CN108130322A - 抑制大肠杆菌的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制大肠杆菌的方法及其应用,所述方法包括在大肠杆菌生长过程中,用光照射大肠杆菌的步骤,其中,所述光为蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种。本发明在大肠杆菌生长过程中,应用蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种照射大肠杆菌,即可实现对大肠杆菌的抑制效果,该方法无辐射污染风险、成本低廉、操作简单、无二次污染,具有较高的推广应用价值,特别适合在需要抑制大肠杆菌的场合(如食品保存)中用于抑制大肠杆菌的生长。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌抑制方法,具体地,涉及一种抑制大肠杆菌的方法及其应用。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周生鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,几乎占粪便干重的1/3。虽然绝大多数大肠杆菌与人类有着良好合作,但是有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力,一旦感染,将造成严重疫情,如肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC),肠出血性大肠杆菌(EHEC),肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.coli,EPEC)等。人体感染EHEC后,会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻,同时伴有发热、呕吐等表现,多为EHEC产生的毒素所致。某些严重感染者毒素随血行播散造成溶血性贫血,红细胞、血小板减少;肾脏受到波及,发生急性肾功能衰竭甚至死亡。典型代表是EHEC家族中代号为O157:H7的大肠杆菌,感染后主要症状是出血性腹泻,严重者可伴发溶血尿毒综合征(HUS),危及生命。可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物(特别是免洗牛肉、汉堡扒及烤牛肉)而感染,饮用或进食未经消毒的奶类、芝士、果汁及乳酪而染病的个案亦有发现,已报道的引发疫情的蔬菜类食品包括:黄瓜、西红柿、包括绿豆芽、鹰嘴豆芽、萝卜芽、小红萝卜芽在内的芽苗菜等。O104也是一种EHEC,感染症状类似O157:H7,且毒力更为猛烈,O104由于可产生分解抗生素的酶,故治疗更为棘手,一旦采取抗生素治疗,反倒会引起细菌产生更多的志贺样毒素(SLT),加重病情。因此,寻找合适的手段预防此类病菌显得尤为重要。常用的大肠杆菌控制技术主要包括合成药物,从植物等天然资源中提取的化合物,合成的抑菌材料,生物防治技术、物理防治技术,具体如下:
化学合成药物的方法(师莹莹,侯桂琴,赵琦,王洋,任彦丹,张梦影,鲁照明.新合成季铵盐单体化合物的体外抗菌和体内抗炎活性[J].郑州大学学报(医学版),2017,52(06):681-685.),其效果明显,杀菌快速,但是毒性大,易产生耐药性。
从植物或其它天然资源中提取的化学物质(刘秀丽.植物缩合单宁对大肠杆菌的抑制作用及抑菌机理的研究[D].内蒙古农业大学,2013;陶文卿.10-HDA对大肠杆菌抑制机理的研究[D].山东轻工业学院,2012),具有较好抑菌效果,但生产成本高,规模化困难。
合成的抑菌材料(张毅,刘叶,张昊,张转玲.氨基酸改性壳聚糖抗菌材料制备及其性能研究[J].功能材料,2017,48(11):11026-11031.曹雪玲,陆书来,张东杰,刘发现.纳米银作为抗菌剂的抗菌性能研究[J].吉林化工学院学报2017,34(11):30-33.),具有一定的抑菌效果,但生产成本高。
利用生物方法抑制大肠杆菌,如微生物抑制大肠杆菌的研究也有文献报告(黄沧海,谯仕彦,李德发,何高奇,李雪峰.益生乳酸杆菌抑制大肠杆菌的研究[J].中国畜牧杂志,2003,39(06):27-28),但是其过程复杂,成本较高。
利用生物体自身免疫系统提高抗菌能力(张保平,李娜,高惠林,王前光;抗豪猪大肠埃希菌卵黄抗体的制备及抑菌性研究[J].浙江农业科学,2017,58(03):484-488.),同样存在过程复杂,成本较高的问题。
因此,如何提供一种无辐射污染风险、成本低廉、操作简单的抑制大肠杆菌的方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制大肠杆菌的方法及其应用,该方法无辐射污染风险、成本低廉、操作简单、无二次污染,具有较高的推广应用价值,特别适合在食品及其他需要抑制大肠杆菌的场合中对大肠杆菌的生长进行抑制。
为了实现上述目的,本发明提供了一种抑制大肠杆菌的方法,所述方法包括在大肠杆菌生长过程中,用光照射大肠杆菌的步骤,其中,所述光为蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种。
本发明还提供一种如前文所述的抑制大肠杆菌的方法在需要抑制大肠杆菌的场合中的应用。
通过上述技术方案,本发明在大肠杆菌生长过程中,应用蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种照射大肠杆菌,即可实现对大肠杆菌的抑制效果,该方法无辐射污染风险、成本低廉、操作简单、无二次污染,具有较高的推广应用价值,特别适合在食品及其他需要抑制大肠杆菌的场合中对大肠杆菌的生长进行抑制。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是本发明实施例中应用的蓝LED灯的光谱曲线;
图2是本发明实施例中应用的绿LED灯的光谱曲线;
图3是本发明实施例中应用的红LED灯的光谱曲线;
图4是本发明实施例中应用的黄LED灯的光谱曲线;
图5是本发明检测例1中分析的菌落的生长情况。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种抑制大肠杆菌的方法,所述方法包括在大肠杆菌生长过程中,用光照射大肠杆菌的步骤,其中,所述光为蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种。
通过上述技术方案,本发明在大肠杆菌生长过程中,应用蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种照射大肠杆菌,即可实现对大肠杆菌的抑制效果,该方法无辐射污染风险、成本低廉、操作简单,具有较高的推广应用价值。
在上述技术方案中,大肠杆菌的生长基体可以为食品或食品原料,墙面、桌面以及活动场所,也可以是在其他需要抑制该大肠杆菌生长的基体,生长基体的改变不会影响本发明的技术效果。在后文的实施例中,以培养基进行说明。
在后文的实施例中,使用的培养基为LB培养基,所述培养基的配方为:LB液体培养基:10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物,10g NaCl。按液体培养基配方称取上述物质,加去离子水900ml,震荡至溶质完全溶解后,用5mol/L NaOH调pH至7.0。用去离子水定容至1L。121℃高压蒸汽灭菌20min。取100mL液体培养基,备用。取出4℃冰箱保存的大肠杆菌株接种于LB液体培养基中,扩大培养24h。
配制LB固体培养基:10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物,10g NaCl,15g琼脂粉,按固体培养基配方称取上述物质,加去离子水900ml,在加热器上加热至琼脂完全溶解后,用5mol/L NaOH调pH至7.0。用去离子水定容至1L。121℃高压蒸汽灭菌20min。约55℃时,趁热分装,一般15ml倒1个平板。培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照10-15分钟。保存:用封口胶封边,并倒置放于4℃保存,备用。
将扩大培养后的菌液1毫升,加入到9毫升的无菌水中,稀释10倍,再取1毫升稀释过的菌液加入9毫升无菌水中,以这样的方式稀释到10的7次方倍,再取稀释了7次的菌液0.1毫升,稀释涂布到配制好的LB固体培养基中培养。即在大肠杆菌生长过程中,用光照射大肠杆菌。
在本发明中,所述蓝光的光照强度可以在宽的范围内选择,但是为了使大肠杆菌能够更好地被抑制,优选地,所述蓝光的光照强度为750-1550lx。
其中,为了进一步地提高抑制效果,更优选地,所述蓝光的光照强度为1000-1550lx。
在本发明中,所述绿光的光照强度可以在宽的范围内选择,但是为了使大肠杆菌能够更好地被抑制,优选地,所述绿光的光照强度为3000-6680lx。
其中,为了进一步地提高抑制效果,更优选地,所述绿光的光照强度为5000-6680lx。
在本发明中,所述红光的光照强度可以在宽的范围内选择,但是为了使大肠杆菌能够更好地被抑制,优选地,所述红光的光照强度为900-1950lx。
其中,为了进一步地提高抑制效果,更优选地,所述红光的光照强度为1500-1950lx。
在本发明中,所述黄光的光照强度可以在宽的范围内选择,但是为了使大肠杆菌能够更好地被抑制,优选地,所述黄光的光照强度为7500-15300lx。
其中,为了进一步地提高抑制效果,更优选地,所述黄光的光照强度为12000-15300lx。
在本发明一种更优选的实施方式中,为了进一步地提高大肠杆菌的抑制效果,所述光的辐射照度(Ee)为12-48W/m2。
在上述技术方案中,光照时间可在较宽范围内进行调整,为了提高大肠杆菌的抑制效果,优选地,光照时间不小于2h。
为了节约成本并提高工作效率,更优选地,光照时间为24-60h。
在上述技术方案中,光照温度可在较宽范围内进行调整,为了提高大肠杆菌的抑制效果,优选地,光照温度为5-40℃。
在上述技术方案中,对于光照强度的选择,可根据设备情况进行调节或设定。对于所述光的光照强度可选择特定具有调节光强的设备,再选择对应的光照强度,对于未知光强的设备,为了设定上述技术方案的光照强度,优选地,所述方法还包括对光进行光谱分析,筛选所述光的光照强度的步骤。
在上述技术方案中,光源可在较宽范围内进行选择,为了节约设备成本,优选地,所述光通过LED光源提供。
本发明还提供一种如前文所述的抑制大肠杆菌的方法在需要抑制大肠杆菌的场合中的应用。
通过上述技术方案,本发明在大肠杆菌生长过程中,应用蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种照射大肠杆菌,即可实现对大肠杆菌的抑制效果,该方法无辐射污染风险、成本低廉、操作简单、无二次污染,具有较高的推广应用价值,特别适合在在食品及其它需要抑制大肠杆菌的场合中对大肠杆菌的生长进行抑制。
不仅如此,本发明提供的如前文所述的抑制大肠杆菌的方法特别适合在食品中对大肠杆菌进行抑制。该方法无辐射污染风险、成本低廉、操作简单、无二次污染,具有较高的推广应用价值。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中,蓝LED灯、绿LED灯、红LED灯、黄LED灯均购自绿米科技公司,型号为30cm*30cm面板灯,其他为常规市售品。
1、光照强度的分析
光谱分析蓝LED灯、绿LED灯、红LED灯、黄LED灯发出的对应光,结果分别对应图1、图2、图3、图4所示,可见,选择的上述LED灯能够满足本发明的技术要求。
实施例1
第一步:配制LB液体培养基:10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物,10g NaCl。按液体培养基配方称取上述物质,加去离子水900ml,震荡至溶质完全溶解后,用5mol/L NaOH调pH至7.0。用去离子水定容至1L。121℃高压蒸汽灭菌20min。取100mL液体培养基,备用。
第二步:取出4℃冰箱保存的大肠杆菌株接种于LB液体培养基中,扩大培养24h。
第三步:配制LB固体培养基:10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物,10g NaCl,15g琼脂粉,按固体培养基配方称取上述物质,加去离子水900ml,在加热器上加热至琼脂完全溶解后,用5mol/L NaOH调pH至7.0。用去离子水定容至1L。121℃高压蒸汽灭菌20min。约55℃时,趁热分装,一般15ml倒1个平板。培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照10-15分钟。保存:用封口胶封边,并倒置放于4℃保存,备用。
第四步:将第二步中扩大培养后的菌液1毫升,加入到9毫升的无菌水中,稀释10倍,再取1毫升稀释过的菌液加入9毫升无菌水中,以这样的方式稀释到10的7次方倍,再取稀释了7次的菌液0.1毫升,稀释涂布到配制好的LB固体培养基中培养。
第五步:将接种大肠杆菌LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将蓝LED灯的蓝光调至光照强度1504lx,于37℃照射24小时,此时辐射照度为辐射照度为46W/m2。
实施例2
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将蓝LED灯的蓝光调至光照强度750lx,于40℃照射60小时。
实施例3
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将蓝LED灯的蓝光调至光照强度1550lx,于5℃照射2小时。
实施例4
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将绿LED灯的绿光调至光照强度6676lx,于37℃照射24小时,此时辐射照度为辐射照度为13.9W/m2。
实施例5
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将绿LED灯的绿光调至光照强度3000lx,于40℃照射60小时。
实施例6
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将绿LED灯的绿光调至光照强度6680lx,于5℃照射2小时。
实施例7
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将红LED灯的红光调至光照强度1921lx,于37℃照射24小时,此时辐射照度为辐射照度为17.4W/m2。
实施例8
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将红LED灯的红光调至光照强度900lx,于40℃照射60小时。
实施例9
