CN108139355B - 利用毛细管电泳的固相萃取 - Google Patents

利用毛细管电泳的固相萃取 Download PDF

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Abstract

公开了方法、系统和装置，其提供具有与可以与质谱仪(200)的入口连通的分离通道(25)相邻(在其上游)的至少一个固相萃取(SPE)床的流体装置。流体装置可以被配置为使用向背景电解质(BGE)储蓄器(20)和样品储蓄器(30)独立施加的压力运行，以用于压力驱动的注入，所述压力驱动的注入可以将离散样品塞注入至分离通道中，这不需要向样品储蓄器施加电压并且可以允许要使用的通道中聚焦方法。所述方法、系统和装置特别适用于与质谱仪一起使用，但是光学或其他电子检测器也可以与所述流体装置一起使用。

Description

利用毛细管电泳的固相萃取
相关申请
本申请要求2016年3月24日提交的美国专利申请序列号15/079,541的权益和优先权，其要求2015年10月20日提交的美国临时申请序列号62/243,919的权益和优先权，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
技术领域
本发明涉及样品处理，其可以特别适用于与质谱仪连接的电喷雾电离和/或样品处理系统。
发明背景
电喷雾电离(“ESI”)是用于通过质谱分析在溶液中含有的生物材料的重要技术。参见，例如，Cole,R.B.电喷雾电离质谱：基本原理、仪器&应用(Electrospray IonizationMass Spectrometry:Fundamentals,Instrumentation&Applications)；John Wiley andSons,Inc.：纽约，1997。电喷雾电离在1980年代末开发并且通过Fenn的工作推广。参见，例如，Fenn JB,Mann M,Meng CK,Wong SF&Whitehouse CM(1989)，用于大生物分子的质谱法的电喷雾电离(Electrospray ionization for mass spectrometry of largebiomolecules)，Science 246,64-71。简单而言，电喷雾电离包括使用电场以将样品溶液分散至带电液滴中。通过随后的液滴蒸发，在液滴中含有的分析物离子从液滴表面场发射或者离子被去溶剂化而得到气相分析物离子。暴露于电场并且要被分散的液体的来源理想地是小的面积延伸范围(areal extent)的来源，因为电喷雾发射器的尺寸直接影响所产生的液滴的尺寸。较小的液滴更迅速地去溶剂化并且在每个液滴中存在较少的分子，得到较高的电离效率。这些离子可以通过质量分析仪表征以确定质荷比。可以通过采用串联质谱法技术得到进一步的分析物结构信息。
为了使电离抑制和MS光谱复杂性最小化，分析物在电喷雾电离之前的分离是重要的。已经证实微流体毛细管电泳与整体电喷雾电离为使液相化学分离与质谱法检测偶联的快速且高效的方法。参见，例如，Anal.Chem.2008,50,6881-6887；和Anal.Chem.2015,87,2264-2272。采用样品向分离通道中的电动力流动的常规微流体方法经历注入偏置并且不能有效用于一些装置上样品聚焦方法。此外，对于实现高效分离来说，样品的界限明确的条带向微流体装置的分离通道中的注入可能是重要的。
将样品处理与CE整合的大多数努力可以被分类为基于电泳或基于色谱。基于电泳的技术，包括样品堆积、清扫，pH诱导的堆积、和瞬时等速电泳(tITP)，可以简单地实施并且可以需要很少的仪器开发。遗憾的是，这些技术通常不能加载大于毛细管体积的样品体积，这限制了可得到的浓度和敏感度改进。此外，电泳方法通常将基质组分同等地浓缩为目标分析物，这可能降低分离性能。最后，这些方法可能会限于窄范围的分析物和缓冲液条件，并且可能不会与其他样品处理技术一样广泛适用。
另一方面，基于色谱的技术，如固相萃取(SPE)，通常比基于电泳的方法更加多用途，并且可以基于向色谱吸附剂上加载多个毛细管体积的能力而提供较高的预浓缩值。参见，例如，Ramautar等，电泳(Electrophoresis)2014,35,128-137，其内容在此通过引用结合在本文中。然而，这些方法表现出它们本身的缺点。在分离毛细管中SPE吸附剂的存在可能会导致堵塞和电渗流(EOF)破坏，降低分离性能。此外，在这种情况中，基质组分进入分离毛细管，这可能会导致壁相互作用(wall interaction)并且进一步降低分离性能。其中SPE吸附剂与CE毛细管分离但是通过流动物流与管道和阀连接的在线偶联是用于将SPE与CE组合的最常见的方法。SPE吸附剂与CE毛细管的解偶联可以抑制或防止堵塞和EOF破坏。此外，在SPE吸附剂和CE毛细管之间包括阀可以将基质组分引导至废料并且防止其进入CE毛细管。遗憾的是，SPE和CE的在线偶联通常需要复杂的仪器。此外，样品条带从SPE吸附剂向CE毛细管的转移通常引起条带变宽，限制了得到的分离性能。此外，存在于在线系统中的死体积可能会将浓缩的分析物条带稀释，降低可以实现的预浓缩的量。将样品处理与CE偶联而不牺牲分离性能可能会是非常具有挑战性的任务。
本发明实施方案的概述
本发明的实施方案涉及整合样品处理并且采用具有微芯片CE-ESI和/或微芯片CE检测器系统的在线固相萃取(SPE)的微流体样品处理系统和方法。
本发明的实施方案提供使用流体装置的可以整合将样品处理与在线SPE整合的流体系统和方法。
本发明的实施方案提供SPE-CE-MS和/或SPE-CE检测器系统和方法，其可以被配置为消除或减少在使用瞬时等速电泳(tITP)在SPE床和CE毛细管之间转移给样品带来的条带变宽，以在分离之前使分析物条带重新聚焦。tITP可以用作非线性电泳聚焦技术，其中样品夹在前导快速移动电解质(LE)和尾随较慢移动电解质(TE)之间。样品分析物将会基于它们的电泳迁移率聚焦于不明显区域。通过使用这种技术，可以降低在SPE洗脱和转移步骤期间给样品带来的条带变宽，得到窄的注入塞(plug)，允许高性能分离。样品预浓缩因子可以大于两个数量级，而没有任何分离性能的降低。
在一些具体的实施方案中，CE-ESI-MS和/或CE光学检测器系统可以采用利用可以独立应用于多个不同流体储蓄器的简单的、压力驱动的注入方法的流体装置。
在一些实施方案中，压力驱动的样品加载和/或注入方法也可以与装置上样品聚焦方法如瞬时等速电泳一起使用。
本发明的实施方案涉及样品处理的方法。所述方法包括提供流体装置，所述流体装置具有与背景电解质(BGE)储蓄器流体连通的至少一个微流体或纳米流体分离通道以及与所述分离通道流体连通的纳米流体或微流体样品通道。所述样品通道包括至少一个固相萃取(SPE)床。所述方法还包括使样品流动通过所述样品通道，穿过所述至少一个SPE床，并且进入所述分离通道中，然后从在所述分离通道中的所述样品中电泳分离分析物组分，并且进行以下各项中的至少一种：(a)将所述分析物组分从与所述分离通道流体连通的发射器向收集装置或质谱仪入口中的至少一个电喷雾；和(b)检测与在所述分离通道中或从所述分离通道中出来的所述分析物组分相对应的信号。
所述方法可以包括在所述电泳分离之前将所述样品预浓缩。
样品可以是电离样品。
预浓缩可以包括在具有第一迁移率的前导电解质之后并且在具有低于所述第一迁移率的第二迁移率的尾随电解质之前使在所述分离通道中的所述电离样品在第一方向上流动，从而如果所述样品包括多个组分，则在所述第一方向上，具有最高迁移率的所述样品的组分正好在所述前导电解质之后流动，并且具有最低迁移率的所述样品的组分正好在所述尾随电解质之前流动。
可以在不引导所述样品通过阀的情况下使所述样品流动穿过所述至少一个SPE床并且进入所述分离通道中。
电泳分离分析物组分可以包括向所述流体装置施加电场从而所述电场的至少一个组分与所述分离通道的一部分的轴向平行。
施加电场可以包括在所述BGE储蓄器中的第一位置和所述第一位置的下游的第二位置之间施加电势差。所述第二位置可以位于所述分离通道中，或位于泵通道中，或位于与所述流体装置的所述分离通道或所述泵通道之一或二者流体连通的储蓄器中。
所述方法可以包括使离子配对剂在所述样品之前或连同所述样品一起流动穿过所述至少一个SPE床；将所述离子配对剂从所述样品通道冲洗至与所述样品通道流体连通的废料通道中；和在将所述离子配对剂从所述样品通道冲洗之后，使洗脱流体在所述电泳分离之前或期间在所述样品通道中流动。
所述离子配对剂可以包括三氟乙酸(TFA)。
所述方法可以包括，在使所述样品流动通过所述样品通道并且穿过所述至少一个SPE床之后，使洗脱流体流动通过所述样品通道并且穿过所述至少一个SPE床。
所述方法可以包括，在使所述样品流动穿过所述至少一个SPE床之前，通过使预调节流体流动穿过所述至少一个SPE床并且进入所述流体装置的废料储蓄器中来预调节所述SPE床。
所述方法可以包括，在使所述样品流动通过所述样品通道之前，通过使SPE材料流动进入所述样品通道中而在所述样品通道中形成所述至少一个SPE床。
所述SPE床具有沿着由所述样品通道限定的流动方向测量的、可以在100μm至1000μm之间的长度，以及可以在约50pL至约10nL之间的体积。
所述方法可以包括使用阻塞部件以至少部分堵塞所述样品通道。所述阻塞部件可以与最接近所述分离通道的所述至少一个SPE床的末端相邻放置。
所述方法可以包括通过使废料所述BGE储蓄器、废料储蓄器、和包括所述样品的样品储蓄器的密封的顶部空间加压来使所述样品流动通过所述样品通道。所述BGE储蓄器、所述废料储蓄器、和所述样品储蓄器可以各自与所述分离通道流体连通。在不向所述样品储蓄器、所述BGE储蓄器、或所述废料储蓄器施加电压的情况下和/或在所述样品通道、所述BGE通道和所述废料通道中的任一个都没有电势梯度的情况下，可以使所述样品流动通过所述样品通道。
所述方法可以包括施加流体压力以使得样品流动通过所述样品通道，穿过所述至少一个SPE床，并且进入所述分离通道中。
在使用的情况下，施加流体压力可以包括(a)第一，向所述流体装置的废料储蓄器的密封的顶部空间和所述流体装置的样品储蓄器的密封的顶部空间中的每一个同时施加在0.1磅/平方英寸(psi)至50psi之间的压力。向所述废料储蓄器的所述密封的顶部空间施加的压力小于向所述样品储蓄器的所述密封的顶部空间施加的压力。方法之后包括：(b)第二，向所述BGE储蓄器的密封的顶部空间并且向所述样品储蓄器的所述密封的顶部空间同时施加压力；和(c)第三，降低向所述样品储蓄器的所述密封的顶部空间施加的所述压力并且向所述BGE储蓄器的所述密封的顶部空间施加在0.1psi至50psi之间的压力，从而向所述BGE储蓄器的所述密封的顶部空间施加的所述压力大于向所述样品储蓄器的所述密封的顶部空间施加的所述压力以将所述样品从所述样品通道冲洗至所述分离通道中。
从所述样品中电泳分离分析物组分可以包括当所述样品在所述分离通道中时，降低向所述BGE储蓄器的所述密封的顶部空间施加的所述压力并且在所述BGE储蓄器中的第一位置和所述第一位置的下游的第二位置之间施加电势差。
从所述样品中电泳分离分析物组分可以包括移除向所述BGE储蓄器的密封的顶部空间施加的压力，同时在所述BGE储蓄器中的第一位置和所述第一位置的下游的第二位置之间施加电势差。
可以进行第二/(b)步骤，从而向所述BGE储蓄器和所述样品储蓄器的所述密封的顶部空间施加的同时的压力各自在0.5psi至50psi之间，并且可以进行第三/(c)步骤，从而没有向所述样品储蓄器的所述密封的顶部空间施加压力并且向所述BGE储蓄器的所述密封的顶部空间施加以冲洗所述样品的所述压力在之间0.1psi至10psi之间。
流体装置可以包括：第一压力供给管，所述第一压力供给管与第一加压气体源连通并且通过第一阀连接至所述BGE储蓄器的密封的顶部空间；第二压力供给管，所述第二压力供给管与所述第一加压气体源或第二加压气体源连通并且通过第二阀连接至与所述样品通道流体连通的样品储蓄器的密封的顶部空间；和第三压力供给管，所述第三压力供给管与所述第一加压气体源、所述第二加压气体源、和降压装置中的一个流体连通并且通过第三阀连接至废料储蓄器的密封的顶部空间。废料储蓄器可以与废料通道(可以任选在所述样品通道对面)流体连通，并且与分离通道流体连通。所述方法还可以包括：以限定顺序电子打开并且关闭所述第一、第二和第三阀，以使所述样品流动通过所述样品通道，穿过所述至少一个SPE床，并且进入所述分离通道中。
所述方法还可以包括：在质谱仪中捕获所述分析物组分的离子；检测与所述捕获的离子相对应的电子信号；和基于所述电子信号产生与所述分析物组分相对应的质谱信息。
另外的其他实施方案涉及微流体分析系统。所述系统包括：微流体装置，所述微流体装置包括与背景电解质(BGE)储蓄器流体连通的至少一个分离通道、与样品储蓄器和所述分离通道流体连通并且包括至少一个固相萃取(SPE)床的样品通道、以及与所述分离通道流体连通的废料储蓄器。所述系统还包括：第一气体供给管，所述第一气体供给管将第一加压气体供给与所述BGE储蓄器的密封的顶部空间通过第一阀连接；第二气体供给管，所述第二气体供给管将第二加压气体供给与所述样品储蓄器的密封的顶部空间通过第二阀连接；和第三气体供给管，所述第三气体供给管将第三加压气体供给或降压装置与所述废料储蓄器的密封的顶部空间通过第三阀连接。所述废料储蓄器与废料通道流体连通，所述废料通道将所述废料储蓄器与所述分离通道流体连接。所述系统还包括：电极，所述电极延伸至所述BGE储蓄器中从而当在所述BGE储蓄器中存在流体时所述电极与所述流体接触；和控制器，所述控制器与电压源并且与所述第一、第二和第三阀电连通。所述控制器被配置为使得在所述系统运行期间所述控制器引导第一、第二和第三阀打开并且关闭以使样品流动通过所述样品通道、穿过所述至少一个SPE床并且进入所述分离通道，并且在所述分离通道中电泳分离分析物组分，而不在所述样品通道和/或SPE床中施加电动电压和/或电压梯度。
所述样品通道可以包括与最接近所述分离通道的所述至少一个SPE床的末端相邻放置的至少一个阻塞部件以将SPE材料保持在所述SPE床内。
所述SPE床具有沿着由所述样品通道限定的流动方向测量的、可以在100μm至1000μm之间的长度，以及可以在约50pL至约10nL之间的体积。
所述样品通道可以是无阀的，从而所述SPE床与所述分离通道不间断流体连通。
一些实施方案涉及质谱系统，所述质谱系统包括质谱仪和在所述质谱仪上或与所述质谱仪连通的微流体装置。所述微流体装置包括与背景电解质(BGE)储蓄器流体连通的至少一个分离通道、与所述分离通道流体连通的样品通道、与所述样品通道流体连通的样品储蓄器、与所述分离通道流体连通的废料通道、与所述废料通道流体连通的废料储蓄器、和与所述分离通道流体连通的至少一个电喷雾电离(ESI)发射器。所述样品通道包括至少一个固相萃取(SPE)床。所述系统还包括：第一导管，所述第一导管与耦接至所述BGE储蓄器的第一阀连通；电极，所述电极延伸至所述BGE储蓄器中从而当在所述BGE储蓄器中存在流体时所述电极与所述流体电连通；第二导管，所述第二导管与耦接至所述样品储蓄器的第二阀连通；第三导管，所述第三导管与耦接至所述废料储蓄器的第三阀连通；至少一个电压源，所述电压源与所述电极电连接；第一气体源，所述第一气体源与所述第一和第二导管流体连通；第二气体源或降压装置，所述第二气体源或降压装置与所述第三导管流体连通；和控制器，所述控制器与所述第一气体源、所述第二气体源或降压装置、和所述至少一个电压源电连通。所述控制器被配置为使得在所述系统的运行期间，所述控制器：(i)通过所述第三导管向所述废料储蓄器的顶部空间施加压力并且同时通过所述第二导管向所述样品储蓄器的顶部空间施加压力，以使得向所述废料储蓄器的所述顶部空间施加的所述压力小于向所述样品储蓄器的所述顶部空间施加的所述压力；(ii)在不向在所述样品储蓄器中的流体或不向在所述BGE储蓄器中的流体施加电压的情况下，向所述样品储蓄器和所述BGE储蓄器的所述顶部空间同时施加压力；之后(iii)降低向所述样品储蓄器的所述顶部空间施加的所述压力，从而向所述BGE储蓄器之后施加的所述压力大于向所述样品储蓄器施加的所述压力以将所述样品和流体从所述BGE储蓄器输送至所述至少一个分离通道中；之后(iv)使用所述至少一个电压源沿着所述分离通道施加电场以从所述样品中电泳分离分析物组分；并且之后(v)使用所述至少一个ESI发射器进行所述分析物组分的电喷雾电离以将所述分析物组分的离子向收集装置或所述质谱仪的入口引导。
所述样品通道可以包括与最接近所述分离通道的所述至少一个SPE床的末端部分相邻放置的至少一个阻塞部件。
所述SPE床具有沿着所述样品通道向所述分离通道的流动方向测量的、可以在100μm至1000μm之间的长度，可以在约50pL至约10nL之间的体积，并且可以具有放置在所述分离通道的上游10μm至5cm之间的距离的前导端。
所述样品通道可以是无阀的，从而所述SPE床与所述分离通道不间断流体连通。
另外的其他实施方案涉及流体装置，所述流体装置包括：至少一个微流体或纳米流体分离通道，所述微流体或纳米流体分离通道与背景电解质(BGE)储蓄器流体连通；至少一个纳米流体或微流体样品通道，所述纳米流体或微流体样品通道与所述至少一个微流体或纳米流体分离通道中的相应的一个流体连通；在所述至少一个纳米流体或微流体样品通道中的相应的一个中的至少一个固相萃取(SPE)床，所述固相萃取与所述至少一个微流体或纳米流体分离通道中的相应的一个相邻放置，从而所述至少一个SPE床的前导端距所述分离通道10μm至5cm之间放置；和至少一个纳米流体或微流体废料通道，所述纳米流体或微流体废料通道从所述至少一个分离通道中的相应的一个延伸并且放置在所述至少一个样品通道中的相应的一个的对面。
