CN108120706B - 一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法 - Google Patents

一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108120706B
CN108120706B CN201810003851.XA CN201810003851A CN108120706B CN 108120706 B CN108120706 B CN 108120706B CN 201810003851 A CN201810003851 A CN 201810003851A CN 108120706 B CN108120706 B CN 108120706B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silver nanoparticles
cell
cells
mrna
hyaluronic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810003851.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108120706A (zh
Inventor
田永峰
张玉丰
杨柳
段沅杏
赵伟
赵杨
朱东来
汤建国
张霞
韩熠
巩效伟
洪鎏
李寿波
王程娅
李廷华
袁大林
王汝�
曾旭
孙志勇
陈永宽
缪明明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Original Assignee
China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd filed Critical China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority to CN201810003851.XA priority Critical patent/CN108120706B/zh
Publication of CN108120706A publication Critical patent/CN108120706A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108120706B publication Critical patent/CN108120706B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法，包括如下步骤：A、将银纳米粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的银纳米粒子，即为所述细胞无损型银纳米粒子；B、使待测细胞摄入所述细胞无损型银纳米粒子；摄入后该细胞无损型银纳米粒子以催化发夹组装方法与mRNA结合并进而通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA‑DNA，其可发荧光；然后，C、向包含受试细胞的样品溶液中加入上述细胞无损型银纳米粒子并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。

Description

一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的 方法
技术领域
本发明属于生物检测方法领域。
背景技术
人们抽吸烟草制品发出的烟雾时，呼吸道细胞会因直接暴露于烟气而受到不同程度的损伤。烟草企业一直在努力对烟草进行减害化处理以便减少这种损伤。已经开发出了各种减害化方法，为了评价减害效果的优劣，需要有一种评价烟气暴露对细胞损伤的方法，最好是定量化方法。
传统方法是取人体呼吸道细胞(例如人肺泡II型上皮细胞系A549细胞)使之暴露于烟气，通过检测烟气暴露后凋亡细胞的数量，来评价烟气暴露对细胞的损伤程度。该方法中需要使用荧光染色剂对细胞DNA进行染色，进而对活体细胞数量进行分析。但荧光染色剂会破坏细胞的活性并导致细胞内毒素的产生，这就可能对电子烟烟雾细胞暴露的结果进行干扰，影响了评价结果的准确性。
为此，需要提出更好的评价烟气暴露对细胞损伤的方法。
发明内容
本发明提供了一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法，包括如下步骤：
A、将银纳米粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的银纳米粒子，即为所述细胞无损型银纳米粒子；
B、使待测细胞摄入所述细胞无损型银纳米粒子；摄入后该细胞无损型银纳米粒子以催化发夹组装方法与mRNA结合，结合有该细胞无损型银纳米粒子的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，形成可在外界光辐射作用下发荧光的细胞；
C、向包含受试细胞的样品溶液中加入上述细胞无损型银纳米粒子并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别在光辐射下测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定烟气暴露前后的细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。
各步骤具体如下：
A、细胞无损型银纳米粒子的制备
本发明选用银纳米粒子作为载体与高分子材料进行结合制备无损细胞的银纳米粒子复合物，纳米银颗粒具有典型的纳米材料特性，即较大的比表面积，表面布满阶梯状结构，这种结构具有高表面能的不安定原子，即有许多不饱和化学键，这提供了较多的吸附位点与作用位点，极易同外来分子通过化学键结合。同时银纳米粒子本身具有荧光介质的属性可在基因检测中提供荧光，避免使用化学荧光剂带来的细胞毒性，使用本发明可以实现细胞目标基因的无损检测。
使用原位合成法，通过三维复合搅拌技术将透明质酸水凝胶高分子网络体系与纳米银粒子充分均匀混合，制备成纳米银粒子透明质酸复合物，并形成稳定的配位化合物。
具体合成步骤如下：在室温光催化条件下，使用纳米银颗粒与透明质酸水凝胶进行三维混合搅拌，混合搅拌速度90转/分钟。使用扫描电镜表征透明质酸水凝胶与银纳米颗粒的结合程度。待纳米银颗粒在透明质酸水凝胶中达到均匀分散即可停止搅拌。得到均匀稳定的纳米银/透明质酸水凝胶复合物后对其进行冷冻干燥处理，最终得到纳米银/透明质酸复合物颗粒，见图1。
B、细胞无损型银纳米粒子与RNA的组装
将制备好的银纳米透明质酸复合物颗粒使用催化发夹组装(CHA，一种无需酶催化的扩增方法)的方法与DNA结合制备成为纳米分析平台。具体实施过程中纳米银透明质酸颗粒使用催化发夹组装方法与mRNA结合。带有银纳米颗粒透明质酸复合物的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA。
银纳米透明质酸复合物颗粒的作用是光照介质。该纳米平台不仅可以增加灵敏性还可以使mRNA在细胞中特异成像。本发明的银纳米透明质酸复合物颗粒与mRNA存活素的区别是存活素在不同细胞中有不同的效率，而银纳米透明质酸复合物颗粒靠光辐射能提供高效的光照介质。该银纳米透明质酸复合物颗粒的使用是灵敏度高和特异性好的细胞内成像介质。
C、荧光强度检测
向包含受试细胞的样品溶液中加入上述细胞无损型银纳米粒子并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别在光辐射下测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定烟气暴露前后的细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。
本发明的有益效果：
1、本发明使用透明质酸水凝胶包裹银纳米粒子，使得其被细胞摄入后，不会杀灭细胞，而是能稳定存在于活体细胞中。如果没有该透明质酸水凝胶包裹，则银纳米粒子会因其强杀菌性而杀死待测细胞。
2、避免了有细胞毒性的常规荧光染色剂的使用，使得测定结果更准确。
附图说明
图1是本发明中制备的表面包覆有透明质酸水凝胶的银纳米粒子的扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1
首先，通过如下方式制备表面包覆有透明质酸的银纳米粒子。
在室温和光催化条件下，使用长度约为50-70nm直径约为8-12nm的棒状纳米银颗粒与透明质酸水凝胶进行混合搅拌，混合搅拌速度90转/分钟。使用扫描电镜表征透明质酸水凝胶与银纳米颗粒的结合程度。待纳米银颗粒在透明质酸水凝胶中达到均匀分散即可停止搅拌。得到均匀稳定的纳米银/透明质酸水凝胶复合物后对其进行冷冻干燥处理，最终得到纳米银/透明质酸复合物颗粒，见图1。
然后，采用Coresta抽吸模式，用剑桥滤片捕集新型烟草制品受热后产生的烟气，然后用溶剂浸泡剑桥滤片将捕集到的烟气转移到溶液中，作为待测溶液。取人肺泡II型上皮细胞系A549细胞作为受试细胞。
将含有上述细胞的培养液均分为两份，一份直接加入本发明的纳米银/透明质酸复合物颗粒，本发明的纳米银/透明质酸复合物颗粒能够与活体细胞中的mRNA结合，进而结合有纳米银/透明质酸复合物颗粒的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，结合有纳米银/透明质酸复合物颗粒的mRNA-DNA在氩离子激光器发出激光照射下能发出金属粒子外层电子发生跃迁发出荧光，充分反应后，测定其初始荧光强度。
另一份则向细胞培养液中加入上述含有烟气捕集物的待测溶液，并在适合细胞存活的温度下静置足够长时间后，再加入本发明的纳米银/透明质酸复合物颗粒，由于本发明的纳米银/透明质酸复合物颗粒能够与活体细胞中的mRNA结合，进而结合有纳米银/透明质酸复合物颗粒的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，而死去的细胞则不会发生上述结合过程，故通过检测荧光强度并与初始荧光强度相比较，就能够方便快捷地检测存活的细胞比例。以此存活细胞的比例，来评价烟气捕集物的细胞毒性。
对比例1
使用同样的银纳米粒子，但未经透明质酸包裹，结果发现，向受试细胞中加入银纳米粒子后，由于银纳米粒子强大的杀菌作用，受试细胞全部被杀死，无法进行后续实验。

