CN108138221A - 用于检测核酸的超高灵敏度探针 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了具有超高灵敏度的用于检测核酸的组合物及其使用方法。该组合物包含能够与目标核酸杂交的目标探针，至少一个第一桥探针，至少一个第二桥探针和标记探针。所述目标探针包括具有第一尾核苷酸序列的预桥区域。第一桥探针依次包括具有第一头部核苷酸序列的第一头部区域，具有间隙核苷酸序列的第一间隙区域和具有第一尾部核苷酸序列的第一尾部区域。第二桥探针依次包括具有与第一头部核苷酸序列互补的第二头部核苷酸序列的第二头部区域，具有间隙核苷酸序列的第二间隙区域和具有与第一尾部核苷酸序列互补的第二尾部核苷酸序列的第二尾部区域。标记探针能够与第一和第二间隙核苷酸区域杂交。

Description

用于检测核酸的超高灵敏度探针
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请No.62/159,318的优先权。该临时申请于2015年5月10日提交，其公开内容在此作为引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及核酸化学和分析。更具体地，本发明涉及可以用于检测样品中核酸的探针和方法。
技术背景
用于检测核酸的基于杂交方法，例如Northern和Southern印迹，原位杂交，在分子诊断和生物医学研究中具有广泛的应用。原则上，杂交探针的形成是将可以提供检测信号(例如放射性和荧光)的标记与DNA或RNA片段相缀合，所述DNA或RNA片段具有与目标序列互补的序列。由于探针和目标之间的互补性，杂交探针与含有目标序列的单链核酸(DNA或RNA)杂交。通过检测来自标记的信号从而确定目标序列的存在或不存在。
然而，杂交探针的应用会受到限制，原因是因为其缺乏灵敏度和特异性而不能检测到具有低拷贝数的DNA或RNA目标。因此，需要继续开发具有超高灵敏度的探针来检测核酸。
发明内容概述
一方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含能够与目标核酸杂交的目标探针，至少一个第一桥探针、至少一个第二桥探针和至少一个带有标记的标记探针。所述目标探针包括具有第一尾核苷酸序列的预桥区域。第一桥探针依次包括具有第一头部核苷酸序列的第一头部区域，具有间隙核苷酸序列的第一间隙区域和具有第一尾部核苷酸序列的第一尾部区域。第二桥探针依次包括具有与第一头部核苷酸序列互补的第二头部核苷酸序列的第二头部区域，具有间隙核苷酸序列的第二间隙区域和具有与第一尾部核苷酸序列互补的第二尾部核苷酸序列的第二尾部区域。标记探针能够与第一和第二间隙核苷酸区域杂交。
在某些实施方案中，第一头部核苷酸序列由4-20个核苷酸组成(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)。
在某些实施方案中，第一尾部核苷酸序列由4-20个核苷酸组成(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)。
在某些实施方案中，间隙核苷酸序列由6-20个核苷酸组成(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)。
在某些实施方案中，所述标记是荧光基团，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在某些实施方案中，本公开中所述的探针(例如，目标探针，桥探针，标记探针)可以包含一个或多个核苷酸类似物(例如，被改变的主链，糖或核碱基)。在某些实施方案中，核苷酸类似物选自以下组：5-溴尿嘧啶，肽核酸核苷酸，异种核酸核苷酸，吗啉代，锁核酸核苷酸，二醇核酸核苷酸，苏糖核酸核苷酸，双脱氧核苷酸，虫草素，7-脱氮-GTP，荧光团(例如与糖连接的罗丹明或荧光素)，含硫醇的核苷酸，生物素连接的核苷酸，荧光碱基类似物，甲基-7-鸟苷，甲基化的核苷酸，肌苷，硫尿苷，假尿嘧啶，二氢尿苷，秋豆苷和肌苷。在某些实施方案中，核苷酸类似物是锁核酸核苷酸。