所述装置可以包括至少一个阻塞部件，所述阻塞部件与最接近所述至少一个分离通道中的相应的一个的所述至少一个SPE床的末端相邻放置，从而其至少部分堵塞所述至少一个样品通道中的相应的一个。
所述至少一个SPE床的所述前导端可以以离所述至少一个分离通道中的所述相应的一个50μm至500μm之间的距离放置。
所述至少一个SPE床的宽度可以大于所述至少一个SPE床的深度。所述宽度在由所述装置限定的平面中并且在与由所述平面内的所述至少一个样品通道限定的流动方向垂直的方向上测量。所述深度在与所述平面并且与所述流动方向垂直的方向上测量。
所述至少一个SPE床具有沿着所述流动方向测量的、可以在100μm至1000μm之间的长度，以及可以在约50pL至约10nL之间的体积。
所述装置可以包括至少一个电喷雾电离发射器，所述电喷雾电离发射器与所述至少一个分离通道流体连通。
要指出的是，针对一个实施方案描述的本发明的多个方面可以结合在不同的实施方案中，尽管未针对其具体描述。也就是说，全部实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留改变任何最初提交的权利要求和/或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以独立于和/或结合任何其他一个或多个权利要求的任何特征的权利，尽管最初未以该方式要求保护。在以下给出的说明书中详细地解释了本发明的这些和其他目的和/或方面。本领域普通技术人员将会根据对以下优选实施方案的附图和详细描述的阅读而理解本发明的另外的特征、优点和详情，这样的描述仅是说明本发明。
附图简述
图1A是根据本发明的实施方案的流体分析系统的示意图。
图1B是根据本发明的实施方案的流体分析系统的另一个实施方案的示意图。
图2A-2H是根据本发明的实施方案的针对用于将样品注入至分离通道中的微流体装置的事件顺序的示意图。
图3A-3F是根据本发明的实施方案的示出压力和电压输入的示例性运行状态的在图1A中所示的流体分析系统的示意图。
图4A-4F是根据本发明的实施方案的流体装置的示意图。
图5A是根据本发明的实施方案的与用于背景电解质(BGE)储蓄器的加压供给管线的气密连接的实例的示意图。
图5B是根据本发明的实施方案的与用于背景电解质(BGE)储蓄器的加压供给管线的气密连接的另一个实例的示意图。
图6A是根据本发明的实施方案的流体装置的示意图。
图6B和6C是根据本发明的实施方案的具有SPE床阻塞部件的样品流动通道的示意性放大局部剖视图。
图6D、6E和6F是根据本发明的实施方案的具有阻塞部件的示例性样品流动通道的示意性放大横截面图。
图7A是根据本发明的实施方案的微流体系统的示意图。
图7B是根据本发明的实施方案的微流体系统的另一个实施方案的示意图。
图8是根据本发明的实施方案的向用于将样品加载/注入至分离通道中的样品储蓄器、废料储蓄器和BGE储蓄器施加压力的时间图的实例。
图9A是根据本发明的实施方案的利用具有压力驱动的注入的随载(onboard)微流体系统的便携式MS装置的示意图。
图9B是根据本发明的实施方案的与微流体装置连通的外部MS的示意图。
图10A和10B是可以用于进行本发明的实施方案的示例性操作的流程图。
图11是根据本发明的实施方案的数据处理系统的框图。
图12A-12C是4肽混合物的电泳图(BPI相对于以分钟表示的迁移时间)。图12A是5μM样品的CE-ESI的电泳图。图12B是50nM样品的SPE-CE-ESI的电泳图。图12C是50nM样品的SPE-tITP-CE-ESI的电泳图。A和B对应于未确定的痕量组分。
图13A和13B是四肽混合物的电泳图。根据本发明的实施方案，图13A使用电动力(EK)注入产生并且图13B使用流体动力注入产生。
图14是来自相对于EK和流体动力驱动的注入的峰面积的门控注入的峰面积比相对于CE(毛细管电泳)迁移时间的图表。
图15A-15D是根据本发明的实施方案的浓度渐增的四肽混合物的SPE-tITP-CEESI(用于MS分析)电泳图。
图16A-16C是根据本发明的实施方案的针对缓激肽(bradykinin)的SPE-tITP-CEESI分析的峰面积、宽度和高度相对于样品浓度(nM)的图表。
图17A-17C是根据本发明的实施方案的针对胸腺五肽(thymopentin)的SPE-tITP-CE ESI分析的峰面积、宽度和高度相对于样品浓度(nM)的图表。
图18A-18C是根据本发明的实施方案的针对肽A的SPE-tITP-CE ESI分析的峰面积、宽度和高度相对于样品浓度(nM)的图表。
图19A-19C是根据本发明的实施方案的针对血管紧张素(angiotensin)II的SPE-tITP-CE-ESI分析的峰面积、宽度和高度相对于样品浓度(nM)的图表。
图20A-20C是根据本发明的实施方案的针对甲硫氨酸脑啡肽(met-Enkephalin)的SPE-tITP-CE-ESI分析的峰面积、宽度和高度相对于样品浓度(nM)的图表。
图21A-21C是根据本发明的实施方案的针对肽B的SPE-tITP-CE-ESI分析的峰面积、宽度和高度相对于样品浓度(nM)的图表。
图22是使用CE-ESI(上和放大插图)和SPE-tITP-CE-ESI(下)分离的磷酸化酶B胰蛋白酶消化物的电泳图(BPI相对于迁移时间(分钟))。
图23是根据本发明的实施方案的0.5mg/mL大肠杆菌消化物的SPE-tITP-CE-ESI分离的电泳图(BPI相对于迁移时间，分钟)。
图24A和24B是本发明的实施方案预期的示出整体SPE-tITP-CE-ESI微流体装置的脱盐能力的SPE-tITP-CE-ESI MS的电泳图。
本发明实施方案的描述
现在将在下文中参照其中示出本发明的实施方案的附图更充分地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施并且不应被解释为限于在本文中给出的实施方案。相似的数字始终是指相似的元件。在附图中，为了清楚，可以将某些层、组件或特征放大，并且虚线示出了任选的特征或操作，除非另外规定。此外，操作(或步骤)的顺序不限于在附图和/或权利要求中给出的顺序，除非具体地另外指出。在附图中，为了清楚，可以将线、层、特征、组件和/或区域的厚度放大，并且虚线示出了任选的特征或操作，除非另外规定。在文字和附图中，针对“图”的缩写“FIG.”和“Fig.”可以可互换地使用。
仅出于描述具体实施方案的目的而在本文中使用的术语并非意在限制本发明。如在本文中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也意在包括复数形式，除非上下文明确地另外指出。将会进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和/或“包括(including)”规定所述的特征、区域、步骤、操作、元件、和/或组件的存在，但是不排除添加一个或多个其他特征、区域、步骤、操作、元件、组件、和/或它们的组的存在。如在本文中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列举项的任何一个和全部组合。如在本文中所使用的，短语如“在X至Y之间”和“在约X至Y之间”应当被解释为包括X和Y。如在本文中所使用的，短语如“在约X至Y之间”意指“在约X至约Y之间”。如在本文中所使用的，短语如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
应理解的是，当提到特征如层、区域或基板在另一个特征或元件“上”时，其可以直接在另一个特征或元件上，或者也可以存在介于中间的特征和/或元件。相反，当例如提到元件“直接”在另一个特征或元件“上”时，不存在介于中间的元件。还应理解的是，当提到特征或元件与另一个特征或元件“连接”、“附连”或“偶联”时，其可以与另一个元件直接连接、附连或偶联，或者可以存在介于中间的元件。相反，当提到特征或元件与另一个元件“直接连接”、“直接附连”或“直接偶联”时，不存在介于中间的元件。尽管针对一个实施方案描述或示出，如此描述或示出的特征可以适用于其他实施方案。
除非另外定义，在本文中使用的全部术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。将会进一步理解的是，术语，如在常用词典中所定义的那些，应当被解释为具有与它们在本申请的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度正式的意义来解释，除非在本文中明确地那样定义。为了简洁和/或清楚，可以不对公知的功能或结构详细描述。
为了方便描述可以在本文中使用空间相关术语如“在......以下”、“在......下方”、“下部”、“在......之上”、“上部”等以描述如在附图中所示的一个元件或特征与另外一个或多个元件或一个或多个特征的关系。应理解的是，除了在附图中描绘的方向之外，空间相关术语意在包括装置在使用或操作中的不同方向。例如，如果将在附图中的装置倒置，则被描述为在其他元件或特征“以下”或“之下”的元件之后定向在另外的元件或特征“之上”。因此，示例性的术语“在......以下”可以包括在......之上和在......以下的方向二者。可以将装置另外定向(旋转90度或在其他取向上)并且相应地解释空间相关的描述符。类似地，在本文中仅出于解释目的而使用术语“向上”、“向下”、“竖直”、“水平”等，除非具体地另外指出。
应理解的是，尽管可以在本文中使用术语第一、第二等以描述多种元件、组件、区域、层和/或部分，这些元件、组件、区域、层和/或部分不应被这些术语限制。这些术语仅用于将一个元件、组件、区域、层或部分与另一个区域、层或部分进行区分。因此，以下讨论的第一元件、组件、区域、层或部分可以被称为第二元件、组件、区域、层或部分，而不违背本发明的教导。
术语“约”意指所述的数字可以从该值变化+/-20％。
术语“分析物”是指经历分析、通常至少对于质谱分析来说具有在目标质荷(m/z)范围内的一个或多个目标离子的分子或物质。分析物可以包括生物分子如聚合物、肽、蛋白等。本发明的实施方案特别适用于分析完整的单克隆抗体。本发明的实施方案特别适用于分析代谢物。
术语“预浓缩(pre-concentration)”是指相对于在引入至流体分析装置或系统时的浓度增加的浓度的分析物，从而通常在引入至分离通道之前处理具有该分析物的样品以含有相对于当引入至系统、装置、或过程时(即在引入至SPE床上游的样品通道或储蓄器和/或分离通道时)的浓度更高的浓度的分析物。术语“进行预浓缩(pre-concentrating)”是指实现预浓缩的过程，通常是芯片上过程。术语“聚焦”是指使用电动力技术进行预浓缩。
术语“微芯片”是指基本上平面的、薄的、并且在一些实施方案中刚性的流体装置。术语“薄”是指小于约10mm、通常约1mm以下的厚度尺寸。微芯片通常具有小于约6英寸的宽度和长度以及小于约5mm、通常在约2000μm至约250μm之间的厚度。
术语“整合”和“整体”及其派生词意指结合至流体装置中或由流体装置进行的组分和/或过程或作用。例如，整体SPE-tITP-CE-ESI微流体装置具有随载SPE床、CE通道、至少一个ESI发射器可以进行tITP。
术语“管线内偶联”是指通常通过在CE毛细管的头部或入口端部的侧或交叉通道与CE毛细管(也被称为分离通道)的入口邻近或相邻包含一种或多种固相萃取(SPE)吸附剂。
术语“SPE床”是指容纳在适合密度下的一定体积的SPE材料(即，吸附剂)从而使样品在进入分离通道之前流经该床的流体通道的区段。
术语“高电压”是指在kV范围内、通常在约1-100kV之间、更通常在约1-20kV之间的电压。ESI过程可以采用若干kV的电势，例如，通常在约1kV至约5kV之间。其他电压可以是适当的。
术语“微流体”是指具有亚毫米或更小尺寸宽度和/或深度的流体流动通道(例如，该术语包括纳米尺寸通道)，并且包括具有在约数十至数百微米的尺寸范围内的宽度和/或深度尺寸的通道。
术语“流体动力驱动的注入”是指在不需要电压的情况下可控地施加至一个或多个流体通道以将用于分析的目标样品输送至分离通道的压力。
所有参考文献(专利、专利申请和文章)通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
在典型的自由区带毛细管电泳(CE)实验中，将样品塞注入至柱中，并且施加的电场使得样品组分根据它们迁移率的差异而分离。分子的迁移率是其电泳迁移率和电渗迁移率以及分离柱的任何驱动的流动(如果存在的话)的总和。
对于“样品”来说，术语“塞(plug)”是指收集/定位在空间区域内如载体流体的空间区域内的一定数量的样品。塞可以是具有限定限定的前导和尾端的物理条带或区段，在相继的塞或条带之间存在不同的间隙。
术语“分离的样品”是指样品混合物的电泳分离的样品和/或组分(即，沿着分离通道的轴向延伸范围空间分离)并且可以或可以不被分离为单独的组分。组分将会基于它们的有效电泳迁移率而分离并且组分的分离将会取决于有效迁移率的差异。可以通过观察在分离通道中的空间分离和/或通过观察它们在电喷雾发射器或检测器的到达时间来检测被分离的样品。有效电泳迁移率被定义为在分离通道中的观察到的速度除以在分离通道中的电场强度，并且将会包括实际电泳迁移率和为分量赋予速度的任何其他作用(包括但不限于电渗输送或压力驱动的输送)的矢量和。“样品”可以包括一种或多种不同组分(即，分析物和周围的基体材料)的集合。样品被引入至流体装置中。在分离期间，样品的“一种或多种分析物组分”可以与其他组分分离以用于分析。
在样品中的分析物可以是任何目标分析物，包括例如，包含合成的和生物大分子、纳米颗粒、小分子、DNA、核酸/多聚核酸、肽、蛋白等的多种混合物。样品可以包括一种或多种极性代谢物，如氨基酸或带电分子、分子、肽、和蛋白。样品可以另外地或备选地包括从生物流体、血液、血清、尿液，干燥血液、细胞生长培养基、裂解细胞、饮料或食物；或环境样品如水或土壤中提取的分子。
低pH是指酸性水平(低于7)并且高pH是指碱性水平(高于7)。
术语“低有机”是指等于或低于25体积％的水平并且“高有机”是指高于25体积％的水平。
对于与SPE相关的某些处理条件来说，低盐含量是指在0-0.1M之间的盐含量，而高盐含量可以是指高于0.1如高于0.1M至约1M的盐含量。
参照图1A，示出了在控制器100c处具有流体装置10的示例性分析系统100。控制器100c可以包括至少一个处理器，所述处理器可以被配置为引导系统100与一系列操作如向流体装置10的组件的一系列电压和/或压力输入一起运行。流体装置10可以是微芯片10c。流体装置10可以包括至少一个分离通道25(其也可以可互换地称为毛细管通道)和与分离通道25流体连通的至少一个固相萃取(SPE)床28。
SPE床28可以位于与分离通道25的上游上端部或入口端部25u连接的侧通道31。侧通道31可以与分离通道35垂直或者可以处于其他角度(参见，例如图4D)。SPE床28可以位于分离通道25和储蓄器30之间。储蓄器30可以被配置为向SPE床28供应限定的流体，如用于分析的样品流体，所述限定的流体在SPE床28之上或通过SPE床28流动，然后流动至分离通道25。SPE床28可以在分析之前预填充或形成，如设置在随时使用的装置中，或者可以在分析之前和/或作为分析的一部分原位填充。容纳至少一个SPE床28的流体通道31可以包括至少一个阻塞部件128，如围堰(weir)128、或膜。在一些实施方案中，阻塞部件128可以是可透过其他流体的，其可以特别适用于其中阻塞部件128完全穿过样品入口通道31而延伸的实施方案。阻塞部件128被配置为允许流体如液体或气体样品S通过SPE床28或在SPE床28之上流动，同时抑制来自床28的SPE材料进入分离通道25。术语“围堰”是指具有穿过样品入口通道31的宽度或部分宽度的阻挡的结构。在一些实施方案中，阻塞部件128位于SPE床28e的末端和分离通道25之间，通常与分离通道相邻，如，例如距离分离通道25约10μm至小于5cm以内，通常在10μm至约500μm之间，并且更通常在约50μm至约500μm之间。
如在图6A中所示，侧通道31(其也可以可互换地称为“样品入口通道”)可以被配置为具有与至少一个阻塞部件128一起并入样品入口通道中的单独的区段。如果是这样的话，单独的储蓄器301、302可以与不同的分支31a、31b连接。分支31a、31b可以流体并入通道31中。一个储蓄器301可以包括样品S并且另一个302可以容纳SPE材料28s和/或处理的其他流体(例如，洗涤液或溶剂等)。每个分支/储蓄器对301/31b、302/31a可以将材料连续地、流动地引入至入口侧通道31。
阻塞部件128可以从天花板31c向下延伸(1281，图6B)或者从底板31f向上延伸(图2B、6F)和/或从侧壁31s向内延伸(图6D、6E)。至少一个阻塞部件128可以是从天花板31c、底板31f或侧壁31s中的两个延伸的多个阻塞部件1281、1282(多至128n，其中n＝1至10)(1281、1282，图6B，1281-1284，图6E、6D)。至少一个阻塞部件128可以具有小于通道31的深度尺寸的高度，通常在深度尺寸的约30-70％之间。例如，对于具有100μm的深度尺寸的通道31来说，阻塞部件128的高度可以在30至70μm之间，如约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、和约70μm。如在图6B中所示，在两个以上阻塞部件1281、1282用于相应床28的情况下，两个阻塞部件可以偏置但是彼此接近地隔开(通常在约1-20μm之间)。在其它实施方案中，如在图6C中所示，阻塞部件1281、1282中的至少两个可以彼此直接对齐。
