CN108132323A - 硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法，其是在反相液相系统中以有机溶剂代替常规水相，其流动相组分均为有机溶剂，采用等度或梯度模式，通过常规C18或石墨化碳色谱柱即可实现对硼酸酯类化合物的有效分离。本发明涉及的硼酸酯类化合物为硼酸频那醇内酯类化合物，为一分子硼酸或取代硼酸与一分子频那醇缩合形成的五元环内酯化合物。本发明的方法能避免硼酸酯化合物的遇水不稳定性，并且加入不同的有机相溶液作为改性剂，可以改变不同硼酸酯化合物的选择性，该方法准确定性定量，峰形好，分离度高，快速高效，且化合物分离环境稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析化学领域的检测方法，具体涉及一种硼酸酯类化合物的液相色谱非水反相检测方法。
背景技术
硼酸酯类化合物起初被用于润滑油添加剂，随着医药行业的迅猛发展，硼酸酯类尤其是硼酸内酯类化合物(如硼酸频那醇内酯等)成为许多活性药物成分的关键中间体，在医药学中适用于多种生物学活性。例如选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，有效地抑制人体肿瘤细胞生长等。然而对于硼酸酯类药物中间体的分析方法仍然存在诸多问题。
例如硼酸酯遇水不稳定，其易水解的本质是因为硼原子为sp2杂化，还存在一个空的p轨道，这个空轨道易于接受水和醇等带有未共用电子对的亲和试剂的进攻而使硼酸酯水解。所以，常规的反相色谱分析无法实现对硼酸酯类化合物的分析分离检测以及制备，硼酸酯类化合物极易在柱内或系统内发生水解。而正相色谱法的操作繁琐，影响因素多，不能作为常规检测方法；若采用气相则对化合物的热稳定性要求较高，且只适用于低沸点的化合物，同样的干扰因素多，存在局限性。
因此，本领域需要开发一种克服硼酸酯类药物中间体遇水不稳定且使用普通反相液相系统来进行检测的分析方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法，以解决克服现有技术中硼酸酯类化合物遇水不稳定，不能使用普通反相液相系统来进行检测的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法，其是在反相液相系统中以有机溶剂代替常规水相，其流动相组分均为有机溶剂，采用等度或梯度模式，通过常规C18或石墨化碳色谱柱即可实现对硼酸酯类化合物的有效分离，准确定性定量，峰形好，分离度高，快速高效，且化合物分离环境稳定性好。
具体的，所述硼酸酯类化合物为硼酸频那醇内酯类化合物，所述硼酸频那醇内酯类化合物为一分子硼酸或取代硼酸与一分子频那醇缩合形成的五元环内酯化合物；其结构式如式I所示：
其中，R为羟基或硼酸取代基，硼酸取代基包括本领域现有的各种硼酸取代基或经常规化学反应可以制得的硼酸取代基。
具体的，所述流动相组分选自甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈。
具体的，所述流动相的优选为甲醇/乙腈体系，四氢呋喃/乙腈体系，二氯甲烷/乙腈体系、四氢呋喃/二氯甲烷体系。
具体的，所述色谱柱选自Waters Xbridge C18色谱柱、Thermo Hypercarb色谱柱。
具体的，所述的液相色谱条件参数，如流动相比例、流速、柱温等，可根据化合物具体的结构和理化性质按常规方法进行合理调节和选择。
具体的，所述流动相为甲醇/乙腈体系，采用等度体积比的甲醇/乙腈＝90/10。
具体的，所述流动相为四氢呋喃/乙腈体系，采用等度体积比的四氢呋喃/乙腈＝10/90。
具体的，所述流动相为二氯甲烷/乙腈体系，采用等度体积比的二氯甲烷/乙腈＝20/80。
具体的，所述流动相为四氢呋喃/二氯甲烷体系，采用等度体积比的四氢呋喃/二氯甲烷＝50/50。
具体的，所述的液相色谱的流速为0.5-1.0ml/min。
具体的，所述液相色谱的柱温为25-40℃。
在一种优选的实施例中，具体色谱条件如下：
色谱柱：Waters Xbridge C18(150mm*4.6mm,3.5um)；柱温：35℃；流动相：A相为甲醇；B相为乙腈；梯度程序：0min，A相90％，B相10％；10min，A相90％，B相10％；流速：1.0ml/min；检测器波长：UV 220nm；进样体积：5μl。
本优选的实施例中，将水相替换为甲醇，发现特定的硼酸酯化合物在醇内有较好的稳定性，且这类化合物对醇有较好的选择性，可以实现快速有效分离纯化。
在一种优选的实施例中，具体色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)；柱温：35℃；流动相：A相为四氢呋喃；B相为乙腈；梯度程序：0min，A相10％，B相90％；10min，A相10％，B相90％；流速：1.0ml/min；检测器波长：UV 220nm；进样体积：5μl。
本优选的实施例中，将色谱柱改为石墨化碳色谱柱，发现对强极性化合物有很好的保留及分离度，且对特殊的溶剂有很好的耐受性。采用四氢呋喃作为流动相，对一些弱极性酯有很好的洗脱能力，能够实现快速分离。
在一种优选的实施例中，具体色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)；柱温：25℃；流动相：A相为四氢呋喃；B相为二氯甲烷；梯度程序：0min，A相50％，B相50％；10min，A相50％，B相50％；流速：1.0ml/min；检测器波长：UV 230nm；进样体积：5μl。
本优选的实施例中，添加二氯甲烷作为改性剂，发现可以有效提高硼酸酯和其它杂质如水解的硼酸化合物之间的选择性从而达到分离效果。流动相可以根据化合物的极性选择适当比例。
在一种优选的实施例中，具体色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)；柱温：25℃；流动相：A相为乙腈；B相为二氯甲烷；梯度程序：0min，A相80％，B相20％；10min，A相80％，B相20％；流速：0.5ml/min；检测器波长：UV 230nm；进样体积：5μl。