在某些实施方案中，目标核酸选自以下组：DNA，cDNA，RNA，mRNA，rRNA，miRNA，LncRNA和siRNA。
在某些实施方案中，目标探针还包含具有间隙核苷酸序列的标记区域。
在某些实施方案中，上述组合物进一步包含能够与目标核酸杂交的捕获探针，所述捕获探针包含磁珠或生物素。
在一个实施方案中，所述第一桥探针与所述第二桥探针相同。
在一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含能够与目标核酸杂交的目标探针，至少一个桥探针以及能够与桥探针杂交的标记探针。目标探针包含具有尾部回文序列的预桥区。所述桥探针依次包含(i)具有头部回文序列的第一区域；(ii)具有间隙序列的第二区域；和(iii)具有尾部回文序列的第三区域。所述标记探针包含标记。
在某些实施方案中，所述头部回文序列由4-20个核苷酸组成(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)。
在某些实施方案中，所述尾部回文序列由4-20个核苷酸组成(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)。
另一方面，本公开提供了检测样品中的目标核酸的方法。根据一个实施方案，该方法包括以下步骤：a)使目标探针与目标核酸接触；b)将第一桥探针，第二桥探针和标记探针与目标探针相连接；和c)检测与目标分子相关的标记探针的存在，不存在或含量。所述目标探针能够与目标核酸杂交，并且包含具有尾部核苷酸序列的预桥区。所述第一桥探针依次包括(i)具有第一头部核苷酸序列的第一头部区域；(ii)具有间隙核苷酸序列的第一间隙区域；和(iii)具有尾部核苷酸序列的第一尾部区域。所述第二桥探针依次包括(i)具有与所述第一头部核苷酸序列互补的第二头部核苷酸序列的第二头部区域；(ii)具有所述间隙核苷酸序列的第二间隙区域；(iii)具有与第一尾部核苷酸序列互补的第二尾部核苷酸序列的第二尾部区域。所述标记探针能够与桥探针杂交，所述标记探针包含标记。
在某些实施方案中，样品选自血清，血浆，唾液，尿液，细胞和组织。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括用带有磁珠或生物素的捕获探针捕获所述目标核酸的步骤，其中所述捕获探针能够与目标核酸杂交。
附图说明
图1示出了依据本发明实施例的超高灵敏度探针组合物。
图2示出了依据本发明另一实施例的超高灵敏度探针组合物。
图3示出了在实施例1中使用的目标核酸(目标)，捕获探针(生物素-I)，目标探针(II)，第一个桥探针(O1)，第二个桥探针(O2)和标记探针(阴-阳探针P1)。
图4示出了使用超高灵敏度探针组合物检测靶核酸的方法，所述方法基于实施例1。
图5A是使用实施例1中的探针组合物检测目标核酸的工作原理示意图。
图5B示出了实施例1中同时需要第一桥探针和第二桥探针二者来检测目标核酸。
图6示出了实施例2中的桥探针(O3)的序列以及使用O3检测目标核酸的工作原理示意图。
图7示出了使用超高灵敏度探针组合物检测靶核酸的方法，所述方法基于实施例3。
图8示出了实施例3中使用的目标核酸，第一桥探针(H1)和第二桥探针(H2)的序列。
图9是实施例3中检测目标核酸的工作原理示意图。
图10是使用实施例3中的探针组合物检测目标核酸的工作原理示意图。
具体实施方式