图6D-6F示出了可以通过蚀刻、研磨、成型等形成的样品通道几何形状的实例。至少一个阻塞部件128的数量和放置仅是说明的方式。
如在图6A中所示，流体装置10包括平面的刚性、半刚性或柔性(聚合物)天花板10c，其密封附连至容纳通常在多个组中的流体通道21、25、31、32的基板10s以将流体通道密封。一个或多个阻塞部件128可以在样品入口通道31中整体形成或者作为单独的组件附连，在使用多于一个的情况下，可以使用整体和单独的组件的组合。
SPE床28可以包括任何适合固相萃取材料和/或包含不同材料的混合物的吸附剂。例如，SPE床28可以包括具有比容纳床28的流体通道31的宽度/深度小(通常小至少30％)的直径和/或最大高度/宽度或长度尺寸的小颗粒。SPE床28可以包括5μm直径的多孔OasisHLB颗粒。适用于SPE床28的其他颗粒类型包括但不限于反相、离子交换、免疫吸附剂、HILIC、正相和混合方式。混合方式的实例是Water's Oasis HLB颗粒。以下提供每种类型的一些实例(要澄清的是，这并不是穷举的清单)。
反相-C4、C8、C18、苯基
HILIC-裸硅石
离子交换-用于磷酸肽的二氧化钛，
亲和-抗体、用于糖肽的凝集素、Nickle-His标签
在一些实施方案中，用于SPE床28的SPE材料可以包括保留性(retentive)反相材料和/或混合方式固定相，如组合的反相保留和离子交换保留。参见，例如，Gilar等，Journal of Chromatography A 2008,1191,162-170；和Li等，Talanta 2015,140,45-51。这些文献的内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
SPE床28可以具有任何适合的尺寸、密度和体积。在一些实施方案中，SPE床28的长度可以在1μm至1cm之间，通常长度在100μm至1000μm之间，如约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm和约1000μm。SPE床28的长度可以小于其所位于的流体通道31，通常小2-1000X之间。SPE床28通常比储蓄器30更接近分离通道25。SPE床28的前导端(最接近分离通道25的末端)可以位于距离分离通道25的入口或边界约10μm至小于5cm以内，通常在10μm至约500μm之间，并且更通常在约50μm至约500μm之间。容纳SPE床28的流体通道31的宽度可以大于深度，通常大2-200X。(填充的)SPE床28的体积可以在约50pL至约10nL之间，如在一些实施方案中约425pL。
可以在样品S分析之前在样品通道31中填充SPE床28。可以将SPE浆料流动地引入至样品通道31中。术语“浆料”是指SPE材料的粘性溶液。SPE浆料的粘度大于用于分析的其他液体的粘度。
在一些实施方案中，可以将低浓度的离子配对剂如三氟乙酸(TFA)引入至流体通道31和SPE床28中以保持样品S。在使用TFA的情况下，其可以以在约0.01％至约1体积％之间的浓度提供。可以在将样品引入至通道31中之前和/或在引入的同时引入这种试剂。可以在洗脱之前将TFA移除(例如，洗涤至废料通道32和/或废料储蓄器35中)以用于在分离通道中引入作为样品塞的样品。取决于SPE吸附剂的化学性质和样品的特性，当前在色谱中使用的任何离子配对剂都可以用于利用这种装置的SPE。之前在离子样品的HPLC分析中已经使用了离子交换色谱系统，包括使用离子对试剂的相分配色谱。离子样品与流动相中的离子对试剂形成离子对以成为电中性的。离子对的疏水特征的增加得到了对反相固定相较高的亲和力并且导致样品分解。
Figure BDA0001634081920000181
参见，例如，具有离子配对剂的不同实例的以下网页：http:// www.tcichemicals.com/eshop/en/us/category_index/00418/#innerlink_10_1_1，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
例如，可以将离子配对剂预加载至流体通道31中(或SPE床28的材料上)或者在分析期间或仅在分析之前原位加入。
仍然参照图1A，系统100可以包括电源95，其可以是高压电源。如示出的，系统100还可以包括通过供给管线/导管70和相应的阀120、130与BGE储蓄器20和侧储蓄器30连通的至少一个加压气体源90。BGE储蓄器20可以对与分离通道25连接的BGE通道21进料。
如示出的，系统100可以包括与废料储蓄器35连通的降压装置91，它们也可以通过相应的阀135连接。降压装置91可以具有主动或被动构造，即可以包括真空器、泵、被抽真空的储蓄器、或在小于向BGE储蓄器20和/或侧储蓄器30施加的压力的压力(通常小于环境压力)下的任何其他封闭体积，其一旦连接就会降低在废料储蓄器35的顶部空间中的压力。
尽管被显示为单独的装置91，降压装置91可以被配置为具有供给管线70以将废料储蓄器35与第一加压气体源90连接并且可以控制压力以提供所需的输入。此外，降压装置91不需要是真空的并且可以在不同压力下运行以提供如以下将会进一步讨论的所需操作工序。
废料储蓄器35可以与分离通道25流体连通。废料储蓄器35可以位于第二侧通道32中。废料通道32可以位于具有SPE床28的侧通道31对面。废料通道32可以与侧通道31横向在一行上(即，图4A)或者可以与侧通道31纵向偏置(即，图4C)。
背景电解质(BGE)储蓄器20可以位于在分离通道25上方的顶部。BGE储蓄器20可以与分离通道直接相邻或者可以具有并入分离通道25中的BGE流动通道21以将BGE储蓄器20放置在离样品通道31和样品废料通道32一定距离。
在图1A中所示的实施方案中，流体装置10具有由样品通道31和样品废料通道32限定的交叉通道，其可以位于分离通道25的对侧上并且可以任选与分离通道25垂直并且横穿延伸以与分离通道25相交。
在一些实施方案中，可以通过加压气体供给90和/或91将限定的压力供应至与相应的储蓄器20、30、35密封附连的相应的气体供给管线70，通常是来自至少一个加压气体源90的管道70的导管或区段。用于提供压力驱动的注入的气体供给90的加压气体可以包括空气和/或稀有气体，如氦或氮或其他惰性气体。图1A示出了分别用于气体供给管线702、701、703的离散式阀120、130、135。阀120、130、135中的任一个或全部可以是三向阀。
还指出，尽管示出系统100具有三个储蓄器20、30、35，可以使用更少或更多的储蓄器以及实际上的侧通道。
图1A还示出，流体装置10可以包括泵40和可以对用于分析的分离的样品50s进行喷雾的至少一个电喷雾电离(ESI)发射器50。泵40可以包括延伸至与ESI发射器50相邻的结点40j的通道40c。可以将来自至少一个发射器50的电喷雾50s提供至收集装置202(图7A)以用于随后的分析和/或提供至具有检测器的质谱仪200的进入孔/入口(图1A)。泵可以任选包括电渗(EO)泵。
图1B示出，分析系统100可以包括具有至少一个SPE床28的流体装置10并且还可以包括至少一个检测器1200以从在分离通道25中的样品获得信号。流体装置10可以被配置为不具有至少一个ESI发射器50并且可以在不需要向质谱仪200输入的情况下使用。例如，检测器1200可以是电子检测器如光学检测器和/或电导检测器(即，包括电流表)。在使用的情况下，光学检测器1200可以包括雪崩光电二极管和激光器，或光电倍增管和传统光源如黑体源或放电源，或对本领域技术人员来说公知的以上的任何组合。检测器1200可以获得针对在分离通道25中的样品的定性和/或定量数据的信号。在一些实施方案中，分析系统100可以包括至少一个检测器1200和至少一个ESI发射器50二者以用于向质谱仪200的入口/进入孔输入。在一些实施方案中，借助检测器1200的质谱仪检测和光学检测二者可以同时进行，即例如可以得到来自质谱仪200的入口的ESI发射器50的信号，同时针对相应样品获得来自检测器1200的信号。
在图1A和1B中示出了分离通道25，其具有蛇形形状但是可以使用其他构造。例如，分离通道25的几何形状可以是直线的或弯曲的，并且通道的横截面轮廓并非全部需要是相同的。对于示例性微流体装置的进一步讨论来说，参见，例如，美国专利申请序列号14/001,549和14/368,971，其内容在此通过引用结合在本文中。
容纳SPE床28的流体(样品)通道31可以具有在40nm至1000μm之间的宽度和/或深度，更通常在约1μm至约100μm之间，如分别约10μm(深度)和70μm(宽度)的通道深度和宽度。如在本文中所使用的，在装置10的平面中(即，在由微流体芯片限定的平面中)并且在与通道31的轴垂直的方向上测量通道31的“宽度”，其中发生与轴平行的方向上通过通道31的流体流动。如在本文中所使用的，在与装置10的平面并且与沿着其测量宽度的方向垂直的方向上测量通道31的“深度”。流体通道21、31和32可以全部具有相同的深度，或者可以具有不同的深度。流体通道21、31和32可以具有相同的宽度或不同的宽度。分离通道25可以具有任何适合的长度，通常在1cm至100cm之间，更通常在约20-30cm之间，如约23cm。
如在图1A和1B中所示，例如，样品通道31是无阀的，从而SPE床28持续保持与分离通道25流体连通，即流体装置10不需要用于从分离通道25中分离SPE床28的任何阀。换句话说，在样品通道31中并且在样品流路中容纳至少一个SPE床28而不需要任何阀以在管线内运行期间将SPE床28分离。
BGE储蓄器20可以在分离通道25的顶部(直接或通过BGE通道21)。BGE通道21可以具有从BGE储蓄器20延伸至SPE床通道31(其也可以被称为“样品通道”，因为样品在进入分离通道25之前被引入至这个通道中以与SPE床28接触)的长度“L1”(图1A、1B)和/或与分离通道25的通道31和废料通道32交叉/交点。长度“L1”可以是任何适合的长度，如，例如长度在1-200mm之间。SPE床通道31可以具有长度“L2”(图1A、1B)并且废料通道32可以具有长度“L3”(图1A、1B)。通道21、31、32中的一个或多个的长度L1、L2、L3可以是任何适合的长度，如约1mm、约5mm、约10mm、约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、或约100mm，但是在一些实施方案中可以使用其他长度。通常，沿着在装置10的平面中(即，在由微流体芯片限定的平面中)的通道的轴测量通道的“长度”(如以上提到的长度L1、L2、和L3)，其中发生与轴平行的方向上通过通道的流体流动。在使用的情况下，注入交叉构造可以使得通道21、31和32具有基本上相同的长度或不同的长度，但是通常是比分离通道25的长度小得多的长度。样品和样品废料通道31、32可以比BGE通道21长或短，例如在1mm至5cm之间，通常长度在约1-100mm之间。在一些实施方案中，样品和样品废料通道31、32长度为在约1-20mm之间，如约8mm。
储蓄器20、30之一或二者可以与一个或多个外部流体来源流体连通以在分析期间向其提供流体，和/或可以在主动分析之前预加载储蓄器20、30之一或二者。
仍然参照图1A，在一些实施方案中，流体结点40j可以用于连接分离/转移通道25和相应的泵通道40c。流体结点可以是与具有纳米尺寸深度的相关纳米结点通道的纳米结点。泵通道40c和/或分离通道25可以具有微米尺寸宽度。结点40j可以具有，例如约50nm的深度和约50μm的宽度。通道的深度可以取决于在实验/分析中使用的缓冲液的离子强度和相应德拜(Debye)长度。纳米通道深度应当约为德拜长度或更小。
图2A-2H和3A-3F示出了可以根据本发明的一些实施方案进行的操作的示例性顺序。图2A和2B示出，可以提供流体装置10并且可以加载或预加载SPE床28以用来使用。图2B示出了具有SPE床28的流体通道31。
图2C和3A示出了可以进行SPE床28的预调节。图2C示出了流体P如来自储蓄器30的溶剂的预调节。图2C和3A示出了在降压装置向废料储蓄器35施加降低的压力如真空V1并且电压关闭时向储蓄器30施加的压力驱动输入P1。图3A示出，在阀120关闭并且电压关闭(即，不向输入口20或40施加)时阀130和135打开。尽管对于阀120/向储蓄器20的压力输入来说压力显示为关闭，可以施加压力但是不足以干扰操作输入。来自储蓄器30的预调节流体P流动穿过/通过SPE床28并且进入废料通道32中，然后流动至废料储蓄器35。BGE溶液B可以从BGE储蓄器20流动。预调节流体P和BGE流体B的流动方向由在图2C中的流动方向箭头指出。
术语“预调节”是指使SPE床28暴露于任何溶剂或适当有机内容物的液体混合物、pH和/或盐含量。预调节试剂或混合物可以基于SPE吸附剂的化学性质和样品S的特性而改变。预调节材料可以是限定的液体，其可以：任选地a)将SPE床润湿(尽管如果在芯片填充步骤期间已经将润湿床这不大是对微芯片的顾虑)和/或b)调节SPE床28以处于适合/合适用于结合目标样品S的所需当前溶剂条件下。例如，在反相SPE中，可以在低有机物条件下进行加载。因此，可以使用预调节步骤确保将SPE床28润湿或暴露于低有机物溶剂。作为另一个实例，在高有机物条件下进行使用HILIC固定相的加载。可以在低盐下进行利用离子交换的加载，同时在高盐下进行洗脱。在一些实施方案中，pH也可能影响加载和洗脱。
图2D和3B示出了样品加载步骤，其中将样品S通过储蓄器30引入至具有SPE床28的流体通道31中。尽管装置10示出了通过相同储蓄器30作为预调节材料引入的样品S，也可以使用单独的储蓄器(未示出)。可以仅使用压力输入如施加的压力P1和降低的压力如真空V1在电压关闭的情况下进行样品加载。图3B示出，在阀120关闭(对进入储蓄器20中的供给管线70关闭)并且电压关闭(即，不向输入口20或40施加)时阀130和135打开。图2E和3C示出了任选的洗涤步骤，其中向储蓄器30(或与通道31流体连通的另一个储蓄器)施加压力P1并且在电压关闭的情况下向废料储蓄器35施加较低压力，通常是真空V1，以穿过SPE床28向流体通道31引入洗涤溶剂并且进入废料储蓄器35中。图3C示出，在阀120关闭并且电压关闭(即，不向输入口20或40施加)时阀130和135打开。
洗涤流体，如预调节材料，可以基于SPE吸附剂的化学性质和一种或多种分析物的特性而改变。洗涤流体的目的是置换盐和任何未结合的物种，而不过度地影响一种或多种目标分析物的保留。例如，在反相SPE中，在低有机物含量条件下进行加载和结合。因此，可以使用低有机物溶液洗涤样品S。在许多情况中，洗涤溶剂和加载溶剂可以是相同的。对于预调节材料/溶剂来说，洗涤流体可以基于对本领域技术人员来说公知的不同机制、HILIC、离子交换等而改变。
图2F和3D示出了可以在洗涤和/或样品加载步骤之后进行以将样品塞Sp分配至分离通道25中的洗脱操作。利用洗脱流体E向储蓄器30施加压力P1，同时还向BGE储蓄器20施加压力P2，并且不需要向废料储蓄器35施加降低的压力如真空(即，不施加真空，但是可以施加正压力以帮助将样品塞Sp保持在分离通道25中)。图3D示出，在阀135关闭并且电压关闭(即，不向输入口20或40施加)时阀120和130打开。如由图2F指出的，洗脱流体E迫使样品塞Sp进入分离通道25中并且可以流动至废料通道32中。
洗脱材料E可以包括高或低有机物含量。如以上使用的，术语“低有机物含量”是指其中有机分析物物质合计占洗脱材料的体积的25％以下的洗脱材料，并且“高有机物含量”是指其中有机分析物物质合计占洗脱材料的大于25体积％的洗脱材料。
洗脱材料E可以包括高或低盐含量。如以上所讨论的，对于与SPE相关的某些处理条件来说，低盐含量是指其中溶解的盐的浓度在0-0.1M之间的洗脱材料，而高盐含量是指其中溶解的盐的浓度高于0.1M如高于0.1M至约1M的洗脱材料。
洗脱材料E可以具有高或低pH。如在本文中所使用的，低pH是指酸性pH水平(低于7)并且高pH是指碱性pH水平(高于7)。
洗脱材料E可以包括盐和有机分析物物质的组合，并且有机物含量和盐含量可以彼此独立地各自为高的或低的。此外，洗脱材料可以具有独立于盐和有机物含量的高或低的pH。
在亲和色谱/亲和SPE中，洗脱材料可以是破坏亲和结合的试剂，如对吸附剂材料具有较高结合亲和力的样品的类似物。可以通过BGE储蓄器和通道20/21和/或通过样品通道31和与其流体连通的储蓄器来引入洗脱和/或tITP材料。
图2G和3E示出了根据本发明的实施方案的可以使用的任选的冲洗操作。可以降低或移除压力输入P1，同时在电压关闭的情况下向BGE储蓄器20施加压力输入P2。也可以降低或移除向废料储蓄器35的压力输入，从而BGE流体向下流动以推动样品塞Sp经过具有SPE床28的流体通道31。BGE流体可以推动洗脱流体E以离开SPE床28前往储蓄器30。图3E示出，在阀130和135关闭并且电压关闭(即，不向输入口20或40施加)时阀120打开。