本优选的实施例中，在石墨化碳色谱柱的基础上，利用乙腈作为洗脱剂，通过改变温度和流速，就会有很好的分离度。不同的硼酸酯化合物对洗脱剂的选择性不同，所以在选择某一溶剂作为洗脱剂时，也可以适当加入其他溶剂，比如二氯甲烷等，可能会有更好的分离效果。
本发明提供的一种硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法，是以非水反相液相色谱法取代原有的水相，采用有机相作为流动相溶液，避免硼酸酯化合物的遇水不稳定性，并且加入不同的有机相溶液作为改性剂，可以改变不同硼酸酯化合物的选择性，从而达到有效分离，具有分离速度快，分离度好，稳定性高等优点。
本发明公开了一种基于非水反相液相色谱的分离方法，即以甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃等有机溶剂代替常规水相，采用等度或梯度模式，通过常规C18或石墨化碳色谱柱即可实现对硼酸酯类化合物的有效分离，峰形好，分离度高，快速高效，且化合物分离环境稳定性好。本发明使用的是普通反相液相系统，操作简便，为检测硼酸酯类遇水不稳定药物中间体提供了一种快速高效的分析方法。
附图说明
图1为方法一的ACN/H2O流动相梯度液相色谱分析图(RT3.847min：水解产物，RT8.913min：含硼酸酯化合物)。
图2为方法二的甲醇/乙腈(90/10)流动相等度液相色谱分析图(RT1.780min：水解产物，RT2.667min：含硼酸酯化合物)。
图3为方法三的四氢呋喃/乙腈(10/90)流动相等度液相色谱分析图(RT2.463min：水解产物，RT2.203min：含硼酸酯化合物)。
图4为方法五的二氯甲烷/乙腈(20/80)流动相等度液相色谱分析图(RT4.757min：水解产物，RT4.363min：含硼酸酯化合物)。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所提供一种非水反相色谱检测方法，用于分析和检测硼酸酯类化合物，主要包括由一分子硼酸或取代硼酸与一分子频那醇缩合形成五元环内酯的硼酸频那醇内酯的一些医药中间体；其结构式如式I所示：
这一类含硼酸内酯结构的化合物极易水解，常规反相液相色谱法不适用，化合物在系统体系里与水反应部分水解为硼酸，影响化合物的分离，中控和纯度分析，无法准确定性定量分析。
为此，本发明采用非水反相体系，将液相色谱流动相中的水相替换成有机相，如甲醇、异丙醇，四氢呋喃，二氯甲烷等，采用等度或梯度模式，通过常规C18或石墨化碳色谱柱即可实现对硼酸酯类化合物的有效分离。
具体的分析方法如下：
方法一(常规水相反相液相色谱方法)
采用实验室常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，水等，采用Waters Xbridge C18(150mm*4.6mm,3.5um)色谱柱进行分离分析。
色谱条件如下
试剂：乙腈，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Waters Xbridge C18(150mm*4.6mm,3.5um)
柱温：35℃
流动相：
A相:水
B相:乙腈
梯度程序：
流速：1.0mL/min
检测器波长：UV 220nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：18min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
方法一属于常规的反相液相色谱法，将作为分析对照。
方法二
采用实验室常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，甲醇等，采用WatersXbridge C18(150mm*4.6mm,3.5um)色谱柱进行分离分析。
色谱条件如下
试剂：乙腈，甲醇(色谱纯)，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Waters Xbridge C18(150mm*4.6mm,3.5um)
柱温：35℃
流动相：
A相:甲醇
B相:乙腈
梯度程序：
Time(min) A％ B％
0.00 90 10
10.00 90 10
流速：1.0ml/min
检测器波长：UV220nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：10min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
方法二将水相替换为甲醇，特定的硼酸酯化合物在醇内有较好的稳定性，且这类化合物对醇有较好的选择性，可以实现快速有效分离纯化。
方法三
采用实验室常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，四氢呋喃等，采用Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)色谱柱进行分离分析。
色谱条件如下
试剂：乙腈，四氢呋喃(色谱纯)，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)
柱温：35℃
流动相：
A相:四氢呋喃
B相:乙腈
梯度程序：
Time(min) A％ B％
0.00 10 90
10.00 10 90
流速：1.0ml/min
检测器波长：UV220nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：10min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
方法三将色谱柱改为石墨化碳色谱柱，对强极性化合物有很好的保留及分离度，且对特殊的溶剂有很好的耐受性。采用四氢呋喃作为流动相，对一些弱极性酯有很好的洗脱能力，能够实现快速分离。
方法四
采用实验室常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，四氢呋喃等，采用Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)色谱柱进行分离分析。