在上述发明内容概述和发明详述，以及下述权利要求和附图中，都提及了本发明的特定特征(包括方法步骤)。应该理解，本公开中相关发明的内容包含这些特定特征的所有可能的组合。例如，在本发明的特定方面或实施例或特定权利要求的上下文中公开特定特征的情况下，该特征也可以在可能的范围内与/或在其他特定的上下文中使用本发明的方面和实施例以及本发明的一般方面。
术语“包括”及其语法等同物在本公开中用于表示其它组分，成分，步骤等都是可选择性的存在。例如，一个含有(或“包括”)组分A，B和C的组合可以由(有且仅有)组分A，B和C组成，或者不仅可以含有组分A，B和C，而且还有一个或多个其他组分。
在本公开中提及的方法包括两个或更多个限定步骤的情况时，所定义的步骤可以以任何顺序或同时进行(除非上下文排除该可能性)，并且该方法可以包括一个或多个其他步骤，所述步骤可以在任何定义的步骤之前，在两个定义的步骤之间或在所有定义的步骤之后执行(除非上下文排除了该可能性)。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值至该下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间以及任何其他所述或在该规定的范围内的中间值，都包含在本公开内容中，并且需要受规定范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除这些限制中的一个或两个的范围也包括在本公开中。
应当理解，为了简单和清楚说明的目的，在适当的情况下，在不同的附图中重复了数字标记以指示对应的或类似的元件。此外，本公开中阐述了许多具体细节，从而能提供对所述实施例的透彻理解。然而，可以在没有这些具体细节的情况下实施本公开所描述的实施例。在其他情况下，方法，过程和组件并没有被详细描述，以免模糊所描述的相关功能。并且，描述不被理解为是限制本公开描述的实现的范围。应当理解，除非另有说明，本公开中阐述的实施例的描述和表征不应被认为是相互排斥的。
在本公开中使用以下定义：
应当理解，除非上下文另有明确规定，否则本公开和附加权利要求中所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，对“桥探针”的引用是对一个或多个桥探针的引用，并且包括本领域技术人员已知的等同物等等。
如本文所使用的，“连接”或“关联”是指物理上的直接或间接的附着。例如，标记探针可以与一个或多个桥探针杂交，所述桥探针与目标核酸杂交，从而标记探针与目标核酸相连接。
术语“至少”以及后跟的数字在本文中用于表示一个以该数字为开始的范围的开端(其可以是具有上限或没有上限的范围，这取决于所定义的变量)。例如，“至少1”表示1或者大于1。术语“至多”以及后跟的数字在本文中用于表示一个以该数字为结尾的范围的结束(其可以是以1或0作为下限的范围，或没有下限的范围，这取决于所定义的变量)。例如，“至多4”表示4或者小于4，“至多40％”表示40％或者小于40％。在本公开中，当将范围设为“(第一个数字)至(第二个数字)”或“(第一个数字)-(第二个数字)”时，这意味着所述范围下限是第一个数字，其上限是第二个数字。例如，4～20个核苷酸是指下限为4个核苷酸，上限为20个核苷酸的范围。
本公开中所使用的“桥探针”是能够与目标探针和标记探针杂交的核酸。桥探针还能够与其他桥探针杂交，形成梯形结构，所形成的梯形结构能够与多个标记探针杂交，从而放大可检测的信号。通常，桥探针依次包括具有头部核苷酸序列的第一区域，具有间隙核苷酸序列的间隙区域和具有尾部核苷酸序列的尾部区域。在某些实施方案中，桥探针依次包括第一回文核苷酸序列(即头部回文序列)，与标记探针的核苷酸序列互补的第二核苷酸序列(即，间隙核苷酸序列)和第三回文核苷酸序列(即，尾部回文序列)。例如，桥探针可以具有头部回文序列5'-AGCT-3'和尾部回文序列5'-GCGC-3'。