图2H和3F示出，可以通过向BGE储蓄器20并且向ESI孔施加电压而不向储蓄器30或35施加压力来进行随后在相继的样品塞Sp之间的输送/分离。所施加的电压可以是在储蓄器20的高电压和在ESI孔(例如，在EO泵输入口40)的正电压，以将样品塞Sp驱动至ESI发射器孔50。图3F示出，阀120、130和135关闭并且电压打开(即，向输入口20或40施加)。如以上所讨论的，术语“高电压”是指在kV范围内、通常在约1-100kV之间、更通常在约1-20kV之间的电压。ESI过程可以采用若干kV的电势，例如，通常在约1kV至约5kV之间。其他电压可以是适当的。
通常而言，在本发明的一些实施方案中，可以使用压力(单独)以注入用于微芯片毛细管电泳(CE)的微流体装置10的样品。压力驱动方法具有优于其他微流体注入方法如电压驱动的加载方法的优点，有点在于其可以使用简单的通道几何形状，但是能够通过简单调节施加压力的时间和/或向储蓄器20、30施加的压力的量来产生所需的样品塞Sp尺寸(图2F、2G、2H)。压力驱动的操作还通常不含电动力注入偏置并且不需要向样品储蓄器30施加电压。
在一些实施方案中，在1-5秒内向BGE储蓄器20和样品储蓄器30同时施加的用于注入的压力(图2F、3D)在1和30psi之间，更通常在1至12psi之间。之后，为了使冲洗样品的尾端(图2G、3E)，在BGE储蓄器20中的压力P2可以保持相同或者降低10-80％并且在储蓄器30中的压力可以比BGE储蓄器20的压力下降降低得多，例如通常使得其小于0.1psi，例如零或者在环境或大气压下或低于环境或大气压下(例如，在真空下)。对于压力来说，术语“降低”也可以包括将施加的压力全部移除。
可以在小于注入时间的时间内保持在BGE储蓄器20(单独)上的冲洗压力，其中向储蓄器20、30二者(图2F、3D)施加压力。例如，仅向BGE储蓄器20施加的压力的冲洗时间可以是2秒以下、1秒以下或0.5秒。
然而，尽管压力驱动的加载和注入可以是尤其有用的，本发明的实施方案可以包括使用向微流体装置10施加的一系列不同电压以用于样品加载和/或注入的电动力(EK)门控方法。
在一些实施方案中，压力驱动的方法可以特别适用于进行在线样品浓缩方法，如瞬时等速电泳(tITP)，因为可以注入与背景电解质(BGE)相比具有明显不同性质(导电性，pH、或粘度)的样品塞Sp。在样品/样品储蓄器30中的盐或其他电解质材料可以用于tITP。压力驱动的操作可以仅使用压力驱动的流动将样品(样品塞Sp)的界限明确的条带放置到微流体装置的分离通道25中，并且也可以用于不能通过其他微流体注入方法进行的在线样品聚焦方法。
参照图1和7A，可以通常使用装置外(例如，芯片外)开/关阀120、130、135向在微流体装置10上或与其连通的两种不同的流体储蓄器20、30和/或35施加头部压力。术语“头部压力”是指在液体上方的储蓄器的密封的顶部空间中的气体压力。BGE储蓄器20的头部压力被标记为P2并且样品储蓄器30的头部压力被标记为P1。控制器100c可以与阀120、130、135连通以独立控制何时在相应储蓄器20、30、35施加压力P1、P2和V1。因此，对于样品加载来说，不需要向BGE储蓄器20或样品储蓄器30施加电压(例如，图2D、2F、2G)。
在一些实施方案中，可以配置在装置10内的微流体通道25、31、32以形成简单的注入交叉。
在一些实施方案中，例如，如在图4B中所示，可以不包括样品废料通道32。因此，至少在不采用EK驱动的情况下，可以使用样品通道31与分离通道25的“T”交叉(代替交叉通道构造)并且可以使用相对精确的压力在BGE储蓄器20上实施以使该流体保持固定以用于注入/样品加载。
参照图2F、3D，向样品储蓄器30(P1)和BGE储蓄器20(P2)同时施加压力以将来自样品储蓄器30的样品S(通过指向箭头表示)从样品通道31以及通常的样品废料通道32而不是BGE通道21驱动至分离通道25中。如在图2G、3E中所示，当在分离通道25中的样品塞Sp达到所需长度(通常在BGE储蓄器20和样品储蓄器30二者下游)时，从样品储蓄器30中降低或释放压力，但是在BGE储蓄器20保持压力。如通过箭头表示的，从BGE通道21流动将在样品和废料通道31、32中的样品冲洗，将限定的样品塞Sp(尾端与在交叉通道31、32中的任何相邻的样品分离)留在主液体输送(例如，分离)通道25中。这种压力驱动/注入在不需要向样品储蓄器30的任何电压输入的情况下进行。此时，如在图2H、3E中所示，从BGE储蓄器20中释放压力并且在下游位置(通常分离通道25的端部或末端，如在EO输入口40)的BGE储蓄器20和分离通道25之间施加电压，以进行电泳分离。
向BGE储蓄器20施加的电压可以是高电压HV，尽管在一些实施方案中也可以使用较低的电压。向下游施加的电压V可以是比向BGE储蓄器20施加的电压低的电压。较低的电压V可以是任何适合的EK驱动电压并且可以在BGE储蓄器电压的10％-50％之间。电压可以变化并且通常范围为约+1kV至+30kV，并且较低的电压范围可以为0至+4kV。但是，电压和极性可以针对不同的应用而改变。例如，可以使分离的极性反转，从而在图2H中所示的高电压输入是负的，或更接近零(0)并且反向电压(在图2H中显示为“+V”输入)可以是较高的或甚至负的，这取决于微流体通道的相对长度、分析物的电荷、和ESI过程的极性。本申请的实施方案涉及参照具有指定为“0”伏(“V”)的值的常用的接地电压或参照电压的电压。
在一些实施方案中，可以在仅使用压力驱动的操作使样品流动通过样品通道时将样品储蓄器30、BGE储蓄器20、和废料储蓄器35中的每一个维持在常用的电势，从而不施加电动电压，因为这些储蓄器在不存在外部场的情况下处于相同的电势。可以在整个样品通道31和/或SPE床28上不施加电动电压和/或电压梯度的情况下将样品引入至分离通道25中。
在不向样品储蓄器30、BGE储蓄器20、或废料储蓄器35施加电压的情况下和/或在样品通道31、BGE通道21和废料通道32中的任一个都没有电势梯度的情况下，可以使所述样品流动通过所述样品通道31。
向储蓄器20、30的顶部空间施加的压力可以是低压力，通常在0.1psi至50psi之间，更通常在0.5至30psi之间，在约0.5至约12psi或10psi(0.69巴)之间。压力可以是约0.5psi、约1psi、约1.5psi、约2psi、约2.5psi、约3psi、约3.5psi、约4psi、约4.5psi、约5psi、约5.5psi、约6psi、约6.5psi、约7psi、约8psi、约8.5psi、约9psi、约9.5psi、约10psi、约10.5psi、约11psi、约11.5psi、约12psi。
向废料储蓄器35施加的降低的压力如真空压力可以在约1psi至约15psi之间，通常在约10psi至15psi之间，如10psi、11psi、12psi、13psi、14psi和15psi。
如以上指出的，tITP之前已经被描述为用于毛细管电泳的在线样品聚焦方法。当样品含有具有比分析物离子高的电泳迁移率的相对大浓度的电解质(被称为前导电解质)时，这种现象起作用。如公知的，通常将前导电解质加入至样品溶液中。前导电解质浓度应当比在背景电解质中的电解质浓度明显更高(如高至少5X或10X)，以提供在背景电解质和前导电解质之间的足够最小电导率差异。这是对于具有高浓度的氯化钠或其他限定的电解质的样品的压力驱动的注入所存在的情况。例如，对于具有大约6mM的水合氢离子浓度的pH2.2背景电解质来说，15mM前导电解质是过低的，而等于或高于50mM的浓度对于待观察的tITP来说是足够的。
为了利用tITP的样品聚焦作用，人门可以注入相对于其他样品处理/分析方法的这个样品的较大条带并且可以使用具有大浓度电解质的适合的样品配方。在使用的情况下，如果不全部或完全自由改变样品条带的尺寸，仅通过改变样品加载步骤的头部压力和/或所施加的压力的持续时间，压力驱动的注入方法即允许增加。BGE储蓄器20可以包括包含对于通过通道21引入的tITP来说足够量的钠和/或盐的液体电解质。液体电解质可以任选另外地或备选地通过另一个储蓄器和通道，如通过样品通道31或另一个侧通道引入。可以在图2H、3F中所示的分离之前进行这个tITP，以减少可能会在将分析物样品从SPE床28向分离通道25转移期间引起的条带变宽。
图4A-4F和6A是可以如上所述操作的微流体装置10的非限制性实例。图4A示出，流体通道31可以包括多个空间分离的SPE床28，其被显示为第一和第二SPE床281、282。在使用多于一个SPE床28的情况下，它们可以包括相同的或不同的吸附剂并且具有相同的或不同的体积和/或长度。
图4B示出，微流体装置10不需要废料通道32或废料储蓄器35。图4C示出，废料通道32与穿过分离通道25的样品通道31偏置纵向距离。图4D示出，装置10可以具有多个样品储蓄器30，通过举例的方式显示为三个，301、302、303，其中全部或一些可以具有SPE床28，但是可以使用多于或少于三个。储蓄器30可以对共同的或不同的样品通道31进料，显示为具有不同的样品通道311、312、313，其全部用于单个分离通道25和至少一个BGE储蓄器20(显示为单个BGE储蓄器20和储蓄器通道21)。可以控制样品储蓄器30以依次或连续压力驱动(或在一些实施方案中是EK驱动的)，以穿过SPE床28并且向分离通道25中注入相应的样品塞。装置10也可以任选具有EO泵40。
图4E示出了可以具有显示为两个相邻通道的多个分离通道25的微流体装置10，但是可以在单个装置10上包括多于两个。分离通道25可以对共同或单独的发射器50进料。因此，微流体装置10可以包括多于一个分离通道25和相关的BGE储蓄器20、储蓄器30、SPE床28、废料储蓄器35和通道31、32。在一些具体的实施方案中，单独通道21、25、31、32中的一个或多个可以被配置成具有约1-100μm、例如约75μm的横向尺寸，具有约1-100mm的横向隔开的尺寸。
如在图4F中所示，可以在微流体装置10上/中包括用于参照喷雾的一个或多个参照通道。在使用的情况下，用于从相应ESI发射器50的参照喷雾的参照材料可以提供用于内部校准的一种或多种离子。在一些实施方案中，参照材料提供用于内部校准的单一限定的离子。在其它实施方案中，参照材料可以包括超过所需范围的多种离子，其通常基本超过全部目标m/z范围，以提高质量准确性。
图5A是具有气密装置的BGE储蓄器20的示意图，所述气密装置容纳压力供给管线70和具有在密封的储蓄器20内部延伸从而能够与在储蓄器20中的流体例如液体接触的高电压输入75i(显示为铂线)的(通常高的)电压管线75。术语“气密”意指对储蓄器20、30的密封当操作时不过度地泄漏从而能够为顶部空间20h、30h、35h提供所需压力以用于压力驱动的注入。
压力供给管线70可以设置有具有延伸至密封的顶部空间20h中的开放加压气体路径的管道。对于8mm内径储蓄器壁20w的实例来说，压力供给管线可以是小于该尺寸的管道，例如1/4英寸至约1/16英寸的外径。然而，当在密封连接下向储蓄器头部空间中的供给的尺寸逐步降低时，可以使用较大尺寸的导管。到储蓄器20、30(和/或废料储蓄器35)的相应加压气体供给管线70的密封(例如，气密)连接可以通过环氧树脂、O环、金属或弹性体衬垫、油脂嘴(grease fitting)、和/或其他适合构造提供。图5B示出，加压气体供给管线70可以在共同的套管80中保持与高压线缆75相邻。进一步指出，高压线缆75可以在保持在气体供给管道内部的同时保持行进至顶部空间中。
图5B还示出，可以用帽20c将储蓄器20t的顶部密封并且可以使用侧端口20p将加压气体供给管线70附连至储蓄器20。可以将相同的布置用于样品储蓄器30和/或废料储蓄器35(未示出)。在一些实施方案中，为了气密或密封连接，气体供给管线70可以在储蓄器20的壁20w的外壁之上，而不是在储蓄器20的内部延伸。可以使用其他连接构造。
图7A示出了微流体系统100的实例，其包括用于控制向储蓄器20、30的压力供给的操作以进行压力驱动的注入的控制器100c。系统100可以包括第一和第二加压气体供给管线或导管70，其显示为701、702，其各自与至少一个阀120、130流体连通。系统100可以包括关闭和打开阀120、130的每个供给管线的三向阀(图7B)。然而，在优选的实施方案中，将单独的阀120、130、135用于每个供给管线701、702(和703)。阀120、130、135中的一个或全部可以是用于相应供给管线70的三向阀(例如，三向操作，对源打开/关闭、对头部空间打开/关闭和对大气打开/关闭)，其可以允许加压气体从相应供给管线的快速通风。因此，在操作中，可以操作阀120、130、135之一或二者以使在储蓄器20、30中的头部压力向大气通风，这可以有助于精确控制注入过程。气体供给管线70和/或储蓄器20、30、35之一或二者可以另外或备选地包括通风口121、131(图7A)，其可以电子打开和关闭以用于向大气快速通风，以降低在相应顶部空间20h、30h中的压力。对于在相应压力供给管线70中的通风或降压(例如，向大气通风)来说，术语“快速”是指相应储蓄器20、30和35的相应顶部空间20h、30h、35h的压力在0.1-3秒内、更通常在约2秒内或在约1秒内至少下降至大气压。快速通风可以基于来自控制器100c的控制信号，其(a)引导阀120或130或135对大气打开(在使用三通阀的情况下)或(b)打开独立于阀120、130、135的通风口并且关闭阀120、130、135。可以通过在供给管线或储蓄器中的压力传感器测量快速降压(例如，通风)，以表明在0.1-2秒的时间段内头部压力从运行压力快速下降至大气压。在一些实施方案中，可以在约0.1秒至1.5秒之间，如约0.1秒、约0.2秒、约0.3秒、约0.4秒、约0.5秒、约0.6秒、约0.7秒、约0.8秒、约0.9秒、约1第二、约1.1秒、约1.2秒、约1.25秒、约1.5秒、约2秒和约2.5秒内进行快速通风。
第一和第二加压气体供给管线701、702可以各自与共同的加压气体源90连通或者可以各自具有其自己的加压气体源。系统100可以包括用于向微流体装置10的高压输入的电源95。电源95可以附连至线缆75。
控制器100c可以指导向微流体装置的差异施加的压力的时序(timingsequence)。控制器100c可以与阀120、130、135、至少一个压力源90(和降压装置91(在使用的情况下))和电源95连通。术语“控制器”广义地用于包括单一或多个处理器或专用集成电路(ASIC)，其固定在单一装置(例如微流体装置10，和/或计算机、膝上电脑、笔记本电脑、智能电话等)上或与该单一装置连通，或者使用有线或无线连接(局域网或广域网例如互联网)在不同装置中分布，包括任何服务器系统。
控制器100c可以指导阀120、130、135打开和关闭以使用限定的顺序进行相继的样品注入，其实例在图8的时间图中示出。在示出的实例中，可以在加载样品之前填充SPE。可以使用向废料储蓄器35施加的降低的压力(相对于向另一个储蓄器施加的压力)如真空V1，在具有或不具有向样品通道31或BGE通道21施加的压力的情况下(通常在不具有这样的其他压力的情况下)进行填充。可以在通常1-10分钟之间的限定的时间内使用限定的压力进行SPE床的填充。可以在通常小于填充持续时间的限定的时间内施加压力P1、V1。可以通常在小于填充时间的持续时间(如填充时间的30-50％之间和/或1-8分钟之间)内使用压力P1、V1加载样品。之后可以与压力P1同时施加压力P2以将样品塞注入至分离通道25中。之后，可以施加电场以分离样品塞并且将样品向MS的入口喷雾。针对P2示出的虚线说明这个压力可以是打开的(通常对于分离压力来说相同或较少的量)。
可以在使用如示出的V1和P1加载样品之前在短时间(通常在约10秒至约1分钟之间)内对SPE床进行预调节。洗脱可以包括短持续时间(即，0.1-1秒)的压力V1、P1，和随后的较长持续时间的压力P1和P2，以用于向分离通道的注入/样品塞运送。V1可以在洗脱运送期间关闭或打开。
要指出的是，可以在从BGE储蓄器20中移除或降低压力P2的同时或者仅在其之后施加电泳分离电压。如示出的，使用仅向BGE储蓄器施加的压力P2和仅向样品储蓄器施加的压力P1，从第一和第二供给管线70(例如，管或导管)，在不使用任何电动力(EK)电压的情况下，进行样品注入。可以在注入之后向BGE储蓄器20施加电压以用于ESI发射器喷雾50s。
控制器100c可以被配置为使用限定的时序操作流体装置10以用于在通常在1至10秒之间的限定持续时间内通过供给管702向BGE储蓄器20的顶部空间20h并且通过供给管701向样品储蓄器30的顶部空间30h施加在0.1至30psi之间的限定的压力(顶部空间压力)，以将样品注入至分离通道25中。在图8中所示的时间图是通过举例的方式，并且P1(对于样品储蓄器30来说)和P2(对于BGE储蓄器20来说)的表示为“零”压力可以是大气或环境压力并且可以备选地是真空压力。从电源95到BGE储蓄器20中的输入75i的施加的电压V(在图8中的时间图的底部的线)可以具有比同时的注入压力P1、P2(图2F)或随后的“冲洗”压力P2(图2G)短或长的持续时间。P2压力可以保持恒定或改变，通常当P1“关闭”或大幅降低时从用于注入的同时的压力降低至“冲洗”压力(图2G)。