色谱条件如下
试剂：乙腈，二氯甲烷，四氢呋喃(色谱纯)，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)
柱温：25℃
流动相：
A相:四氢呋喃
B相:二氯甲烷
梯度程序：
Time(min) A％ B％
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流速：1.0ml/min
检测器波长：UV 230nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：10min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
方法四添加二氯甲烷作为改性剂，可以有效提高硼酸酯和其它杂质如水解的硼酸化合物之间的选择性从而达到分离效果。流动相可以根据化合物的极性选择适当比例。
方法五
采用实验室常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，二氯甲烷等，采用Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)色谱柱进行分离分析。
色谱条件如下
试剂：乙腈，二氯甲烷，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)
柱温：25℃
流动相：
A相:乙腈
B相:二氯甲烷
梯度程序：
Time(min) A％ B％
0.00 80 20
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流速：0.5ml/min
检测器波长：UV 230nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：10min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
方法五在石墨化碳色谱柱的基础上，利用乙腈作为洗脱剂，通过改变温度和流速，就会有很好的分离度。不同的硼酸酯化合物对洗脱剂的选择性不同，所以在选择某一溶剂作为洗脱剂时，也可以适当加入其他溶剂，比如二氯甲烷等，可能会有更好的分离效果。
本发明所提供的非水反相色谱检测方法，可根据流动相选择样品溶剂，根据样品溶解性和选择性选择有机相，根据样品分离度选择等度比例或梯度和流速，根据样品吸收波长和有机相截断波长选择检测器波长，根据样品稳定性选择柱温，根据样品酸碱性选择流动相酸碱体系。
硼酸酯中间体在常规反相液相色谱分析中能实现有效分离，但是有明显水解(如图1)。保留时间8.9min为化合物，保留时间3.8min为水解的硼酸，随着时间和柱温以及流动相水相比例的影响，水解程度有所变化。采用本发明所提供的非水反相色谱检测方法，以甲醇、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈等非水有机相作为流动相，可避免硼酸酯化合物的遇水不稳定性，并且加入不同的有机相溶液作为改性剂，可以改变不同硼酸酯化合物的选择性，采用等度或梯度模式，通过常规C18或石墨化碳色谱柱即可实现对硼酸酯类化合物的有效分离，峰形好，分离度高，快速高效，且化合物分离环境稳定性好(如图2、3、4)。
针对具体的硼酸酯类化合物，可依照上述方法或在上述方法的基础上经常规调整来完成分析。以式II化合物为例：
例1：实验室采用常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，四氢呋喃等，采用Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)色谱柱进行分离分析：
步骤一
采用四氢呋喃乙腈作为流动相，乙腈作为溶剂溶解样品，检测稳定性；
步骤二
试剂：四氢呋喃，乙腈(色谱纯)，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)
柱温：35℃
流动相：
A相:四氢呋喃
B相:乙腈
梯度程序：
Time(min) A％ B％
0.00 10 90
10.00 10 90
流速：1.0ml/min
检测器波长：UV 220nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：10min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
步骤三
根据化合物最大吸收波长和溶剂的截止波长选择仪器的检测波长220nm，适当调整流动相比例(四氢呋喃/乙腈：10/90)和流速(1.0ml/min)及柱温(35℃)，得到合适的分离度(1.55)，将分离产物利用质谱鉴别，确认化合物。从而有效避免水相的存在而使化合物水解，并且方法实现了对化合物的有效分离，准确定性定量，峰形好，分离度高，快速高效，且化合物分离环境稳定性好(如图3)。
步骤四
方法建立完成的基础上可对方法的适用性进一步考察。
例2：实验室采用常规反相液相色谱仪器Thermo U-3000，色谱级溶剂乙腈，四氢呋喃等，采用Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)色谱柱进行分离分析对式II化合物进行优化。
步骤一
采用二氯甲烷，乙腈作为流动相，乙腈作为溶剂溶解样品，检测稳定性。
步骤二
试剂：二氯甲烷，乙腈(色谱纯)，超纯水
仪器：Thermo U-3000
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)
柱温：25℃
流动相：
A相:二氯甲烷
B相:乙腈
梯度程序：
Time(min) A％ B％
0.00 20 80
10.00 20 80
流速：0.5ml/min
检测器波长：UV 230nm
进样体积：5μl
洗针液：乙腈
溶剂1：乙腈
溶剂2：乙腈/水＝1/1
数据采集时间：10min
配样：样品1，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂1溶解定容，摇匀。
样品2，称取约40mg样品，置于100ml容量瓶中，用溶剂2溶解定容，摇匀。