如本公开所用，“捕获探针”是指能够与目标核酸杂交的多核苷酸。通常，捕获探针包括与目标核酸的序列互补的核苷酸序列。在优选的实施方案中，目标核酸中与捕获探针互补的序列和目标核酸中与目标探针互补的序列互相不重叠。在某些实施方案中，捕获探针与磁珠缀合，通过所述磁珠可以捕获复合物，所述复合物包含目标核酸和本公开中的超高灵敏度组合物。
如本公开所用，术语“核酸”(与术语“多核苷酸”可互换)涵盖单体单元的任何物理串，其可对应于一串核苷酸，包括核苷酸的聚合物(例如,典型的DNA或RNA聚合物)，肽核酸(PNA)，修饰的寡核苷酸(例如,所述寡核苷酸包含对生物RNA或DNA不常规的核苷酸，如2'-O-甲基化的寡核苷酸)等等。多核苷酸的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或者是核苷酸类似物，可以是天然的和非天然的，可以是未取代的，未修饰的，取代的或修饰的。核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键，甲基膦酸酯键，硼烷磷酸酯键等连接。多核苷酸可以另外包含非核苷酸元件，例如标记，淬灭基团，封闭基团等等。多核苷酸可以是例如，单链或双链。
如本公开所用，“核苷酸类似物”是指包含一个或多个修饰(例如改变的主链，糖或核碱基)的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)。核苷酸类似物的一些非限制性的实例包括：5-溴尿嘧啶，肽核酸核苷酸，异源核酸核苷酸，吗啉代，锁核酸核苷酸，乙二醇核酸核苷酸，苏糖核酸核苷酸，双脱氧核苷酸，虫草素，7-脱氮-GTP，荧光基团(例如与糖连接的若丹明或荧光素)，含硫醇的核苷酸，生物素连接的核苷酸，荧光碱基类似物，CpG岛，甲基-7-鸟苷，甲基化的核苷酸，肌苷，硫代尿苷，假尿苷，二氢尿苷，辫苷和丫苷。
异核酸(XNA)是指一组合成聚合物，所述聚合物与DNA和RNA相似，但其糖骨架不同。XNA的实例包括但不局限于1,5-脱水己糖醇核酸(HNA)，环己烯核酸(CeNA)，苏糖核酸(TNA)，乙二醇核酸(GNA)，锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)。
肽核酸(PNA)是与DNA或RNA类似的人造合成聚合物。尽管DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖的糖骨架，但是PNA的骨架是由重复的N-(2'氨基乙基)-甘氨酸单元通过肽键连接形成。不同的嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基桥(-CH2-)和羰基(-(C＝O)-)与骨架连接。因为PNA的骨架不含带电荷的磷酸基团，由于缺乏静电排斥，PNA/DNA链之间的结合强于DNA/DNA链之间的结合，从而导致解链温度升高。
锁核酸是被修饰的RNA核苷酸，其核糖部分被额外桥修饰，所述额外桥连接2'氧和4'碳。所述桥将核糖“锁定”在3'-内构象中，这增强了锁核酸的碱基堆积和骨架预组织，从而显着增加其杂交性质(解链温度)。
苏糖核酸(TNA)的骨架结构是由重复的苏糖通过磷酸二酯键连接而形成。TNA可通过Wastson-Crick碱基配对原理自组装成双链结构，也可形成与DNA和RNA链互补的碱基对。
乙二醇核酸(GNA)的骨架结构是由重复的二醇单元通过磷酸二酯键连接而形成。GNA的Wastson-Crick碱基配对能力比DNA和RNA更强，并且需要高温来解链双链GNA或GNA/DNA，GNA/RNA。
“核酸目标”或“目标核酸”是指待检测的核酸或任选的区域。
如本公开所用，“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”是指核苷酸(寡核苷酸，DNA，核酸等)聚合物或代表核苷酸聚合物的字符串，具体情况取决于上下文。从任意指定的核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补核酸序列。