流体装置10可以是微流体芯片，所述微流体芯片具有由坚硬或基本上刚性的材料形成的基板10s和/或天花板10c，包括但不限于包括下列各项的一个或组合的基板：玻璃、石英、硅、陶瓷、氮化硅、聚碳酸酯、和聚甲基丙烯酸甲酯。在具体的实施方案中，装置10可以包括玻璃基板如硼硅酸盐。在其它实施方案中，可以使用刚性聚合物材料形成微流体装置。装置10还可以包括一层或多层柔软或柔性的基板。在使用的情况下，柔软基板材料可以具有低的杨氏模量(Young's Modulus)值。例如，弹性体和较硬的塑料和/或聚合物可以具有在约0.1-3000MPa之间的范围。柔软材料的实例包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、和聚氨酯。参见，例如，用于描述微制作流体装置的实例的共同待审的2012年3月5日提交的PCT/US2012/027662和2011年9月19日提交的PCT/US2011/052127。还参见，Mellors,J.S.；Gorbounov,V.；Ramsey,R.S.；Ramsey,J.M.,用于进行高效率毛细管电泳和电喷雾电离质谱的完全整合的玻璃微流体装置(Fully integrated glassmicrofluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresisand electrospray ionization mass spectrometry).Anal Chem 2008,80(18),6881-6887。这样的装置的另外的方面公开于，例如Xue Q,Foret F,Dunayevskiy YM,ZavrackyPM,McGruer NE&Karger BL(1997),多通道微芯片电喷雾质谱(Multichannel MicrochipElectrospray Mass Spectrometry).Anal Chem 69,426-430，Ramsey RS&Ramsey JM(1997),使用电渗泵送由微芯片装置产生电喷雾(Generating Electrospray fromMicrochip Devices Using Electroosmotic Pumping).Anal Chem 69,1174-1178，Chambers AG,Mellors JS,Henley WH&Ramsey JM(2011),在微流体装置上的二维液相色谱法-毛细管电泳和电喷雾电离的整体整合(Monolithic Integration of Two-DimensionalLiquid Chromatography-Capillary Electrophoresis and Electrospray Ionizationon a Microfluidic Device).Analytical Chemistry 83,842-849。这些文献的内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
EO泵可以整合在微流体装置10上以用于通过除在图4A-4F中所示的实例外的实施方案进行电喷雾电离。通常，两个通道在结点处相交，所述结点可以是T状结点(不限于直角交叉)。向三个所得的通道末端中的两个施加电压以产生通过相关通道区段的轴向电场。为了实现通过第三通道区段的液压输送，在含有轴向电场的两个通道区段中的电渗迁移率通常大小和/或符号不同。可以通过化学修饰相关通道区段中的一个或两个来实现电渗迁移率的差异，从而产生不同的表面电荷密度以及因此不同的电渗迁移率。还可以通过用电中性聚合物膜涂布通道壁来改变电渗迁移率，从而增加在壁处的双电层内的有效流体粘度。改变电渗迁移率的另一种方式是将大小相似的通道横向尺寸到距离中的一个降低至被电渗泵送的溶液的德拜长度。所描述的用于改变电渗迁移率方法也可以在需要的情况下组合使用。在美国专利6,110,343中描述了用于电渗泵送的方法，其内容通过引用结合于此。
在其方便将EO泵功能元件整合在电喷雾微流体装置上时，可以将样品材料液压运送至发射器。参见，例如，Chambers AG,Mellors JS,Henley WH&Ramsey JM(2011),在微流体装置上的二维液相色谱法-毛细管电泳和电喷雾电离的整体整合(MonolithicIntegration of Two-Dimensional Liquid Chromatography-CapillaryElectrophoresis and Electrospray Ionization on a Microfluidic Device).Analytical Chemistry 83,842-849。当使用液压输送以向发射器供应分析物时，可以使用与EO泵送通道类似的侧通道或者通过使用在微流体装置外部的储蓄器中的电极接触流体实现用于产生电喷雾、电压的电连接，或者在使用在装置10和泵之间的金属管道的情况中，可以制作与管道的连接。
图9A和9B示意性地示出了本发明的实施方案。图9A示出了具有容纳下列各项中的至少一个的外壳201的便携式质谱仪200：具有随载控制器100c的微流体装置10、针对电压的电源95、加压气体供给90、降压装置91、检测器205、分析仪210和用于提供输出数据的任选的显示器215。
图9B示出，微流体装置10可以与具有面对ESI发射器50以用于接收喷雾50s的MS输入口200i的质谱仪200连通。控制器100c可以是单独的或者部分或完全在质谱仪200上。
图10A是可以用于进行样品分析的示例性操作的流程图。提供流体装置(方格270)。所述流体装置具有至少一个分离通道、与分离通道流体连通的至少一个BGE通道、与分离通道流体连通的至少一个废料通道和与分离通道流体连通的至少一个样品通道。
样品通道可以在其中具有预先形成的SPE床。
可以在样品通道中流动地形成SPE床(方格272)。
可以通过以下方式流动地形成SPE床：通过降压装置向废料通道施加降低的压力并且向样品通道施加较高的压力，以使SPE材料的浆料流动至样品通道中，直到达到位于分离通道上游的至少一个阻塞部件以流动地形成SPE床。
可以通过使溶剂流动穿过SPE床并且进入废料通道中来对SPE床进行预调节(方格275)。
可以在根据方格280引入样品之前引入用于保持样品的低浓度的离子配对剂如TFA，并且然后可以在方格285的洗脱之前移除TFA(方格283)。
可以使样品在样品通道中的至少一个SPE床之上/通过样品通道中的至少一个SPE床向废料通道流动(方格280)。
可以使洗涤溶剂在其在SPE床之上流动之后穿过至少一个SPE床向废料通道流动(方格282)。
之后可以使洗脱流体在至少一个SPE床之上/通过至少一个SPE床向废料通道流动以将样品塞加载至分离通道中(方格285)。
之后可以使BGE液体流动至在废料和样品通道下方/下游一定距离的分离通道中以在使样品塞向在分离通道中的废料和样品通道下游移动的同时冲洗分离通道和相邻的废料和样品通道(方格288)。
可以在方格288的CE分离之前进行tITP(使用BGE储蓄器)以使注入条带变窄并且减少另外与样品塞/条带从SPE床向分离通道的转移相关的条带变宽(方格289)。
可以向分离通道施加电场以分离相邻的塞，迫使样品塞向ESI发射器行进并且使ESI发射器将样品喷雾(方格290)。
可以在质谱仪中分析喷雾的样品以确定关于样品的信息(方格295)。例如，分析可以包括使用质谱仪检测样品的分析物峰信号并且生成样品的电泳图。
可以使用与分离通道连通的检测器得到在分离通道中的被分离的样品的信号的电子检测(通过光学方式和/或通过电子方式)。这个电子检测可以没有质谱仪检测的情况下或在具有质谱仪检测的情况下进行。在一些实施方案中，对于相应的被分离的样品来说，可以在借助质谱仪的检测的同时进行借助检测器的电子检测。
可以仅使用一系列向BGE通道、样品通道和废料通道的限定的压力输入在直到分离和喷雾才需要电场的情况下进行预调节、流动和加载步骤。
图10B是可以用于进行样品分析的示例性操作的流程图。提供微流体装置，所述微流体装置具有与背景电解质(BGE)储蓄器和样品储蓄器流体连通的至少一个分离通道并且具有带有SPE床的样品通道；所述样品通道并入分离通道中(方格300)。通过同时向BGE储蓄器施加限定的压力并且向样品储蓄器施加限定的压力，将流体样品从样品储蓄器穿过SPE床注入(流动地引入)至BGE储蓄器下游的分离通道中(方格310)。
可以在注入步骤期间向位于样品通道对面的废料储蓄器施加降低的压力(任选真空)。
在注入/引入之后，使用从BGE储蓄器中流出的流体将样品塞的尾端从样品通道中清除，以响应在向BGE储蓄器施加压力的同时降低或移除向样品储蓄器施加的压力而运送在分离通道中的样品塞，以使得向BGE储蓄器施加的压力大于之后向样品储蓄器施加的压力(方格320)。之后，通过向分离通道施加电场，即向BGE储蓄器和分离通道的下游位置或EO泵通道/输入附近施加电压，将运送的样品在分离通道中电泳分离(方格330)。在施加电压的同时，在BGE储蓄器中的压力可以保持恒定、进一步降低或移除。
可以在不向样品储蓄器施加电压的情况下进行注入、清除和电泳分离(方格340)。
对于注入和/或清除来说，可以电子调节压力的持续时间或者可以增加或降低向样品或BGE储蓄器20、30施加的压力，以调节向分离通道运送的样品塞的尺寸。
随着分析物条带从电泳分离通道的远端洗脱，可以任选使用质谱仪分析被分离的样品以确定关于样品的信息(方格335)。例如，分析可以包括使用质谱仪检测样品的分析物峰信号并且生成样品的电泳图。分析可以包括在分离通道中的被分离的样品的电导检测和/或光学检测以获得在样品中的分析物的定量和/或定性数据。
要指出的是，本发明的实施方案可以将软件、固件和/或硬件方面组合，其在本文中通常被称为“电路”或“模块”。此外，本发明可以采取具有在介质上实施的计算机可用的程序代码的在计算机可用的存储介质上的计算机程序产品的形式。可以使用任何适合的计算机可读介质，包括硬盘、CD-ROM、光学存储设备、传输介质如支持互联网或内部网的那些、或磁性存储设备。一些电路、模块或例行程序可以以汇编语言或甚至微码编写以提高性能和/或存储用途。将会进一步理解的是，也可以使用离散的硬件组件、一种或多种专用集成电路(ASIC)、或程序化数字信号处理器或微控制器实施程序模块中的任一种或全部的功能。本发明的实施方案不限于具体的编程语言。
用于执行本发明的操作的计算机程序代码可以以面向对象的编程语言如
Figure BDA0001634081920000361
Smalltalk或C++编写。然而，用于执行本发明的操作的计算机程序代码也可以以常规的过程化编程语言如“C”编程语言编写。程序代码可以全部在用户的计算机上执行，部分在用户的计算机上执行，作为单机软件包执行，部分在用户的计算机上并且部分在另一台计算机上执行，本地和/或远程或全部在另一台本地或远程计算机上执行。在后一种情况中，另一台本地或远程计算机可以通过局域网(LAN)或广域网(WAN)与用户的计算机连接，或者可以与外部计算机连接(例如，使用互联网服务提供商通过互联网)。
在本文中部分参照根据本发明的实施方案的方法、装置(系统)和计算机程序产品的流程示意图和/或框图描述了本发明的实施方案。应理解的是，流程示意图和/或框图的每个方格以及在流程示意图和/或框图中的方格的组合可以通过计算机程序指令实施。可以将这些计算机程序指令提供给一般用途计算机、特殊用途计算机、或其他可编程数据处理装置的处理器以制造机器，以使得通过计算机或其他可编程数据处理装置的处理器执行的指令创建用于发挥在流程图和/或框图方格中指定的功能/作用的手段。
这些计算机程序指令也可以存储在计算机可读存储器中，其可以指导计算机或其他可编程数据处理装置以特定方式发挥作用，以使得在计算机可读存储器中存储的指令制造包括发挥在流程图和/或框图方格中指定的功能/作用的指令手段的制品。
也可以将计算机程序指令加载至计算机或其他可编程数据处理装置上以使得一系列操作步骤在计算机或其他可编程装置上进行，以产生计算机实施的过程，以使得在计算机或其他可编程装置上执行的指令提供用于发挥在流程图和/或框图方格中指定的一些或全部功能/作用的步骤。
在本文中的某些附图的流程图和框图示出了本发明的实施方案的可能的实施的示例性结构、功能、和操作。就此而言，在流程图或框图中的每个方格表示包括用于实施一个或多个指定逻辑功能的一个或多个可执行指令的模块、区段、或代码的部分。还应当指出，在一些备选实施方案中，在方格中指出的功能可以不按图中指出的顺序进行。例如，取决于涉及的功能，相继示出的两个方格事实上可以基本上同时执行或者方格有时可以以相反的顺序执行或者两个以上方格可以组合，或者方格可以分割并且单独进行。
图11是电路或数据处理系统290的示意图。系统290可以与微流体装置10和/或质谱仪200一起使用。电路和/或数据处理系统290可以结合在一个或多个任何适合的装置中的数字信号处理器中。如在图11中所示，处理器410可以与质谱仪200和/或微流体装置10连通，并且通过地址/数据总线448与存储器414连通。处理器410可以位于与光谱仪200分离或全部或部分整合在其中的控制电路或控制器中。处理器410可以是任何可商购的或定制的微处理器。存储器414代表含有用于发挥数据处理系统的功能的软件和数据的存储器设备的总体层次结构。存储器414可以包括，但不限于以下类型的设备：缓存、ROM、PROM、EPROM、EEPROM、闪存、SRAM、和DRAM。
图11示出，存储器414可以包括在数据处理系统中使用的多个种类的软件和数据：操作系统452；应用程序454；输入/输出(I/O)装置驱动器458；和数据455。数据455可以包括样品类型、针对压力的塞尺寸调节、校准数据、时间同步数据(例如，用于加载/注入的压力/持续时间)、和/或其他检测的或内部的质谱仪数据。
如本领域技术人员将会理解的，操作系统452可以是适用于与数据处理系统一起使用的任何操作系统，如来自国际商业机器公司的OS/2、AIX、DOS、OS/390或System390，来自微软公司的Armonk、NY、Windows CE、Windows NT、Windows95、Windows98、Windows2000、WindowsXP或其他Windows版本，Redmond，WA，Unix或Linux或FreeBSD，来自Palm,Inc.的Palm OS，来自苹果计算机的Mac OS，LabView，或专用操作系统。I/O装置驱动器458通常包括通过操作系统452由应用程序454读取的软件例行程序，以与装置如一个或多个I/O数据端口、数据存储器455和某些存储器414组件连通。应用程序454说明了实施数据(图像)处理系统的多个特征的程序并且可以包括支持根据本发明的实施方案的操作的至少一个应用。最后，数据455表示由可以位于存储器414中的应用程序454、操作系统452、I/O装置驱动器458、和其他软件程序使用的静态和动态数据。
尽管在图11中例如参照用于具有用于样品的CE-MS分析的管线内SPE床的微流体装置的控制模块(通常具有压力输入序列)450和作为应用程序的任选的塞尺寸(压力/持续时间)调节模块451说明了本发明，如本领域技术人员将会理解的，也可以使用其他构造而仍然受益于本发明的教导。模块451可以允许用户选择所需的注入时间(对于每个储蓄器来说，压力打开时间、关闭时间、用于相应注入和/或冲洗的压力等)。模块450和/或451也可以结合至操作系统452、I/O装置驱动器458或数据处理系统的其他此类逻辑分类中。因此，本发明不应被解释为限于图11的构造，其意在包括能够进行在本文中所述的操作的任何构造。此外，模块450和/或451可以与其他组件连通或者完全或部分结合在其他组件中，如质谱仪200、电源95、界面/网关或计算机，如在可以是本地的或远离微流体装置/光谱仪的工作站处。
I/O数据端口可以用于在数据处理系统、工作站、光谱仪、微流体装置、界面/网关和另一个计算机系统或网络(例如，互联网)之间传递信息或者将信息传递至由处理器控制的其他装置或电路。这些组件可以是常规组件，如在许多常规数据处理系统中使用的那些，其可以根据本发明配置以根据在本文中所描述的运行。
在以下非限制性实施例中更详细地解释了本发明。
实施例
从Fisher Chemical(Fairlawn,NJ)获得LC-MS等级乙腈、甲醇、丙酮、和甲酸(99.99％)，以及HPLC等级乙酸铵和三氟乙酸(TFA)(99.975％)。用Nanopure Diamond净水器(Barnstead International,Dubuque,IA)将水净化。从Gelest(Morrisville,PA)获得(3-氨基)二异丙基乙氧基硅烷(APDIPES)。从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得磷酸氢二钠、三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷。从Nanocs,Inc.(Boston,MA)购买具有450个聚合物单元的N-羟基琥珀酰亚胺官能化的聚乙二醇(NHS-PEG)试剂(MW＝20kDa)。从AmericanPeptide Company(Sunnyvale,CA)购买甲硫氨酸脑啡肽、缓激肽、血管紧张素II、胸腺五肽和人glu-血纤维蛋白肽(fibrionpeptide)。从Waters Corporation(Milford,MA)获得MassPREP磷酸化酶B和大肠杆菌消化物。可以在图1A中发现SPE-CE-ESI微芯片的示意图。微芯片由550μm厚的D263玻璃使用标准光刻、湿法化学蚀刻、和热粘合技术制造。参见，Mellors等，Anal Chem 2008,80,6881-6887；和Mellors等，Anal Chem 2010,82,967-973。全部通道都是10μm深和70μm宽(全宽)。如前面描述的，之后将微芯片用APDIPES涂布并且用NHS-PEG试剂改性。参见，例如，Batz等，Anal Chem 2014,86,3493-3500；和Redman等，AnalChem 2015,87,2264-2272。这些文献的内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