步骤三
根据化合物最大吸收波长和溶剂的截止波长选择仪器的检测波长230nm，适当调整流动相比例(二氯甲烷/乙腈：20/80)和流速(0.5ml/min)及柱温(25℃)，得到合适的分离度，将分离产物利用质谱鉴别，确认化合物。从而有效避免水相的存在而使化合物水解，并且方法实现了对化合物的有效分离，准确定性定量，峰形好，分离度高，快速高效，且化合物分离环境稳定性好(如图4)。
步骤四
方法建立完成的基础上可对方法的适用性进一步考察。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (16)
1.一种硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法，其特征在于，流动相组分均为有机溶剂，采用等度或梯度模式，采用常规C18或石墨化碳色谱柱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硼酸酯类化合物为硼酸频那醇内酯类化合物，所述硼酸频那醇内酯类化合物为一分子硼酸或取代硼酸与一分子频那醇缩合形成的五元环内酯化合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相组分选自甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述流动相优选为甲醇/乙腈体系，四氢呋喃/乙腈体系，二氯甲烷/乙腈体系、或四氢呋喃/二氯甲烷体系。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱选自Waters Xbridge C18色谱柱、Thermo Hypercarb色谱柱。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的液相色谱条件参数包括流动相比例、流速、柱温，根据化合物具体的结构和理化性质按常规方法进行合理调节和选择。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相为甲醇/乙腈体系，采用等度体积比的甲醇/乙腈＝90/10。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相为四氢呋喃/乙腈体系，采用等度体积比的四氢呋喃/乙腈＝10/90。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相为二氯甲烷/乙腈体系，采用等度体积比的二氯甲烷/乙腈＝20/80。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相为四氢呋喃/二氯甲烷体系，采用等度体积比的四氢呋喃/二氯甲烷＝50/50。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液相色谱的流速为0.5-1.0ml/min。
12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的柱温为25-40℃。
13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，具体色谱条件如下：
色谱柱：Waters Xbridge C18(150mm*4.6mm,3.5um)；柱温：35℃；流动相：A相为甲醇，B相为乙腈；梯度程序：0min，A相90％，B相10％；10min，A相90％，B相10％；流速：1.0ml/min；检测器波长：UV 220nm；进样体积：5μl。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，具体色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)；柱温：35℃；流动相：A相为四氢呋喃；B相为乙腈；梯度程序：0min，A相10％，B相90％；10min，A相10％，B相90％；流速：1.0ml/min；检测器波长：UV 220nm；进样体积：5μl。
15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，具体色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)；柱温：25℃；流动相：A相为四氢呋喃；B相为二氯甲烷；梯度程序：0min，A相50％，B相50％；10min，A相50％，B相50％；流速：1.0ml/min；检测器波长：UV 230nm；进样体积：5μl。
16.如权利要求6所述的方法，其特征在于，具体色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypercarb(150mm*4.6mm,5.0um)；柱温：25℃；流动相：A相为乙腈；B相为二氯甲烷；梯度程序：0min，A相80％，B相20％；10min，A相80％，B相20％；流速：0.5ml/min；检测器波长：UV 230nm；进样体积：5μl。
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|---|---|---|---|---|
| CN110038249A (zh) * | 2019-04-24 | 2019-07-23 | 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所 | 一种促进除草剂降解的方法 |
| CN115436556A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-06 | 常州佳德医药科技有限公司 | 一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用 |
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|---|
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