本公开中所使用的“标记”是指促进分子检测的部分，所述部分一般直接或者间接提供可检测信号。本发明上下文中的常见标记包括荧光，发光，光散射和/或比色标记。合适的标记包括荧光基团和酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，以及放射性核素，底物，辅酶，抑制剂，化学发光部分，磁性颗粒等。
如本公开所用，“标记探针”是指直接或间接结合目标分子的实体，所述目标分子可以通过例如读出仪器的方法被检测到。标记探针通常是单链多核苷酸，其包含一个或多个标记，所述标记直接或间接提供可检测信号。在某些实施方案中，标记探针是双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包含能够提供可检测信号的标记。标记可以共价连接到多核苷酸，或者多核苷酸可以被设定从而与标记结合(例如，生物素化的多核苷酸可以结合链霉抗生物素相关标签)。标记探针可以，例如直接与目标核酸杂交，或者标记探针可以与核酸(例如，目标探针)杂交，所述核酸又与目标核酸杂交，或与一种或多种与目标核酸杂交的核酸杂交。在优选的实施方案中，标记探针可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与目标探针，桥探针等中的核苷酸序列(例如，间隙核苷酸序列)互补。
“回文序列”是指核苷酸序列，其不管是在所形成双螺旋的一条链上的5'至3'方向还是其互补链的5'至3'方向的序列都是相同的。例如，DNA序列5'-AGCT-3'是回文的，因为其核苷酸-对应-核苷酸互补是3'-TCGA-5'，所述互补序列与原始序列5'至3'是一样的。
如本公开所用，“探针”是可用于检测目标分子的实体。典型地,本公开中的探针是指带有或不带有修饰的核酸分子。
本公开中所使用的术语“样品”是指任何含有或被怀疑含有目标核酸的样品，包括生物组织或流体来源的样品，其在体内或原位获得，达到或收集。示例性的生物样品包括但不局限于细胞裂解物，细胞培养物，细胞系，组织，器官，生物流体等。在某些实施方案中，样品选自以下组：血清，血浆，唾液，尿液，细胞和组织。
术语“依次地”是指桥探针中的组分(例如，头部回文序列，间隙序列和尾部回文序列)以5'端至3'端或3'端至5'的顺序并置。例如，头部回文序列位于桥探针的5'端，间隔序列位于头部回文序列的下游，尾部回文序列位于桥探针的3'末端。可以理解的是，桥探针可以包含额外的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以邻近单个组分(例如头部回文序列，间隙序列和尾部回文序列)，或者在不干扰桥探针功能的情况下，位于两个组分之间。
如本公开所用，“目标探针”是指能够与目标核酸杂交并使标记探针与目标核酸缔合的多核苷酸。目标探针可以与一个或多个核酸(即桥探针)杂交，所述核酸进而与标记探针杂交，或者在某些实施方案中，它可以直接与标记探针杂交。因此，目标探针包括与目标核酸的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列和与桥探针的核苷酸序列(例如，尾部回文序列)互补的第二核苷酸序列(例如，尾部回文序列)。在某些实施方案中，目标探针还包括与标记探针的核苷酸序列互补的第三核苷酸序列(例如，间隙核苷酸序列)。目标探针优选为单链。
超高灵敏度的探针组合物