为了进行整体样品处理，用由Waters Corporation(Milford,MA)提供的5μm直径的多孔Oasis HLB颗粒填充SPE-CE-ESI微芯片。通过将0.1mg/mL Oasis HLB颗粒的浆料放置在储蓄器30中的丙酮中(图1A)并且向储蓄器35施加降低的压力(任选真空)(图1A)，紧靠微制作的围堰填充SPE床。被填充的床的长度是600μm长，而通道深度和宽度分别为10μm至70μm。被填充的床的体积估算是425pL。将在微芯片上的SPE床填充所需的时间是10分钟。
为了进行SPE-CE-ESI，首先用低有机物溶剂对床进行调节。将在水:甲醇(v/v)溶液中的95:5 0.1％甲酸放置在储蓄器30中(图1A)。在向储蓄器35施加30秒的真空的同时，向储蓄器30施加来自压缩氮槽罐的头部压力(+0.69巴)。为了将样品加载至SPE床上，将所需的样品放置在储蓄器30中。除非另外指出，将样品溶解于2:98甲醇:0.5％TFA(在水中)(v/v)。在5分钟内，分别向样品和废料储蓄器施加相同的压力和真空。最后，洗脱溶剂替换在储蓄器2中的样品。对于SPE-CE-ESI来说，洗脱溶剂是80:20乙腈:2％甲酸(在水中)(v/v)。
对于SPE-tITP-CE-ESI来说，洗脱溶剂与加入100mM乙酸铵相同。为了进行洗脱，对于SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI方法二者来说，工序是相同的。首先，在一秒内向储蓄器30施加+0.69巴。接下来，在四秒内向储蓄器20和30二者施加+0.69巴。这得到了进入分离通道的洗脱的分析物条带。接下来，向储蓄器一(20)施加+0.69巴，其在施加电压并且形成注入塞之前清除过量样品的注入交叉。最后，向储蓄器20(+22kV)和40(+1.5kV)施加电压。所施加的电压引起760V/cm的场强度。使用3向电子阀(Clippard,Inc.,Cincinnati,OH)控制向芯片施加压力和真空，这由通过PCI 6713DAQ卡(National Instruments,Austin,TX)与PC连接的SCB-68转接盒(breakout box)操作并且由Labview程序控制。用于所有SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI分离的BGE是50:50乙腈:2％甲酸(在水中)，pH 2.2。
四肽混合物的分离
使用四肽混合物(胸腺五肽、缓激肽、血管紧张素II和甲硫氨酸脑啡肽)比较针对所研究的三种不同方法的品质因数(figure of merit)。使用Waters Synapt G2四极飞行时间(qTOF)质谱仪(Waters Corporation,Milford MA)。将仪器设定为具有300-600m/z的质量范围和0.09秒的总和扫描时间的MS灵敏度模式。
电动力和流体动力注入比较
为了比较在电动力门控注入和流体动力注入之间的观察到的峰面积的差异，使用微芯片CE-ESI分离5μM四肽混合物(胸腺五肽、缓激肽、血管紧张素II和甲硫氨酸脑啡肽)。使用23cm CE-ESI微芯片。设计与在图1A中描述的微芯片非常相似，然而，在与储蓄器30连接的通道31中不存在围堰，并且不存在SPE床。通道的深度和宽度与SPE-CE-ESI微芯片相同，并且表面涂层也相同。BGE和MS设定与稍早描述的那些相同。对于电动力注入来说，施加的电压分别是22、22、20和2kV。门控注入的持续时间是0.4s。对于流体动力注入来说，在3秒内向储蓄器20和30同时施加0.165巴的头部压力。这引起样品进入分离通道。接下来，在一秒内向储蓄器20施加0.165巴的压力，其清除了在分离通道中形成注入塞的过量样品的注入交叉。最后，将22kV和2kV的施加的电压分别施加至储蓄器20和40。通过将体积流量(线速度x横截面积)乘以注入时间来计算用于注入的分析物体积。
样品污染(sample carry over)
针对CE-ESI微芯片和SPE-CE-ESI微芯片二者研究样品污染。对于两种技术来说，分别在5μM或50nM分离四肽混合物的样品。在分离之后直接通过移除样品并且用BGE填充储蓄器来冲洗容纳样品的储蓄器。通过用移液管吸取而将溶液混合。将这个过程重复三次，并且之后用空白填充储蓄器。对于CE-ESI微芯片来说，空白由BGE组成。对于SPE-CE-ESI微芯片来说，空白由2％甲醇、0.5％三氟乙酸、和97.5％水组成。对于两种技术来说，将用于肽混合物的相同的样品加载和注入工序应用于空白。质谱仪设定与针对4-肽混合物的分离描述的那些相同。
蛋白质消化物分离
使用CE-ESI(5μM)和SPE-tITP-CE-ESI(50nM)二者分离磷酸化酶B的胰蛋白酶消化物。此外，使用SPE-tITP-CE-ESI分析0.5mg/mL大肠杆菌消化物。使用Waters SynaptG2qTOF进行MSE。术语“MSE”是指用于来自Waters Corporation(Milford,MA,USA)的质谱仪的单一分析技术，其可以将复杂样品的组分分离并且询问定量和定性信息以供回顾。参见，白皮书、MSE的原理的概述、驱动MS性能的发动机(White Paper,An Overview of thePrinciples of MSE,the Engine that Drives MS Performance)，版权2011，WatersCorporation。为了清楚，这个白皮书和所指出的分析技术仅以举例的方式提供并且本发明不限于这个分析方案或这个设备。将仪器设定为具有50-1200m/z的质量范围和0.05秒的总和扫描时间的MS/MS灵敏度模式。如稍早描述的，使用人Glu-血纤维蛋白前体作为锁定质量(lockmass)化合物。
数据处理
为了确定峰宽度和面积，将萃取的离子的电泳图输出至程序Igor Pro(Wavemetrics,Lake Oswego,Oregon)并且使用分析包“多峰拟合(multi-peak fit)2”。为了确定峰容量，将基峰指数(BPI)电泳图输出至程序PeakFinder(Pacific NorthwestNational Laboratory)，其测量测量分离窗口和中值4σ峰宽度。
使用软件Biopharmalynx(Waters Corporation)分析磷酸化酶B消化物电泳图以确定观察到的肽的数量。该方法基于具有允许多至两个漏切位点的胰蛋白酶消化物。MS和MSE质量容限都被设定为30.0ppm。MS离子强度阈值被设定为25个计数，而MSE离子强度阈值被设定为10个计数。仅对具有大于或等于强度最大的肽的1％的强度值的肽进行计数。
结果和讨论
分离和预浓缩性能
为了研究整体样品处理微芯片的浓度和分离性能，对三种不同的方法进行比较；常规CE-ESI、SPE-CE-ESI、和SPE-tITP-CE-ESI。全部微芯片与MS直接耦接以用于检测。为了确保分离条件对于所有方法相同，使用不具有任何固定相的SPE-CE-ESI装置的进行CE分离。使用门控电动力注入进行微芯片CE-ESI分离，而SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI方法使用流体动力注入。只要注射体积足够低以防止注入变宽，注入方法就不会对分离性能有任何影响。稍后研究注入方法对方法的灵敏度的影响。图12A-12C比较了三种技术的电泳图，而表1比较了品质因数。当tITP与CE耦接时，理论塔板(theoretical plate)不是分离效率的准确量度，因为在分离的持续时间内在整个通道中场强度不是线性的。因为峰容量不需要线性的电场，因此其用作更准确的性能度量。
图12A-12C示出了来自三种技术的代表性电泳图。峰被标记为1至4，并且分别对应于胸腺五肽、缓激肽、血管紧张素II、和甲硫氨酸脑啡肽。峰A(1087.5Da)和B(1073.5Da)对应于在SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI电泳图中观察到的未确定的痕量肽。上电泳图(图12A)对应于5μM肽混合物的CE-ESI分析。对于四种肽观察到的迁移时间分别是1.64、1.84、1.98、和4.19min，并且总分离时间时长仅超过四分钟。CE-ESI方法的效率值在90,000至133,000个理论塔板之间。观察到的平均峰容量是105.5，具有1.45秒的中值4σ峰宽度和152.95s的分离窗口(n＝3)。通过使用这些品质因数作为基线，我们可以比较SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI方法的分离性能。
中间的电泳图(图12B)对应于比用于CE-ESI分离的样品稀100倍的50nM肽混合物的SPE-CE-ESI分析。四种肽的迁移时间分别是1.72、1.92、2.07和4.27，与针对CE-ESI电泳图的迁移时间非常相似。在4.50min的峰5对应于氧化的甲硫氨酸脑啡肽，其在CE-ESI电泳图中不可见，表明SPE-CE-ESI方法的浓度提高。使用SPE-CE-ESI方法的四种肽的理论塔板计数在39,000至92,000个理论塔板之间，并且针对SPE-CE-ESI方法的观察到的峰容量降低至66.5，具有2.30秒的中值4σ峰宽度和152.95s的分离窗口(n＝3)(表1)。这些值未计入氧化的甲硫氨酸脑啡肽峰(峰5)。图12C是50nM样品的SPE-tITP-CE-ESI。
表1.针对4肽混合物的计算的峰容量和效率值
Figure BDA0001634081920000431
*基于峰宽度和迁移时间计算的表观效率值
为了研究观察到的预浓缩的量，针对四种肽中的每一种计算富集因数。为了表征不同注入方法(流体动力相对于电动力)的效果，使用两种注入方法进行相同四种肽的微芯片CE-ESI。对于电动力门控注入来说，注入至分离通道中的分析物的体积取决于分析物的电泳迁移率。对于流体动力注入来说，体积对于所有分析物来说应当是恒定的。当比较SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI方法的预浓缩性能时，可能重要的是区分观察到的灵敏度的任何增加是否归因于分析物在床上的预浓缩或归因于电动力偏置的移除。图13A和13B示出了针对四肽混合物的电动力(上，图13A)和流体动力(下，图13B)注入的电泳图。肽被标记为1至4，对应于胸腺五肽、缓激肽、血管紧张素II、和甲硫氨酸脑啡肽。对于电动力注入来说，计算峰1至4的注入体积分别为585、522、482、和215pL。对于流体动力注入分离来说，注入体积与来自电动力注入的最大体积匹配，并且计算为600pL。如通过附图以及注入体积说明的，电动力偏置随着分析物迁移时间增加而增加，对应于具有较低电泳迁移率的肽。观察到的偏置对于甲硫氨酸脑啡肽来说是尤其是普遍的(峰4)，而峰1至3的平均(n＝3)峰高度对于每一对来说在彼此的20％以内。
根据在图13A和13B中的电泳图，计算平均(n＝3次重复注入)峰面积并且在两种方法之间进行比较。图14描绘了针对四种肽中的每一种的相对于迁移时间的计算的峰面积。如由图14所示的，对于前三种肽来说，没有观察到峰面积的明显差异(峰1至3)。然而，对于具有最低电泳迁移率以及因此最高电动力偏置的肽甲硫氨酸脑啡肽峰来说，观察到明显差异。为了解释这种灵敏度的差异，可以通过使用电动力注入峰面积与流体动力注入的比率来计算校正因数。对于甲硫氨酸脑啡肽来说，计算该值为0.31，这与计算的注入体积的差异相似(215v.600pL)。
对于SPE-CE-ESI方法来说，对于峰1-4来说，富集值分别为78、712、713、和799(图12C)。通过将初始分析物浓度(100)差乘以SPE-CE-ESI峰面积与CE-ESI峰面积相比的比率计算富集因数。对于甲硫氨酸脑啡肽峰来说，校正因数(0.31)还用于解释由于注入方法的差异而导致的峰面积的差异。
富集因数也将会由于在SPE床上的保留的差异而变化。作为小(679.76Da)亲水肽的胸腺五肽(峰1)不能充分保留在疏水固定相上并且因此具有与其他肽相比低得多的富集因数。在不向样品加入TFA(0.5％)的情况下，胸腺五肽根本不保留在固定相上(数据未示出)。因此，预期了胸腺五肽的与其他肽相比较低的观察到的富集因数。TFA是色谱中常用的离子配对剂，然而，其由于离子抑制作用而通常与ESI不相容。SPE-CE-ESI方法未遭遇这种限制，因为TFA可以用于保留样品但是然后可以在洗脱之前移除。与其中TFA内容物被直接引入至流动相中的LC-MS仪器相比，使用TFA以提高分析物在SPE床上的保留而不损害ESI性能的能力代表了SPE-CE-ESI微芯片的显著优点。缓激肽和血管紧张素II的富集因数大约是700，而甲硫氨酸脑啡肽的计算值是799。总体上，使用用于肽混合物的SPE-CE方法观察到明显的预浓缩量。然而，所得的分离性能降低至大致CE-ESI方法的一半，突显了将样品处理与CE-ESI偶联尽管维持分离性能的挑战性。
为了重新获得使用SPE-CE-ESI方法丧失的分离性能同时维持观察到的预浓缩，在CE-ESI分离之前使用tITP。因为tITP是聚焦技术，其产生窄的注入条带，消除了由于分析物条带从SPE床向CE通道的传递带来的任何条带变宽。在图12C中的电泳图对应于使用SPE-tITP-CE-ESI方法的50nM肽混合物的分析。这种方法的工序与SPE-CE-ESI技术相同，不同之处在于将100mM乙酸铵加入至洗脱溶剂中。铵起前导电解质的作用并且在BGE中的甲酸起尾随电解质的作用。之后向微芯片施加电压之后，样品直接经历tITP聚焦。在聚焦步骤之后，样品过渡到CE分离。肽的迁移时间分别是1.68、1.86、1.98、和3.98min。与CE-ESI和SPE-CE-ESI电泳图二者相比，在SPE-tITP-CE-ESI电泳图中由于tITP聚焦步骤而压缩分离窗口。观察到的平均峰容量是174.5，具有0.81s的中值4σ峰宽度和141.33s的分离窗口(n＝3)。这与CE-ESI分离相比几乎是双倍，并且几乎是SPE-CE-ESI方法的三倍。计算四种肽的富集值分别为72、614、660、和783。如根据计算的峰容量和富集值二者显而易见的，与CE和SPE-CE方法相比，SPE-tITP-CE方法的分离性能大幅提高，同时提供了显著的样品预浓缩量。
最后，为了证明所开发的方法的稳健性，研究迁移时间再现性、峰面积再现性、样品污染、和检测限。对于肽混合物的三次重复注入来说，CE-ESI的平均迁移时间RSD值是0.23％，SPE-CE-ESI是0.49％，并且SPE-tITP-CE-ESI是0.94％。平均峰面积RSD值分别是7.08％、5.26％、和8.66％。这些值表明，SPE-CE-ESI和SPE-tITP-CE-ESI方法二者是可再现的，并且迁移时间和峰面积RSD分别低于1和10％。为了确定检测限(LOD)，计算每种肽的信噪(S/N)比并且之后外推至3的S/N。对于CE-MS方法来说，计算峰1至4的LOD分别为800、700、400、和700nM。对于SPE-tITP-CE-MS方法来说，值分别是3.0、2.2、2.6、和1.7nM，表明比利用整体样品处理的方法的LOD低多于两个数量级。针对SPE-CE比较样品污染，并且与CE方法进行比较。在四肽混合物分离之后(CE-5μM，SPE-CE-50nM)，对空白进行分析。通过观察任一种肽在空白电泳图中的检测来表征样品污染。对于CE电泳图来说，未检测到样品污染。对于SPE-CE电泳图来说，仅对缓激肽观察到污染，其为具有强度最大的信号的肽，得到初始峰的仅0.04％的峰面积值。这种样品污染被认为是可忽略的并且在样品之间的洗涤步骤的进一步优化可能会将其完全消除。可以将SPE-CE-ESI方法的样品污染性能外推至SPE-tITP-CE-ESI方法。在洗脱溶剂中盐的存在是两种方法之间唯一的差异，并且所有其他步骤都相同，包括样品加载步骤和在洗脱之后的SPE床的洗涤步骤。因此，在两种方法之间，留在SPE床上的任何残留材料应当是相同的。高的富集因数、低的RSD值、低的样品污染和分离性能的提高证实了这种针对CE-ESI的用于分析物预浓缩的方法的可行性。
动态范围和过载
当采用固定相以将样品预浓缩时，可能重要的是确保SPE床在所需浓度范围内不变得饱和。整体SPE-tITP-CE-MS方法具有经历样品过载；CE分离、MS检测器、和吸附剂床的三种尺寸。因为可以将样品不断加载至吸附剂(SPE)床上，必须考虑体积和质量过载二者。当将大体积(比固定相床的体积大数个数量级)的样品注入至床上时，发生体积过载。即使在为样品吸附(低有机)设计的溶剂条件下，大的体积也可能会导致弱保留的分析物，从而分配至流动相中并且从床上洗脱。当注入的分析物的量超过固定相的容量并且床被样品饱和时，发生质量过载。可能难以将过载的影响单独归因于固定相的饱和，并且必须仔细设计实验以确保适当地进行表征。
为了确定SPE-tITP-CE方法的适用的动态范围，研究四肽混合物。所研究的浓度范围是1、10、100、1000和10000nM。图15A-15D示出了在10nM和10μM之间的肽混合物的BPI电泳图。肽在1nM样品的BPI电泳图中不可见，但是在萃取的离子的电泳图中被观察到。如由图15A-15D证实的，四种肽的峰高度和面积随着浓度增加而增加。峰形状在高浓度下变得扭曲，并且似乎检测器成为饱和的。此外，在四肽混合物中还存在痕量杂质，并且在较高浓度下被观察到。这些杂质中的两种被标记为肽A和B。在混合物中的肽A和B的浓度是未知的，但是据估算，其比四种样品肽的浓度低至少一个数量级。
图16A-16C、17A-17C和18A-18C分别示出了在所测试的浓度范围内的缓激肽、胸腺五肽、和肽A的峰面积、宽度、和高度。这些图表示出了缓激肽、胸腺五肽、和标记为肽A的未确定的痕量组分的SPE-tITP-CE-ESI分析的峰面积、宽度、和高度。所加载的肽混合物的浓度在1nM至10μM的范围内。样品浓度反映了在混合物中的4种肽(胸腺五肽、缓激肽、血管紧张素II、和甲硫氨酸脑啡肽)的浓度并且不代表痕量组分A和B的浓度。
为了确定在CE领域中的过载，对缓激肽和肽A的峰宽度进行比较。缓激肽的峰宽度从1nM至100nM保持不变。在100nM以上，峰宽度急剧增加。另一方面，肽A的峰宽度在浓度范围内保持相似。这表明，CE分离对于充分保留的、高度丰富的分析物来说已经饱和。图15A-15D视觉上支持这个结论。监测三种肽的峰高度评估了MS检测器的饱和。缓激肽的峰高度从1nM至100nM线性增加(R2＝0.999)。然而，在1和10μM的浓度下，峰高度偏离线性行为并且稳定。弱保留的胸腺五肽的峰高度在1nM至100nM之间线性增加(R2＝0.999)。在1μM，高度开始偏离线性并且随后降低。比较而言，对于所检测的样品的所有四个浓度来说，低丰度的肽A的峰高度线性的(R2＝0.998)。这表明，MS检测器对于高度丰富的物种来说已经饱和。
胸腺五肽的峰面积和高度的值表明，出现了固定相的体积过载。这并不意外，因为样品的体积在5分钟内不断被引入至短床(600μm)中。此外，用于弱保留的分析物的床的容量可以随着具有较高保留的其他化合物的存在的增加而降低。最后，为了确定质量过载，对缓激肽和肽A进行比较。缓激肽的峰面积在前四数量级内是线性的(R2＝0.998)，而在10μM偏离线性行为。肽A的峰面积在观察到的四个浓度内是线性的(R2＝0.999)，说明较低丰度的分析物仍然被保留，因为固定相尚未饱和。基于这些数据，我们断定，600μm的整体SPE床的容量是足够的，以研究在宽的浓度范围内存在的样品。在SPE床的饱和之前，MS检测器和CE分离变得饱和。即使在非常大的四肽混合物的浓度下，痕量组分A的峰高度和面积也继续线性增加，表明SPE床仍然具有容纳更多分析物的容量。这些结论进一步被两种另外丰富并且充分保留的肽血管紧张素II和甲硫氨酸脑啡肽以及在四肽混合物中另外的痕量组分肽B的行为支持(图19A-19C、20A-20C、21A-21C)。
图19A-19C、20A-20C、21A-21C分别示出了血管紧张素II、甲硫氨酸脑啡肽、和未确定的肽B的峰面积、峰宽度、和峰高度。所加载的样品的浓度在1nM至10μM的范围内。
复杂混合物分离
为了研究利用用于复杂混合物的整体样品处理的微芯片的性能，使用CE-ESI-MS/MS和SPE-tITP-CE-ESI-MS/MS二者分析磷酸化酶B(Phos B)胰蛋白酶消化物。借助串联MS的肽鉴别通常用于许多应用，如蛋白质作图、蛋白质组学、或氢/氘交换质谱。因此，使用串联MS以证明SPE-tITP-CE-ESI方法与MS/MS的相容性。用于CE的样品的浓度是5μM，而用于SPE-tITP-CE的样品的浓度是50nM。图22示出了每个分离的电泳图的比较。两种方法含有相同的曲线，并且CE电泳图偏置以用于可视化。插图示出了CE电泳图的放大视图。在每个电泳图中选择六个肽并且进行标记以用于比较。如由图示出的，尽管具有低100倍的样品浓度，SPE-tITP-CE电泳图的BPI信号强度比CE电泳图大多于一个数量级。通过对六个标记的肽的平均峰面积进行比较，计算峰1至6的富集因数分别为270、550、541、712、426、和418(忽略任何电动力偏置)。此外，每个电泳图的外观非常相似。对于CE分离来说，平均(n＝3)峰容量是128，具有1.68秒的中值4σ峰宽度和214.8秒的分离窗口。对于SPE-tITP-CE分离来说，平均(n＝3)峰容量是147，具有1.267秒的中值4σ峰宽度、186.4秒的分离窗口。
公知的是，SPE偏向充分保留在色谱材料上的分析物，并且该方法在分析较差地保留的物种方面不太有效。对于反相SPE来说，通常不保留极性非常强的分析物，导致这些分析物的损失。为了确定在CE-MS和SPE-tITP-CE-MS Phos B样品之间是否观察到类似数量的肽，使用软件Biopharmalynx分析电泳图。对于CE-MS分析来说，在Phos B消化物中观察到的肽的平均(n＝3)数量是151。比较而言，对于SPE-tITP-CE-MS方法观察到的肽的平均(n＝3)数量是97，这相当于35％的降低。尽管完全消除SPE向充分保留的分析物的偏置是具有挑战性的，通过进一步优化固定相，如选择更具保留性的反相材料或选择混合方式固定相，如将反相保留与离子交换保留组合，可以实现降低损失的肽的数量。
图22是使用CE-ESI(5μM)(上和上插图)和SPE-tITP-CE-ESI(50nM)(下)分离的磷酸化酶B胰蛋白酶消化物的电泳图。插图示出了CE-ESI电泳图的放大视图。
图23示出了使用整体微芯片的0.5mg/mL大肠杆菌胰蛋白酶消化物的分离。分离操作时间时长仅少于10分钟。针对分离计算的峰容量是241.5，具有1.85s的中值4σ峰宽度、447.6s的分离窗口和155个计数的峰。Busnel等将tITP-CE与多孔尖端发射器偶联以对0.5mg/mL大肠杆菌胰蛋白酶消化物进行类似的分离。参见，例如，Busnel等，Anal Chem2010,82,9476-9483，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
作者报道了在80min内192的观察到的峰容量(4σ峰宽度)。峰容量/min的度量可以用于对不同分离技术可以产生分辨能力的速率进行比较。基于报道的峰容量和80min的分离操作时间，在Busnel手稿中描述的分离具有2.4的峰容量/min。基于241.5的峰容量和10min的操作时间，在图23中的电泳图的计算值相当于24.1的峰容量/min。如果在分离之前包括5分钟的加载，则峰容量/分钟的值降低至16.1，其仍然比Busnel等报道的工作快6倍。在分离之前的加载步骤的进一步优化可能会降低单独样品的总分析时间。图23是0.5mg/mL大肠杆菌消化物的SPE-tITP-CE-ESI分离的电泳图。
图24A和24B示出了为了评估整体SPE-tITP-CE-ESI微流体装置的脱盐能力而进行的初步实验的结果。电泳图对应于在通过SPE-tITP-CE-ESI-MS/MS分析之前溶解在两种不同配制物中的相同样品。二者都是50nM磷酸化酶B消化物，并且上电泳图(图24A)对应于溶解在加载缓冲液(2％甲醇、0.5％TFA、余量的水)中的样品。下电泳图(图24B)是相同的样品，不同之处在于溶解在(2％甲醇、0.5％TFA、余量的水+100mM NaCl)中。这模仿了在分离和质谱仪检测之前SPE-tITP-CE-ESI装置将样品脱盐或清洁的能力。在样品加载和样品洗脱之间使用短的洗涤步骤(参见，例如，以上讨论的图2E、3C)。洗涤步骤长10秒并且将样品用5％甲醇、0.1％甲酸、余量的水洗涤。如示出的，每个电泳图的信号强度是非常相似的，表明预浓缩的量不受样品中盐的存在的影响。对于三次重复注入来说，上电泳图的平均峰容量是150，而下电泳图的平均峰容量是157。因此，分离性能也受样品中盐的存在的影响。这个初步的实验表明，除了预浓缩，SPE-tITP-CE-ESI装置可以在分析之前将样品脱盐并且清洁。
前述是说明本发明而不应被解释为对其进行限制。尽管已经描述了本发明的一些示例性实施方案，本领域技术人员将会容易理解的是，这些本质上不背离本发明的新的教导和优点的情况下，在示例性的实施方案中许多修改是可行的。因此，所有这样的修改均意图包括在如在权利要求中所限定的本发明的范围内。本发明由以下权利要求以及包括在其中的权利要求的等同物限定。

Claims (21)

1.样品处理的方法，所述方法包括：
提供一种流体微芯片装置，所述流体微芯片装置具有在所述微芯片中形成并且与背景电解质储蓄器流体连通的至少一个整合的微流体或纳米流体分离通道、在所述微芯片中形成并且与所述分离通道流体连通的整合的纳米流体或微流体样品通道、和在所述微芯片中形成并且与所述至少一个分离通道流体连通的整合的电喷雾电离发射器，其中所述样品通道包括至少一个固相萃取床；
使样品流动通过所述样品通道，穿过所述至少一个固相萃取床，并且进入所述至少一个分离通道中；
从在所述分离通道中的所述样品中电泳分离分析物组分；
进行以下各项中的至少一种：
(a)将所述分析物组分从与所述发射器向收集装置或质谱仪入口中的至少一个电喷雾；和
(b)检测与在所述分离通道中或从所述分离通道中出来的所述分析物组分相对应的信号；
使离子配对剂在所述样品之前或连同所述样品一起流动穿过所述至少一个固相萃取床；
将所述离子配对剂从所述样品通道冲洗至与所述样品通道流体连通的废料通道中；和
在将所述离子配对剂从所述样品通道冲洗之后，使洗脱流体在所述电泳分离之前或期间在所述样品通道中流动。
2.权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述电泳分离之前将所述样品预浓缩。
3.权利要求2所述的方法，其中所述样品是电离样品，并且其中所述预浓缩包括：
在具有第一迁移率的前导电解质之后并且在具有低于所述第一迁移率的第二迁移率的尾随电解质之前使在所述分离通道中的所述电离样品在第一方向上流动，以致如果所述样品包括多个组分，则在所述第一方向上，具有最高迁移率的所述样品的组分正好在所述前导电解质之后流动，并且具有最低迁移率的所述样品的组分正好在所述尾随电解质之前流动。
4.权利要求1所述的方法，其中在不引导所述样品通过阀的情况下使所述样品流动穿过所述至少一个固相萃取床并且进入所述分离通道中，并且其中所述电泳分离分析物组分包括向所述流体微芯片装置施加电场以致所述电场的至少一个组分与所述分离通道的部分的轴向平行。
5.权利要求4所述的方法，其中所述施加电场包括在所述背景电解质储蓄器中的第一位置和所述第一位置的下游的第二位置之间施加电势差，其中所述第二位置位于所述分离通道中，或位于泵通道中，或位于与所述流体微芯片装置的所述分离通道或所述泵通道之一或二者流体连通的储蓄器中。
6.权利要求1所述的方法，其中所述离子配对剂包括三氟乙酸。
7.权利要求1所述的方法，所述方法还包括，在使所述样品流动通过所述样品通道并且穿过所述至少一个固相萃取床之后，使洗脱流体流动通过所述样品通道并且穿过所述至少一个固相萃取床。
8.权利要求1所述的方法，所述方法还包括，在使所述样品流动穿过所述至少一个固相萃取床之前，通过使预调节流体流动穿过所述至少一个固相萃取床并且进入所述流体微芯片装置的废料储蓄器中来预调节所述固相萃取床。
9.权利要求1所述的方法，所述方法还包括，在使所述样品流动通过所述样品通道之前，通过使固相萃取材料流动进入所述样品通道中而在所述样品通道中形成所述至少一个固相萃取床。
10.权利要求9所述的方法，其中所述固相萃取床包括沿着由所述样品通道限定的流动方向测量的在100μm至1000μm之间的长度，以及在50pL至10nL之间的体积。
11.权利要求1所述的方法，所述方法还包括使用阻塞部件以至少部分堵塞所述样品通道，其中所述阻塞部件与最接近所述分离通道的所述至少一个固相萃取床的末端相邻放置。
12.权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
通过使所述背景电解质储蓄器、废料储蓄器和包括所述样品的样品储蓄器的密封的顶部空间加压来使所述样品流动通过所述样品通道，
其中所述背景电解质储蓄器、所述废料储蓄器和所述样品储蓄器各自与所述分离通道流体连通；并且
其中在不向所述样品储蓄器、所述背景电解质储蓄器或所述废料储蓄器施加电压的情况下和/或在所述样品通道、所述背景电解质通道和所述废料通道中的任一个中都没有电势梯度的情况下，使所述样品流动通过所述样品通道。
13.权利要求1所述的方法，所述方法还包括施加流体压力以使得样品流动通过所述样品通道，穿过所述至少一个固相萃取床，并且进入所述分离通道中。
14.权利要求13所述的方法，其中施加流体压力包括：
(a)第一，向所述流体微芯片装置的废料储蓄器的密封的顶部空间和所述流体微芯片装置的样品储蓄器的密封的顶部空间中的每一个同时施加在0.1磅/平方英寸至50磅/平方英寸之间的压力，其中向所述废料储蓄器的密封的顶部空间施加的压力小于向所述样品储蓄器的密封的顶部空间施加的压力；
(b)第二，向所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间并且向所述样品储蓄器的密封的顶部空间同时施加压力；和
(c)第三，降低向所述样品储蓄器的密封的顶部空间施加的压力并且向所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间施加在0.1磅/平方英寸至50磅/平方英寸之间的压力，以致向所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间施加的压力大于向所述样品储蓄器的密封的顶部空间施加的压力从而将所述样品从所述样品通道冲洗至所述分离通道中。
15.权利要求14所述的方法，其中从所述样品中电泳分离所述分析物组分包括当所述样品在所述分离通道中时，降低向所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间施加的压力并且在所述背景电解质储蓄器中的第一位置和所述第一位置的下游的第二位置之间施加电势差。
16.权利要求1所述的方法，其中从所述样品中电泳分离所述分析物组分包括移除向所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间施加的压力，同时在所述背景电解质储蓄器中的第一位置和所述第一位置的下游的第二位置之间施加电势差。
17.权利要求14所述的方法，其中在(b)中，向所述背景电解质储蓄器和所述样品储蓄器的密封的顶部空间施加的同时的压力各自在0.5磅/平方英寸至50磅/平方英寸之间，并且其中在(c)中，不向所述样品储蓄器的密封的顶部空间施加压力并且向所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间施加以冲洗所述样品的压力在0.1磅/平方英寸至10磅/平方英寸之间。
18.权利要求1所述的方法，其中所述流体微芯片装置包括：
第一压力供给管，所述第一压力供给管与第一加压气体源连通并且通过第一阀连接至所述背景电解质储蓄器的密封的顶部空间；
第二压力供给管，所述第二压力供给管与所述第一加压气体源或第二加压气体源连通并且通过第二阀连接至与所述样品通道流体连通的样品储蓄器的密封的顶部空间；和
第三压力供给管，所述第三压力供给管与所述第一加压气体源、所述第二加压气体源和降压装置中的一个流体连通并且通过第三阀连接至废料储蓄器的密封的顶部空间，
其中所述废料储蓄器与在所述样品通道对面的废料通道流体连通并且与所述分离通道流体连通；并且
其中所述方法还包括：
以限定顺序电子打开和关闭所述第一、第二和第三阀，以使所述样品流动通过所述样品通道，穿过所述至少一个固相萃取床，并且进入所述分离通道中。
19.权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
在质谱仪中捕获所述分析物组分的离子；
检测与捕获的离子相对应的电子信号；和
基于所述电子信号产生与所述分析物组分相对应的质谱信息。
20.流体装置，所述流体装置包括：
微芯片，所述微芯片包括：
至少一个整合的微流体或纳米流体分离通道，所述微流体或纳米流体分离通道与背景电解质储蓄器流体连通并且在所述微芯片中形成；
至少一个整合的纳米流体或微流体样品通道，所述纳米流体或微流体样品通道与所述至少一个微流体或纳米流体分离通道中的相应的一个流体连通并且在所述微芯片中形成；
在所述至少一个纳米流体或微流体样品通道中的相应的一个中的至少一个固相萃取床，所述固相萃取床与所述至少一个微流体或纳米流体分离通道中的相应的一个相邻放置，以致所述至少一个固相萃取床的前导端被放置在距所述分离通道10μm至5cm处；
至少一个整合的纳米流体或微流体废料通道，所述纳米流体或微流体废料通道从所述至少一个分离通道中的相应的一个延伸并且任选放置在所述至少一个样品通道中的相应的一个的对面并且在所述微芯片中形成；和
整合的电喷雾电离发射器，所述电喷雾电离发射器在所述微芯片中形成并且与所述至少一个分离通道之一流体连通。
21.权利要求20所述的装置，所述装置还包括至少一个阻塞部件，所述阻塞部件与最接近所述至少一个分离通道中的相应的一个的所述至少一个固相萃取床的末端相邻放置，以致其至少部分堵塞所述至少一个样品通道中的相应的一个，
其中所述至少一个固相萃取床的前导端被放置在离所述至少一个分离通道中的相应的一个50μm至500μm的距离处；
其中所述至少一个固相萃取床的宽度大于所述至少一个固相萃取床的深度，所述宽度在由所述装置限定的平面中并且在与由所述平面内的所述至少一个样品通道限定的流动方向垂直的方向上测量，并且所述深度在与所述平面并且与所述流动方向垂直的方向上测量；并且
其中所述至少一个固相萃取床包括沿着所述流动方向测量的在100μm至1000μm之间的长度，以及在50pL至10nL之间的体积。
