为0.03g至0.04g。
本申请的有益效果：
通过本申请的方法制备得到的线虫胶囊可以省去胶囊溶解的步骤，直接田间撒施线虫胶囊，从而解决了线虫胶囊溶解不完全导致喷施过程中容易堵塞喷施器具的技术问题。由于本申请的线虫胶囊的施用方式为直接田间撒施，因此，在制备过程中，所形成的线虫胶囊颗粒如果存在个别个体大小不均一，对后续的施用方式不会产生影响，也不影响其杀虫效果。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本申请的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本申请的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
小地老虎的饲料配方：麦胚粉15g、玉米粉15g、蔗糖28g、酪蛋白28g、琼脂20g、韦氏盐8g、维生素混合液26.4mL、山梨酸1.4g、尼伯金1.4g、甲醛3mL、10％氢氧化钾16mL、95％乙醇15mL、水650mL。
实施例1
胶囊囊壁配制方法：胶状线虫水悬液I的配制：1wt％海藻酸钠，3wt％葡萄糖，2wt％果糖，2wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为灭菌蒸馏水，其中含有浓度为2×104IJs/mL的线虫；溶液II的配制：18v％甘油溶液，0.075v％甲醛，0.5wt％CaCl2、0.5wt％山梨酸钾，余量为蒸馏水；
将胶状线虫水悬液I通过注射器装置悬于溶液II上方10cm处以20滴/min自动匀速滴入溶液II。用玻璃棒迅速搅拌后静置20min，用筛网将成型的胶囊从溶液II中滤出，放在9cm培养皿中。胶囊呈透明圆球颗粒体，测定其胶囊直径大小及寄主昆虫取食效果。
胶囊直径大小测定：每次取30粒线虫胶囊，采用游标卡尺测量胶囊直径，取平均值，结果见表1。
胶囊的质量测定：每次取10粒线虫胶囊，采用千分之一电子天平测量胶囊重量，取平均值。共取3次，合计30粒胶囊，结果见表1。
胶囊中线虫数量的测定：每次取10粒线虫胶囊，采用光学显微镜观察记录胶囊内线虫数量，取平均值。共取3次，合计30粒胶囊，结果见表1。
将培养皿在100％相对湿度，16℃恒温储存1个月后测定线虫存活率，具体方法：取90粒胶囊颗粒置于直径为9cm的培养皿中，采用0.5％柠檬酸溶液溶解胶囊。每个处理组胶囊溶解检测均重复3次，观察记录线虫存活率。结果见表1。
实施例2
胶状线虫水悬液I中的葡萄糖含量为6wt％，其他同实施例1。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例3
胶状线虫水悬液I中的葡萄糖含量为9wt％，其他同实施例1。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例4
胶状线虫水悬液I的配制：1wt％海藻酸钠，0.3wt％亚油酸，0.25wt％油酸，3wt％葡萄糖，0.4wt％果糖，0.4wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为灭菌蒸馏水，其中含有浓度为2×104IJs/mL的线虫。
其他同实施1。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例5
胶状线虫水悬液I中的亚油酸含量为0.4wt％，其他同实施例4。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例6
胶状线虫水悬液I中的亚油酸含量为0.5wt％，其他同实施例4。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例7
胶状线虫水悬液I的配制：1wt％海藻酸钠，2wt％玉米叶粉，18v％甘油，0.075v％甲醛，0.5wt％山梨酸钾，其余量为灭菌蒸馏水，其中含有浓度为2×104IJs/mL的线虫。
其他同实施1。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例8
胶状线虫水悬液I中的玉米叶粉含量为2.5wt％，其他同实施例7。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例9
胶状线虫水悬液I中的玉米叶粉含量为3wt％，其他同实施例7。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
对比例1
线虫悬浮液配制：将收获的线虫加入适量清水配成线虫悬浮液，线虫浓度≥2×104IJs/mL。
胶囊囊壁配制方法：
胶状线虫水悬液I配制：18v％甘油溶液，0.075v％甲醛，1wt％海藻酸钠，2wt％黄原胶，0.5wt％山梨酸钾，余量为蒸馏水，其中含有浓度为2×104IJs/mL的线虫；
溶液II配制：18v％甘油溶液，0.075v％甲醛，0.5wt％CaCl2，0.5wt％山梨酸钾，余量为蒸馏水；
将胶状线虫水悬液I滴加入溶液II，方法同实施例1。
胶囊直径大小、胶囊质量、胶囊中线虫的数量及线虫存活率测定结果见表1。
实施例10
1、小地老虎直接取食昆虫病原线虫胶囊致死率的测定：
采用平皿法，选取4龄小地老虎作为试虫，实验前提前饥饿12h。培养皿中铺垫双层灭菌滤纸，选取10头4龄小地老虎幼虫放于培养皿中。提前观察记录取用的线虫胶囊内线虫数量，使得每皿中试虫的线虫侵染剂量均为400IJs/头。将侵染剂量一致的上述制备并保存了1个月的线虫胶囊分别放于培养皿内，将培养皿封闭并放置于培养箱中(28℃，80％湿度)。设3次重复，每次重复10头试虫。分别于24h和48h观察记录小地老虎试虫死亡率。结果见表2。
2、昆虫病原线虫胶囊溶解液对小地老虎致死率的对比测定：
采用平皿法，培养皿中铺垫双层灭菌滤纸，每皿选取10头4龄小地老虎作为试虫。将上述实施例中制备的线虫胶囊用0.5％柠檬酸钠溶液完全溶解，将析出的线虫转移到0.5％NaCl溶液中复苏，备用。灭菌滤纸浸润线虫悬浮液(侵染剂量为400IJs/头)，28℃下侵染培养。设3次重复，每次重复10头试虫。分别于24h和48h观察小地老虎的死亡数。结果见表3。
结论：从表1对比数据可以看出，不同实施例的线虫胶囊外观直径及颗粒重量有所不同。随着胶囊配方中主要成分所占比例增加，胶囊直径及重量也会稍有增加。但与对比例比较可知，不同实施例胶囊内所包裹的线虫数量没有明显不同，胶囊在100％相对湿度，16℃恒温储存1个月后线虫存活率均可达到90％以上。
从表2中可以看出，以4龄小地老虎为试虫，试虫直接取食不同实施例的线虫胶囊48h后均可以达到100％死亡率。从处理24h的数据可以看出，不同实施例的线虫胶囊致死率均高于对比例，其中仅添加低含量葡萄糖的实施例1与添加高含量亚油酸的实施例6对小地老虎的致死率相当，而添加葡萄糖成分的实施例1、2、3致死率要高于添加亚油酸的实施例4和5以及玉米叶粉的实施例7、8、9，又以实施例3(即葡萄糖含量为9wt％的线虫胶囊)致死效果最好。
从表3可知，不同实施例胶囊配方中的成分对胶囊溶解后的线虫析出没有明显影响。胶囊溶解后线虫进行寄主体壁侵染这种方法致死较快，其中添加葡萄糖成分的实施例1、2、3处理24h后试虫均可达到100％死亡，效果最佳。
表1不同配方线虫胶囊的性能比较
Figure GDA0002574564300000071
表2小地老虎对不同线虫胶囊直接取食后死亡率
Figure GDA0002574564300000072
Figure GDA0002574564300000081
表3不同线虫胶囊溶解后对小地老虎的致死率
样品 24h试虫死亡率％ 48h试虫死亡率％
实施例1 100±0 100±0
实施例2 100±0 100±0
实施例3 100±0 100±0
实施例4 96.67±3.33 100±0
实施例5 96.67±3.33 100±0
实施例6 100±0 100±0
实施例7 96.67±3.33 100±0
实施例8 100±0 100±0
实施例9 100±0 100±0
对比例1 100±0 100±0
虽然本申请已经参照其优选地具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本申请的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。例如，可以对本申请的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物或方法步骤。所有的这些改变均包括在本申请的权利要求的范围内。并且利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种制备昆虫病原线虫胶囊的方法，其包括如下步骤：
1)配制选自如下之一的胶状线虫水悬液I：
一)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，包括的各组分如下：0.8wt％至1.2wt％海藻酸钠，0.3v％至0.5v％亚油酸，0.1v％至0.3v％油酸，3wt％至9wt％葡萄糖，0.3wt％至0.5wt％果糖，0.3wt％至0.5％蔗糖，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，18v％至24v％甘油，0.05v％至0.1v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
二)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：0.8wt％至1.2wt％海藻酸钠，3wt％至9wt％葡萄糖，1.5wt％至2.5wt％果糖，1.5wt％至2.5wt％蔗糖，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，18v％至24v％甘油，0.05v％至0.1v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
三)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：0.8wt％至1.2wt％海藻酸钠，2wt％至3wt％玉米叶粉，18v％至24v％甘油，0.05v％至0.1v％甲醛，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
2)配制溶液II：以溶液II的总量为100％，包括的各组分如下：18v％至24v％甘油溶液，0.05v％至0.1v％％甲醛，0.3wt％至0.7wt％CaCl2，0.4wt％至0.6wt％山梨酸钾，余量为水；
3)将胶状线虫水悬液I滴入到溶液II中，并伴随搅拌，形成的球状颗粒物即为所述昆虫病原线虫胶囊。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤4)，将步骤3)中的所述昆虫病原线虫胶囊滤出，置于90％-100％相对湿度下，14-18℃储存。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，配制选自如下之一的胶状线虫水悬液I：
一)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，包括的各组分如下：1wt％海藻酸钠，0.3v％至0.5v％亚油酸，0.25v％油酸，3wt％至9wt％葡萄糖，0.4wt％果糖，0.4wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
二)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，3wt％至9wt％葡萄糖，2wt％果糖，2wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫；
三)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，2wt％至3wt％玉米叶粉，18v％甘油，0.075v％甲醛，0.5wt％山梨酸钾，其余量为水，以及浓度为1×104IJs/mL至2×104IJs/mL的线虫。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，配制选自如下之一的胶状线虫水悬液I：
一)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，包括的各组分如下：1wt％海藻酸钠，0.5v％亚油酸，0.25v％油酸，3wt％葡萄糖，0.4wt％果糖，0.4wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为2×104IJs/mL的线虫；
二)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，9wt％葡萄糖，2wt％果糖，2wt％蔗糖，0.5wt％山梨酸钾，18v％甘油，0.075v％甲醛，其余量为水，以及浓度为2×104IJs/mL的线虫；
三)以胶状线虫水悬液I的总量为100％，各组分如下：1wt％海藻酸钠，3wt％玉米叶粉，18v％甘油，0.075v％甲醛，0.5wt％山梨酸钾，其余量为水，以及浓度为2×104IJs/mL的线虫。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述胶状线虫水悬液I以15-35滴/min的速度滴入溶液II中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述悬胶状线虫水悬液I以15-20滴/min的速度匀速滴入溶液II中。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法制备得到的昆虫病原线虫胶囊。
8.根据权利要求7所述的昆虫病原线虫胶囊，其特征在于，昆虫病原线虫的数量为150条至250条。
9.根据权利要求7或8所述的昆虫病原线虫胶囊，其特征在于，所述昆虫病原线虫胶囊的粒径为0.3cm或0.33cm。
10.根据权利要求7或8所述的昆虫病原线虫胶囊，其特征在于，所述昆虫病原线虫胶囊的粒径为0.35cm、0.38cm或0.4cm。
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