Claims (1)

1.一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、将银纳米粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的银纳米粒子，即为所述细胞无损型银纳米粒子；银纳米粒子本身具有荧光介质的属性，在基因检测中提供荧光；所述银纳米粒子为棒状纳米粒子，其长度为50-70nm，其直径为8-12nm；
B、将含有受试细胞的培养液均分为两份，一份直接加入所述细胞无损型银纳米粒子，所述细胞无损型银纳米粒子能够与活体细胞中的 mRNA结合，进而结合有所述细胞无损型银纳米粒子的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，结合有所述细胞无损型银纳米粒子的 mRNA-DNA在氩离子激光器发出激光的照射下能发生银纳米粒子外层电子跃迁，从而发出荧光；充分反应后，测定的荧光强度记为初始荧光强度；
C、向另一份含有受试细胞的培养液中加入含有烟气捕集物的待测溶液，并在适合细胞存活的温度下静置足够长时间后，再加入所述细胞无损型银纳米粒子，由于所述细胞无损型银纳米粒子能够与活体细胞中的mRNA结合，进而结合有所述细胞无损型银纳米粒子的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，而死去的细胞则不会发生上述过程；检测荧光强度并与初始荧光强度相比较，从而检测存活细胞的比例，并根据存活细胞的比例来评价烟气捕集物的细胞毒性。
CN201810003851.XA 2018-01-03 2018-01-03 一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法 Active CN108120706B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810003851.XA CN108120706B (zh) 2018-01-03 2018-01-03 一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810003851.XA CN108120706B (zh) 2018-01-03 2018-01-03 一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108120706A CN108120706A (zh) 2018-06-05
CN108120706B true CN108120706B (zh) 2020-07-21