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CN201680061257.5A Active CN108139355B (zh) 2015-10-20 2016-09-21 利用毛细管电泳的固相萃取

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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH710967B1 (de) * 2015-04-13 2019-12-13 Fatzer Ag Drahtseilfabrik Prüfungs- und Überwachungssystem für eine Seilbahn, insbesondere für einen urbanen Transport von Personen und Gütern, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben.
US10718745B2 (en) * 2015-11-09 2020-07-21 Thermo Finnigan Llc Systems and methods for ionization
CN108603828A (zh) 2015-11-30 2018-09-28 因塔生物公司 用于样品表征的装置和方法
US11309172B2 (en) * 2016-08-09 2022-04-19 Purdue Research Foundation Reaction monitoring
US10746696B2 (en) * 2016-12-19 2020-08-18 Analog Devices, Inc. Self-calibrated heavy metal detector
US20190072987A1 (en) * 2017-11-02 2019-03-07 Nri R&D Patent Licensing, Llc Valve configurations facilitating clearing, cleaning, drying, and burst formation for microfluidic devices, fluidic arrangements, and other systems
KR102691269B1 (ko) 2018-01-29 2024-08-05 인타바이오 엘엘씨 샘플 특성화를 위한 장치, 방법 및 키트
EP3811397B1 (en) 2018-05-31 2024-09-18 Intabio, Llc Methods for interfacing microfluidic systems with mass spectrometry
WO2020041865A1 (en) 2018-08-25 2020-03-05 Jp Scientific Limited Method and device for sample introduction for mass spectrometry
CN109709198B (zh) * 2018-12-29 2021-07-20 杭州师范大学 一种毛细管电泳的在线富集方法
CN110031533B (zh) * 2019-05-16 2021-02-02 广西科技大学 固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法
US11285484B2 (en) 2019-08-12 2022-03-29 Intabio, Llc Multichannel isoelectric focusing devices and high voltage power supplies
EP3792623B1 (en) 2019-09-16 2024-10-30 Imec VZW Cyclic capillary electrophoresis device
US12259370B2 (en) * 2020-03-08 2025-03-25 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Electrospray assisted capillary device for processing ultra low-volume samples
US11686705B2 (en) 2020-05-08 2023-06-27 Seagate Technology Llc Gel electrophoresis for DNA purification
US12205811B2 (en) * 2020-12-07 2025-01-21 Thermo Finnigan Llc Sample supports for solid-substrate electrospray mass spectrometry
CN113447578A (zh) * 2021-05-24 2021-09-28 华东理工大学 一种磁性固相萃取微流控芯片-质谱联用装置及其应用
CA3235153A1 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 National Research Council Of Canada Raised fluidic channels and methods of manufacture

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770029A (en) 1996-07-30 1998-06-23 Soane Biosciences Integrated electrophoretic microdevices
US6001229A (en) 1994-08-01 1999-12-14 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Apparatus and method for performing microfluidic manipulations for chemical analysis
US5872010A (en) 1995-07-21 1999-02-16 Northeastern University Microscale fluid handling system
US6547942B1 (en) 1996-06-28 2003-04-15 Caliper Technologies Corp. Electropipettor and compensation means for electrophoretic bias
US6074827A (en) * 1996-07-30 2000-06-13 Aclara Biosciences, Inc. Microfluidic method for nucleic acid purification and processing
US6268220B1 (en) * 1996-09-09 2001-07-31 Washington University Diagnostic method for atherosclerosis
US6787111B2 (en) 1998-07-02 2004-09-07 Amersham Biosciences (Sv) Corp. Apparatus and method for filling and cleaning channels and inlet ports in microchips used for biological analysis
JP4178653B2 (ja) 1999-02-26 2008-11-12 日立化成工業株式会社 電気泳動用チップとその製造方法、該電気泳動用チップを用いた電気泳動装置及び荷電性物質の分離方法
US6375817B1 (en) 1999-04-16 2002-04-23 Perseptive Biosystems, Inc. Apparatus and methods for sample analysis
US20020189946A1 (en) 2000-02-11 2002-12-19 Aclara Biosciences, Inc. Microfluidic injection and separation system and method
US6685813B2 (en) 2000-02-11 2004-02-03 Aclara Biosciences, Inc. Tandem isotachophoresis/zone electrophoresis method and system
WO2001069226A1 (en) 2000-03-10 2001-09-20 Dna Sciences, Inc. Cross channel device for serial sample injection
WO2002008410A2 (en) * 2000-07-20 2002-01-31 The Dow Chemical Company Nucleic acids compositions conferring dwarfing phenotype
US20020112959A1 (en) 2000-10-04 2002-08-22 Qifeng Xue Unbiased sample injection for microfluidic applications
US20020115293A1 (en) 2001-01-03 2002-08-22 Bahram Ghodsian Device to rapidly and accurately sequence long DNA fragments
ATE416675T1 (de) * 2002-03-11 2008-12-15 Janusz B Pawliszyn Mikrovorrichtungen zur untersuchung von biologischen systemen
US6833068B2 (en) 2003-01-13 2004-12-21 Sandia National Laboratories Passive injection control for microfluidic systems
US20040195099A1 (en) 2003-04-04 2004-10-07 Jacobson Stephen C. Sample filtration, concentration and separation on microfluidic devices
US20040224425A1 (en) 2003-05-08 2004-11-11 Gjerde Douglas T. Biomolecule open channel solid phase extraction systems and methods
WO2005011832A2 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Sullivan James J A simultaneous multi-colum liquid chromatograph for direct sampling of an array of liquid samples
CN100458434C (zh) * 2003-09-05 2009-02-04 卡钳生命科学股份有限公司 分析物注射系统
US8007725B2 (en) 2003-11-07 2011-08-30 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having valve system
US20060060769A1 (en) 2004-09-21 2006-03-23 Predicant Biosciences, Inc. Electrospray apparatus with an integrated electrode
JP2006317357A (ja) 2005-05-13 2006-11-24 Shimadzu Corp マイクロチップ電気泳動方法及び装置
US7749365B2 (en) 2006-02-01 2010-07-06 IntegenX, Inc. Optimized sample injection structures in microfluidic separations
US7846314B2 (en) 2006-05-11 2010-12-07 Agilent Technologies , Inc Handling a plurality of samples
JP5052996B2 (ja) 2007-08-22 2012-10-17 アイダエンジニアリング株式会社 電気泳動用マイクロ流路チップ及び電気泳動方法
EP2234916A4 (en) * 2008-01-22 2016-08-10 Integenx Inc UNIVERSAL SPECIMEN PREPARATION SYSTEM AND ITS USE IN AN INTEGRATED ANALYSIS SYSTEM
US8394251B2 (en) * 2008-10-07 2013-03-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Control of chemical reactions using isotachophoresis
US7927476B2 (en) 2008-12-22 2011-04-19 General Electric Company Injection method for microfluidic chips
US8546752B2 (en) * 2009-12-07 2013-10-01 Advion Inc. Solid-phase extraction (SPE) tips and methods of use
WO2012040098A2 (en) 2010-09-21 2012-03-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods, systems and devices for forming nanochannels
US9006648B2 (en) 2011-03-11 2015-04-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Microchips with integrated multiple electrospray ionization emitters and related methods, systems and devices
US9670540B2 (en) * 2011-07-21 2017-06-06 Cornell University Methods and devices for DNA sequencing and molecular diagnostics
JP6339024B2 (ja) 2012-02-10 2018-06-06 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 流体ナノファンネルを有する装置、関連する方法、製造及び解析システム
US9683961B2 (en) * 2012-08-13 2017-06-20 University Of Tasmania Electrophoretic separation of analytes
JP6510984B2 (ja) 2013-02-28 2019-05-08 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 巨大分子の制御される捕捉、捕獲、及び輸送の為の統合された構成要素を有するナノ流体の装置、及び関連する分析方法
US9255288B2 (en) 2013-03-13 2016-02-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanofluidic devices for the rapid mapping of whole genomes and related systems and methods of analysis
US8759753B1 (en) * 2013-03-14 2014-06-24 Thermo Finnigan Llc Methods and apparatus for improved immunosuppressant drug monitoring
US9255905B1 (en) * 2015-05-11 2016-02-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Pressure driven microfluidic injection for chemical separations

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