在一个方面，本公开提供了具有超高灵敏度的用于检测核酸的探针组合物。图1示出了本公开中所述的具有超高灵敏度的探针组合物的示例性实施方式。在图1中，探针组合物包括目标探针，至少一个桥探针1(图示中有两个)，至少一个桥探针2(图示中有两个)和标记探针(图示中有四个)组成。目标探针依次地(例如，从5'至3')包括目标区域和预桥区域；所述目标区域的核苷酸序列与目标核酸的区域互补，所述预桥区域具有尾部序列1的核苷酸序列。桥探针1依次地(例如，从5'到3')包括具有头部序列1的核苷酸序列的第一头部区域，具有间隙序列的核苷酸序列的间隙区域和具有尾部序列1的核苷酸序列的尾部区域。桥探针2依次地(例如，从5'到3')包括具有与头部序列1互补的头部序列2的核苷酸序列的头部区域，具有间隙序列的核苷酸序列的间隙区域和具有与尾部序列1互补的尾部序列2的核苷酸序列的尾部区域。标记探针包括具有与间隙序列互补的核苷酸序列的区域，并且所述探针能够与该间隙区域杂交。
当目标探针，桥探针1，桥探针2和标记探针共存于合适的溶液和合适的温度(例如，约4℃至约50℃)下时，用于检测目标核酸的复合物可以自发形成。如图1所示，目标探针通过目标区域与目标核酸杂交。同时，目标探针通过与尾部序列1和尾部序列2的杂交从而与桥探针2杂交。桥探针2通过头部序列1和头部序列2的杂交进一步与桥探针1杂交，并与标记探针在间隙区域杂交。然后桥探针1通过尾部序列1和尾部序列2的杂交与另一个桥探针2进一步杂交，并且还在间隙区域与标记探针杂交。如此，可以通过杂交链式反应形成探针复合物，其中每个桥探针分别在其头部和尾部区域与两个其他桥探针杂交，并且在间隙区域与标记探针杂交。探针复合物可以包括多个标记探针，所述复合物能够产生足够强的信号从而检测低含量的目标核酸。
在某些实施方案中，超高灵敏度的探针组合物还包含捕获探针。捕获探针能够与目标核酸杂交，并且包括试剂，所述试剂可用于分离，富集或纯化与超高灵敏度的探针组合物偶联的目标核酸。在一个实施方案中，捕获探针被操作与磁珠连接。在另一个实施方案中，捕获探针被操作与生物素连接，所述生物素可以和与链霉亲和素偶联的珠子相互作用。
在某些实施方案中，阴阳探针(参见美国专利号7,799,522，作为引用并入本公开)可用作标记探针。阴阳探针是由两个不同长度的互补寡核苷酸链组成的双链探针。一条链被荧光基团标记，另一条链被荧光淬灭基团标记。当以稳定的双链结构自杂交时，荧光基团和荧光淬灭基团非常接近，因此荧光基团被荧光淬灭基团淬灭并且探针不发荧光。当目标核酸存在时，探针的较长链可以自发地与目标核酸结合，双链探针解离，荧光基团发出荧光。使用阴阳探针可以降低背景信号并进一步提高本公开中的超高灵敏度组合物的灵敏度。
在某些实施例中，图1中的桥探针1和桥探针2可以是相同的。图2示出了这样的一个实施例。参考图1。如图2所示，探针组合物包括目标探针，至少一个桥探针(图示中有四个)和标记探针(图示中有四个)。目标探针依次地(例如，从5'到3')包括目标区域和预桥区域；所述目标区域的核苷酸序列与目标核酸的区域互补，所述预桥区域具有尾部序列的核苷酸序列。桥探针依次地(例如，从5'到3')包括具有头部序列的核苷酸序列的第一头部区域，具有间隙序列的核苷酸序列的间隙区域和具有尾部序列的核苷酸序列的尾部区域。每一个头部序列和尾部序列是独立的回文序列。结果，头部序列可以杂交到另一个头部序列。同样，尾部序列可以杂交到另一个尾部序列。标记探针包括具有与间隙序列互补的核苷酸序列的区域，并且所述探针能够与该间隙区域杂交。
当目标探针，桥探针和标记探针共存于合适的溶液和合适的温度(例如，约4℃至约50℃)下时，用于检测目标核酸的复合物可以自发形成。在图2中，目标探针通过目标区域与目标核酸杂交。同时，目标探针通过两个尾部序列的杂交与桥探针杂交，所述两个尾部序列中，一个在目标探针上，另一个在桥探针上。桥探针通过头部序列的杂交进一步与另一个桥探针杂交，并与标记探针在间隙区域杂交。如此，可以通过杂交链式反应形成探针复合物，其中每个桥探针分别在其头部和尾部区域与两个其他桥探针杂交，并且在间隙区域与标记探针杂交。探针复合物可以包括多个标记探针，所述复合物能够产生足够强的信号从而检测低含量的目标核酸。
下述实施例用于解释本发明。所述实施例不旨在以任何方式进行限制。
实施例1
该实施例是用探针组合物检测目标核酸的示意图，所述探针组合物包含目标探针，捕获探针，第一桥探针，第二桥探针和标记探针。
图3示出了目标核酸(目标)，捕获探针(生物素-I)，目标探针(II)，第一个桥探针(O1)，第二个桥探针(O2)和标记探针(P1)的核苷酸序列。
该检测方法的过程在图3中示出。如图3所示，目标核酸与捕获探针(生物素-I)，目标探针(II)，第一个桥探针(O1)，第二个桥探针(O2)和标记探针(P1或P1+)混合在10mMTris，15mM MgCl2的溶液。然后，目标核酸，捕获探针，目标探针，第一个桥探针，第二个桥探针和标记探针形成复合物，所形成的复合物被链霉亲和素包被的磁珠(Nvigen目录编号：K61002)拉下。然后用水/或10mM Tris，15mM MgCl2的溶液，95℃煮沸5分钟，把复合物从链霉亲和素包被的磁珠上洗脱下来。之后使用荧光读取器(BioRad CFX96)确定来自被洗脱的复合物的荧光信号。
检测过程的结果在图5A和5B中示出。如图5A所示，在没有目标核酸的情况下，仅能检测到背景荧光。相反，当目标核酸存在时，能检测到强烈的荧光信号。检测到的荧光信号对目标核酸具有特异性，上述结果被非特异性目标探针的使用结果所证实，因为非特异性目标探针产生了与背景相当的信号。结果还表明，使用单链探针(P1+)产生强信号，所产生的信号强度与使用阴阳探针产生的信号强度相当。如图5B所示，第一和第二桥探针都是形成探针组合物所必需的，因为只有一个桥探针存在时，会产生背景信号。
实施例2
该实施例是用探针组合物检测目标核酸的示意图，所述探针组合物包含目标探针，捕获探针，桥探针和标记探针。
图6示出了桥探针(O3)核苷酸序列，其在头部和尾部区域包含回文序列。目标核酸，目标探针，捕捉探针和标记探针的序列与实施例1中所使用的序列相同。
检测过程通常与实施例1相同。
图7示出了检测结果。如图8所示，使用O3产生了对目标核酸具有特异性的强信号。
实施例3
该实施例说明了使用不含下拉步骤的探针组合物来检测目标核酸。
图8示出了目标核酸，第一个桥探针(H1)和第二个桥探针(H2)的序列。标记探针是实施例1中使用的阴阳探针P1。
图9说明了检测的原理。在第一个桥探针中，部分头部序列与第一个桥探针的尾部序列互补，在头部序列的5'末端有6个额外的核苷酸(下划线标记)。在目标核酸不存在的情况下，第一个桥探针形成发夹结构。在第二个桥探针中，头部序列与部分尾部序列互补，在尾部序列的3'末端有6个额外的核苷酸(下划线标记)。H1的头部序列与H2的尾部序列相同，除去H1的5'末端的6个额外核苷酸与H2的3'末端的6个核苷酸互补。H1的尾部序列与H2的头部序列相同。在目标核酸不存在的情况下，第二个桥探针也形成发夹结构。
当目标核酸存在，并且所述目标核酸与H1的头部序列互补时，H1的发夹结构打开，释放H1的尾部序列。被释放的H1的尾部序列与H2的尾部序列杂交，从而打开了H2的发夹结构并释放H2的头部序列。之后标记探针与H1或H2的间隙序列杂交。这样通过连锁反应形成探针组合物。
如图10所示，当标记探针与H1和H2探针混合时，即使目标核酸不存在，也能检测到背景水平的荧光信号。但是，当加入目标核酸(40nmol)引发杂交链式反应后，H1和H2的发夹结构打开，标记探针可以与之结合，从而产生增强的荧光信号。

Claims (22)

1.一种组合物，包含：
a)能够与目标核酸杂交的目标探针，所述目标探针包含具有第一尾部核苷酸序列的预桥区；
b)至少一个第一桥探针，依次包括
(i)具有第一头部核苷酸序列的第一头部区域；
(ii)具有间隙核苷酸序列的第一间隙区域；
(iii)具有第一尾部核苷酸序列的第一尾部区域；
c)至少一个第二桥探针，依次包括
(i)具有第二头部核苷酸序列的第二头部区域，所述第二头部核苷酸序列与所述第一头部核苷酸序列互补；
(ii)具有所述间隙核苷酸序列的第二间隙区域；
(iii)具有第二尾部核苷酸序列的第二尾部区域，所述第二尾部核苷酸序列与所述第一尾部核苷酸序列互补；
d)能够与第一和第二间隙核苷酸区域杂交的标记探针，所述标记探针包含标记。
2.权利要求1的组合物，其中所述第一头部核苷酸序列由4-20个核苷酸组成。
3.权利要求1的组合物，其中所述第一个尾部核苷酸序列由4-20个核苷酸组成。
4.权利要求1的组合物，其中所述间隙核苷酸序列由6-20个核苷酸组成。
5.权利要求1的组合物，其中所述目标探针和/或所述第一桥探针和/或所述第二桥探针和/或所述标记探针包含至少一个核苷酸类似物。
6.权利要求5的组合物，其中所述核苷酸类似物是锁核酸核苷酸。
7.权利要求1的组合物，其中所述标记是荧光基团，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
8.权利要求1的组合物，其中所述目标核酸选自以下组：DNA，cDNA，RNA，mRNA，rRNA，miRNA，Lnc RNA和siRNA。
9.权利要求1的组合物，其中所述目标探针还包含具有所述间隙核苷酸序列的标记区域。
10.权利要求1的组合物，还包含能够与所述目标核酸杂交的捕获探针，所述捕获探针包含磁珠或生物素。
11.权利要求1的组合物，其中所述第一桥探针与所述第二桥探针相同。
12.一种组合物，包含：
a)能够与目标核酸杂交的目标探针，所述目标探针包含具有尾部回文序列的预桥区；
b)至少一个桥探针，其中所述桥探针依次包括
(i)具有头部回文序列的第一区域；
(ii)具有间隙序列的第二区域；
(iii)具有尾部回文序列的第三区域；和
c)能够与桥探针杂交的标记探针，所述标记探针包含标记。
13.一种检测样品中的目标核酸的方法，所述方法包括：
a)使目标探针与目标核酸接触，其中目标探针能够与目标核酸杂交并且包含具有尾部核苷酸序列的预桥区域；
b)将第一桥探针，第二桥探针和标记探针与目标探针相连接，其中：
所述第一桥探针依次包括
(i)具有第一头部核苷酸序列的第一头部区域；
(ii)具有间隙核苷酸序列的第一间隙区域；和
(iii)具有尾部核苷酸序列的第一尾部区域；
所述第二桥探针依次包括
(iv)具有与第一头部核苷酸序列互补的第二头部核苷酸序列的第二头部区域；
(v)具有间隙核苷酸序列的第二间隙区域；
(vi)具有与第一尾部核苷酸序列互补的第二尾部核苷酸序列的第二尾部区域；
所述标记探针能够与桥探针杂交，所述标记探针包含标记；和
c)检测与目标分子连接的标记探针的存在，不存在或含量。
14.权利要求13的方法，其中所述第一头部核苷酸序列由4-20个核苷酸组成。
15.权利要求13的方法，其中所述第一个尾部核苷酸序列由4-20个核苷酸组成。
16.权利要求13的方法，其中所述间隙核苷酸序列由6-20个核苷酸组成。
17.权利要求13的方法，其中所述标记是荧光基团，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
18.权利要求13的方法，其中所述目标核酸选自以下组：DNA，cDNA，RNA，mRNA，rRNA，miRNA，Lnc RNA和siRNA。
19.权利要求13的方法，其中所述目标探针还包含所述间隙核苷酸序列。
20.权利要求13的方法，其中所述样品选自血清，血浆，唾液，尿液，细胞和组织。
21.权利要求13的方法，还包括用能够与所述目标核酸杂交的捕获探针捕获所述目标核酸的步骤，所述捕获探针包含磁珠或生物素。
22.权利要求13的方法，其中所述第一桥探针与所述第二桥探针相同。
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