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将红LED灯的红光调至光照强度1950lx,于5℃照射2小时。
实施例10
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将黄LED灯的黄光调至光照强度15281lx,于37℃照射24小时,此时辐射照度为辐射照度为34.6W/m2。
实施例11
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将黄LED灯的黄光调至光照强度7500lx,于40℃照射60小时。
实施例12
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:将接种大肠杆菌菌株的LB固体培养基置于智能培养箱内培养,将黄LED灯的黄光调至光照强度15300lx,于5℃照射2小时。
对比例1
按照实施例1的方法实施第一步至第四步,不同的是,第五步如此实施:在自然光条件下于智能培养箱内37℃培养24小时。
检测例1
观察实施例1-12以及对比例1中菌落的生长情况,发现,实施例1-实施例12中对应的绿光、红光、黄光、蓝光照射的培养基中菌落与对比例1相比,菌落的生长均受到抑制,并且,随着光照时间的延长,光照强度的增大,菌落生长被抑制情况越明显。
结果如图5所示,图中B对应实施例1,Y对应实施例10、G对应实施例4、R对应实施例7,CK对应对比例1。由图5可见,对比例1中的菌落生长良好,菌落面积大。绿光、红光、黄光、蓝光组与CK组相比,菌落的生长均有被明显的抑制,其中抑菌能力有强到弱为:蓝光>黄光>绿光>红光。
检测例2
用平板计数法确定每组的菌落数,用SPSS13.0软件分析显著性差异。发现实施例1-12中的菌落萌发数与对比例1相比,均有不同程度减少,经SPSS分析,实施例1-12中的菌落萌发数与对比例1相比,均明显减少,具有显著差异。并且,随着光照时间的延长,光照强度的增大,菌落生长被抑制情况越明显。
实施例1、实施例4、实施例7和实施例10及对比例1中的结果如表1所示,可见,实施例与对比例之间呈显著性差异。其中,对大肠杆菌的抑制效果有强到弱的顺序为:蓝光>黄光>绿光>红光。其中,实施例1中蓝光组的菌落数约为对比例1中的1/2000,实施例10黄光组约为1/10,实施例4绿光组为1/10,实施例7红光组约为对比例1中的1/4。除黄组与绿组外,其他处理组间亦呈极显著性差异。
表1
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种抑制大肠杆菌的方法,其特征在于,所述方法包括在大肠杆菌生长过程中,用光照射大肠杆菌的步骤,其中,所述光为蓝光、绿光、红光和黄光中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述蓝光的光照强度为750-1550lx;优选地,所述蓝光的光照强度为1000-1550lx。
3.根据权利要求1所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述绿光的光照强度为3000-6680lx;优选地,所述绿光的光照强度为5000-6680lx。
4.根据权利要求1所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述红光的光照强度为900-1950lx;优选地,所述红光的光照强度为1500-1950lx。
5.根据权利要求1所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述黄光的光照强度为7500-15300lx;优选地,所述黄光的光照强度为12000-15300lx。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述光的辐射照度(Ee)为12-48W/m2。
7.根据权利要求6所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,光照时间不小于2h;和/或,
光照温度为5-40℃。
8.根据权利要求1所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述方法还包括对光进行光谱分析,筛选所述光的光照强度的步骤。
9.根据权利要求1所述的抑制大肠杆菌的方法,其中,所述光通过LED光源提供。
10.一种如权利要求1-9中任意一项所述的抑制大肠杆菌的方法在需要抑制大肠杆菌的场合中的应用。
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Legal Events
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180608 |
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