Family

ID=62232604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810003851.XA Active CN108120706B (zh) 2018-01-03 2018-01-03 一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108120706B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104931473A (zh) * 2015-06-16 2015-09-23 云南中烟工业有限责任公司 一种测定可溶性重金属致细胞dna损伤的评价方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104931473A (zh) * 2015-06-16 2015-09-23 云南中烟工业有限责任公司 一种测定可溶性重金属致细胞dna损伤的评价方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Induction of apoptosis with tobacco smoke and related products in A549 lung epithelial cells in vitro;Lindsay Ramage et al.;《Journal of Inflammation》;20060321;第3卷;1-5 *
Intracellular Messenger RNA Triggered Catalytic Hairpin Assembly for Fluorescence Imaging Guided Photothermal Therapy;Feng-Xia Su et al.;《Anal. Chem.》;20170629;第89卷(第14期);7277-7279 *
用于肿瘤诊断治疗的透明质酸基多功能纳米粒子的研究;李棒棒;《万方学位论文数据库》;20171207;22-23、33-34、42-46 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108120706A (zh) 2018-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yu et al. Gold-nanorod-coated capillaries for the SERS-based detection of thiram
Knauer et al. Surface-enhanced Raman scattering-based label-free microarray readout for the detection of microorganisms
Liu et al. Anodic electrochemiluminescence of graphitic-phase C3N4 nanosheets for sensitive biosensing
Zhang et al. Redox and catalysis ‘all-in-one’infinite coordination polymer for electrochemical immunosensor of tumor markers
US20120115245A1 (en) Assaying substrate with surface-enhanced raman scattering activity
Shahrokhian et al. Construction of an electrochemical sensor based on the electrodeposition of Au–Pt nanoparticles mixtures on multi-walled carbon nanotubes film for voltammetric determination of cefotaxime
Zhang et al. An enzyme-assisted electrochemiluminescent biosensor developed on order mesoporous carbons substrate for ultrasensitive glyphosate sensing
Wen et al. Plasmonic Au nanostar Raman probes coupling with highly ordered TiO2/Au nanotube arrays as the reliable SERS sensing platform for chronic myeloid leukemia drug evaluation
Zimbone et al. Dynamic light scattering on bioconjugated laser generated gold nanoparticles
Chen et al. PtNi nanocubes-catalyzed tyramine signal amplification electrochemiluminescence sensor for nonenzymatic and ultrasensitive detection of hepatocellular carcinoma cells
Curulli et al. Chitosan stabilized gold nanoparticle‐modified Au electrodes for the determination of polyphenol index in wines: A preliminary study
Fazlali et al. Electrochemiluminescent biosensor for ultrasensitive detection of lymphoma at the early stage using CD20 markers as B cell-specific antigens
Puente et al. Silver-chitosan and gold-chitosan substrates for surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS): Effect of nanoparticle morphology on SERS performance
Hasenöhrl et al. Bulbous gold–carbon nanodot hybrid nanoclusters for cancer therapy
CN108120705B (zh) 一种使用透明质酸包裹的金纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法
CN111024624B (zh) 基于暗场散射成像的parp-1单粒子检测方法
Wang et al. A competitive-type electrochemical immunosensor based on Ce-MOF@ Au and MB-Au@ Pt core–shell for nitrofuran metabolites residues detection
CN108120706B (zh) 一种使用细胞无损型银纳米粒子评价烟气暴露对细胞损伤的方法
Yue et al. One-step synthesis of green fluorescent carbon dots for Chloride detecting and for bioimaging
CN108220382B (zh) 一种使用钯纳米复合物评价烟气暴露对细胞损伤的方法
Ullah et al. A Novel Fluorescent Aptasensor Based on Mesoporous Silica Nanoparticles for Selective and Sensitive Detection of Saxitoxin in Shellfish
Parihar et al. Yttrium Functionalized Reduced Graphene Oxide Nanocomposite-Based Aptasensor for Ultrasensitive Detection of a Breast Cancer Biomarker
Xu et al. Highly sensitive detection of thiram residues on fruit peel surfaces using a filter paper-based SERS sensor with AgNWs@ ZIF-8
Yuan et al. Self-enhanced Electrochemiluminescence Luminophore Based on Pd Nanocluster-Anchored Metal Organic Frameworks via Ion Annihilation for Sensitive Cell Assay of Human Lung Cancer
Farshchi et al. Optimization of a silver-nanoprism conjugated with 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine towards easy-to-make colorimetric analysis of acetaldehyde: a new platform towards rapid analysis of carcinogenic agents and environmental technology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant