CN108103141A - 细菌耐药性变化的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细菌耐药性变化的检测方法，涉及微生物技术领域，本发明提供的细菌耐药性变化的检测方法，利用微流控技术生成含有细菌的微液滴，将不同浓度的抗生素加入微液滴中共培养，通过检测微液滴菌群的细菌动力学变化，得到细菌耐药性变化，其中，细菌包括合作者和欺骗者。该方法利用合成生物学技术构建二元微生态体系，能够简化程序性死亡体系，使检测结果更直观、更准确。产生大量不同合作者和欺骗者组合的细菌的微液滴，使细菌密度可控，且离散性好，能够单独观测细菌中的合作者或欺骗者，测得的结果误差小，能够更直观、更准确地检测微液滴菌群的细菌动力学变化，得到的细菌耐药性的变化检测结果也更加准确。

Description

细菌耐药性变化的检测方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种细菌耐药性变化的检测方法。
背景技术
细菌的程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)是导致群落耐药性产生的重要原因之一。PCD是指部分细菌通过自杀性的死亡来维持整个菌群的生存，部分细菌程序性死亡后以及死亡过程中，会释放某种公用产物(Public goods)来抵消不良环境影响，从而保护整体菌群。不同类型的菌群结构在自然系统中普遍存在。细菌种类、数目、丰度以及菌群间相互作用组成了复杂的菌落结构，这些结构中不仅有个体细胞的生理活动，还存在着细菌细胞间的协调与沟通，实现了很多单细胞所不具备的群落功能。
菌落结构对细菌耐药性的产生具有重要影响。自然界中，生物膜的形成通常是从游离态的单细菌或者微小的亚群菌落开始，在物理表面进行定殖后，随着细菌的分裂增殖，会同时分泌大量大分子多聚物形成一层保护膜(生物膜)。膜内菌落分布具有特殊的空间结构，能产生很强的屏障作用，并且可以加强群落内细菌的交流。在进行抗生素处理时，位于生物膜外部边缘的菌落会先进行死亡，并释放出大量的细胞内含物，进一步抵御抗生素分子扩散到内部，从而增强了内部菌落和整体菌群的生存概率。
目前的耐药性研究主要集中在应用菌落或者菌液监测细菌的耐药性变化。然而，菌落和菌群在自然环境下生长，密度难以控制，离散性较差，并且多为单独的微生态体系，不能区分出生物膜外部的边缘菌落和位于生物膜内部的内部菌落。
因此，开发一种便于控制细菌密度、离散性好，能区分出生物膜外部的边缘菌落和位于生物膜内部的内部菌落的二元微生态体系，用以检测细菌耐药性变化的方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌耐药性变化的检测方法，以缓解现有技术中存在的应用菌落或者菌液检测细菌的耐药性变化时，密度难以控制，离散性较差，并且多为单独的微生态体系，不能区分出生物膜外部的边缘菌落和位于生物膜内部的内部菌落的技术问题。
本发明提供了一种细菌耐药性变化的检测方法，所述检测方法包括：
利用微流控技术生成含有细菌的微液滴，将不同浓度的抗生素加入所述微液滴中共培养后，检测微液滴菌群的细菌动力学变化，得到所述细菌耐药性变化；
其中，所述细菌包括合作者和欺骗者。
进一步地，所述微液滴中细菌的密度为200-500个/微液滴。
进一步地，所述合作者与所述欺骗者的数量比为1:9-9:1。
进一步地，所述抗生素为青霉素类抗生素；
优选地，所述抗生素为6-氨基青霉烷酸；
优选地，所述6-氨基青霉烷酸的浓度为50-500μg/ml；
优选地，所述6-氨基青霉烷酸的浓度为100-400μg/ml；
更优选地，所述6-氨基青霉烷酸的浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml或400μg/ml。
进一步地，在向所述微液滴中加入不同浓度的抗生素的同时加入不同浓度的诱发剂。
进一步地，所述诱发剂为糖类、苷类或氨基酸；
优选地，所述诱发剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-2mM；
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-1mM；
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1mM、0.3mM、0.7mM或1mM。
进一步地，从加入抗生素开始检测所述微液滴菌群的细菌动力学变化至细菌进入稳定期。
进一步地，所述合作者和所述欺骗者均带有荧光标记。
进一步地，所述细菌动力学变化包括细菌的生长速率、死亡速率及所述合作者和欺骗者的荧光强度变化。
进一步地，所述微液滴的数量为50-150万个。
本发明提供的细菌耐药性变化的检测方法，利用微流控技术生成含有细菌的微液滴，将不同浓度的抗生素分别加入微液滴中共培养，通过检测微液滴菌群的细菌动力学变化，得到细菌耐药性变化，其中，细菌包括合作者和欺骗者。该方法利用合成生物学技术构建二元微生态体系，即其中一种为合作者，另一种为欺骗者，能够简化程序性死亡体系，使检测结果更直观、更准确。同时，使用微液滴技术产生大量不同合作者和欺骗者组合的细菌的微液滴，使细菌密度可控，且离散性好，能够单独观测细菌中的合作者或欺骗者，测得的结果误差小，能够更直观、更准确地检测微液滴菌群的细菌动力学变化，从而使得到的细菌耐药性的变化检测结果也更加准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的100μg/ml的6APA处理不同数量比的合作者和欺骗者后，细菌密度的结果图；
图2为本发明实施例1提供的100μg/ml的6APA处理不同数量比的合作者和欺骗者后，不同时间点细菌绿色荧光强度占总细菌比例的结果图；
图3为本发明实施例2提供的400μg/ml的6APA处理不同数量比的合作者和欺骗者后，细菌密度的结果图；
图4为本发明实施例2提供的400μg/ml的6APA处理不同数量比的合作者和欺骗者后，不同时间点细菌绿色荧光强度占总细菌比例的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据统计，人类细菌性感染都与细菌耐药性有关，而细菌耐药性有65％都与生物膜形成有关。自然界中，游离态的单细菌或者微小的亚群菌落在物理表面进行定殖后，随着细菌的分裂增殖，会分泌大量大分子多聚物形成一层保护膜，即生物膜。由于细菌处于生物膜状态，在进行抗生素处理时，位于生物膜外部边缘的菌落会先进行死亡，并释放出大量的细胞内含物，进一步抵御抗生素分子扩散到生物膜内部，从而增强了内部菌落和整体菌群的生存概率。因此，带有生物膜的菌落结构对细菌耐药性的产生具有重要影响。
本发明提供了一种细菌耐药性变化的检测方法，包括：
利用微流控技术生成含有细菌的微液滴，将不同浓度的抗生素加入微液滴中共培养后，检测微液滴菌群的细菌动力学变化，得到细菌耐药性变化；
其中，细菌包括合作者和欺骗者。
典型的合作者可以为位于生物膜外部边缘的菌落，在进行抗生素处理时，合作者会先进行主动死亡，并释放出大量的细胞内含物，所释放的细胞内含物具有抵消不良环境影响的作用，即具有抵消抗生素杀灭细菌的作用，从而进一步抵御抗生素分子扩散到内部；典型的欺骗者可以为位于生物膜内部的菌落，在进行抗生素处理时，欺骗者不会产生细胞内含物，但会利用合作者产生的细胞内含物抵御抗生素对细菌的杀灭作用，从而增强生存概率。
细胞内含物为能够降解抗生素的酶类，例如可以为特异性降解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，但不限于β-内酰胺酶，也可以为降解其他类抗生素的相应的酶或降低环境中压力的其他酶。
利用合成生物学技术构建包含合作者和欺骗者的二元微生态体系，能够简化细菌程序性死亡体系，使细菌的程序化死亡体系仅包括通过主动死亡提供细胞内含物的合作者和利用细胞内含物从而提高生存率的欺骗者，使检测结果更直观、更准确。
抗生素能够阻碍细菌细胞壁的形成，在微液滴中加入抗生素能够形成对细菌而言的不良环境。同时，抗生素作为外源性刺激能够诱导细菌产生降解所加入的抗生素的酶，即刺激合作者产生细胞内含物释放至环境中，供欺骗者利用。
典型的抗生素可以为喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素或氨基糖苷类抗生素本发明利用注射的方法，将抗生素加入微液滴中。
在一个优选的实施方式中，抗生素为青霉素类抗生素。
在一个更优选的实施方式中，抗生素为6-氨基青霉烷酸(6APA)。
优选地，6-氨基青霉烷酸的浓度为50-500μg/ml，例如可以为，但不限于50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml或500μg/ml。
当6-氨基青霉烷酸的浓度为50-500μg/ml时，对细菌的杀伤作用最为明显，能够达到使检测结果更直观、准确的效果。当6-氨基青霉烷酸的浓度小于50μg/ml时，则对细菌的杀伤作用不显著，不能刺激合作者产生细胞内容物；当6-氨基青霉烷酸的浓度大于500μg/ml时，则对细菌的杀伤效果过于强烈，欺骗者在利用了细胞内容物的前提下仍然死亡率较高，无法提供有效的细菌动力学变化，从而无法得出细菌的耐药性变化。
在一个优选的实施方式中，6-氨基青霉烷酸的浓度为100-400μg/ml。当6-氨基青霉烷酸的浓度为100-400μg/ml时，细菌的敏感性更高，死亡率更低，得出的细菌动力学变化数据更明显，得出的细菌耐药性变化的结果更准确。
在一个更优选的实施方式中，6-氨基青霉烷酸的浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml或400μg/ml。将6-氨基青霉烷酸的浓度设置为上述点值，能够在保证细菌敏感性和生存率的前提下，节约实验成本。
在一个优选的实施方式中，在向微液滴中加入不同浓度的抗生素的同时加入不同浓度的诱发剂。
诱发剂能够协同抗生素诱导细菌产生降解所加入的抗生素的酶，在微液滴中加入抗生素的同时加入诱发剂，能够为合作者提供能量，进一步刺激合作者发挥抵抗不良环境影响的功能，即刺激合作者进一步产生细胞内含物释放至环境中，供欺骗者利用。
在一个优选的实施方式中，诱发剂为糖类、苷类或氨基酸。
糖类是由C、H、O三种元素组成的生物大分子，可分为单糖、二糖和多糖等，糖类在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。苷类又称配糖体，是由糖或糖衍生物的端基碳原子与另一类非糖物质(称为苷元、配基或甙元)连接形成的化合物。苷类也可以为生命体提供能量。氨基酸是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。氨基连在α-碳上的为α-氨基酸。组成蛋白质的氨基酸大部分为α-氨基酸。
典型的诱发剂可以为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、色氨酸、乳糖、鼠李糖或阿拉伯糖。
优选地，诱发剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。优选地，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-2mM，例如可以为，但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM。
当异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-2mM时，协同抗生物诱导细菌产生降解所加入的抗生素的酶的作用明显。当异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度低于0.1mM时，合作者产生的降解所加入的抗生素的酶较少，不能达到较好的检测效果；当异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度高于2mM时，不能再增加合作者产生的降解所加入的抗生素的酶，并且还会增加细菌细胞的代谢压力。
优选地，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-1mM。当异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-1mM时，协同抗生物诱导细菌产生降解所加入的抗生素的酶的作用最明显，且给细菌细胞的代谢压力较小。
更优选地，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1mM、0.3mM、0.7mM或1mM。将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度设置为上述点值，能够在保证协同抗生物诱导细菌产生降解所加入的抗生素的酶的作用明显的前提下，节约实验成本。
在一个优选的实施方式中，微液滴中细菌的密度为200-500个/微液滴。
当微液滴中细菌的密度为200-500个/微液滴时，合作者与欺骗者的分布频率的随机性较小，且能够保证保证合作者与欺骗者的分布与自然环境类似。当微液滴中细菌的密度小于200个/微液滴时，合作者与欺骗者的分布并不足以模拟环境中合作者与欺骗者的分布，两种细菌的分布不具有随机性。当微液滴中细菌的密度大于500个/微液滴时，合作者与欺骗者的分布频率的随机性较大，检测结果不准确，且微液滴的大小不足以支持细菌生长至稳定期。
其中，微液滴中细菌的密度例如可以为，但不限于200个/微液滴、250个/微液滴、300个/微液滴、350个/微液滴、400个/微液滴、450个/微液滴或500个/微液滴。
在一个更优选的实施方式中，微液滴中细菌的密度为300-400个/微液滴。
在一个最优选的实施方式中，微液滴中细菌的密度为350个/微液滴。当微液滴中细菌的密度为350个/微液滴时，合作者与欺骗者的分布频率的随机性最小，且能够保证保证合作者与欺骗者的分布与自然环境最为类似。
使用微液滴技术产生大量不同合作者和欺骗者组合的细菌的微液滴，使细菌密度可控，且离散性好，能够单独观测细菌中的合作者或欺骗者，测得的结果误差小，能够更直观、更准确地检测微液滴菌群的细菌动力学变化，从而使得到的细菌耐药性的变化检测结果也更加准确。
在一个优选的实施方式中，合作者与欺骗者的数量比为1:9-9:1，例如可以为，但不限于1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2或9:1。
合作者与欺骗者的数量比为1:9-9:1，可以在液体环境中尽可能多的模拟不同比例的合作者与欺骗者在长时间的培养后细菌数目的变化情况。
在一个优选的实施方式中，从加入抗生素开始检测微液滴菌群的细菌动力学变化至细菌进入稳定期。
稳定期中，由于培养基中营养物质消耗，有害代谢产物积聚，该期微生物繁殖速度渐减，死亡数缓慢增加，生长分裂和死亡的菌细胞数处于动态平衡状态。在细菌进入稳定期前，其细菌动力学变化显著，检测得到的实验数据能够有效说明在不良环境下合作者和欺骗者的耐药性变化。当细菌进入动态平衡状态后，其细菌动力学变化不显著，持续检测的意义不大，且增加实验成本。
在一个优选的实施方式中，合作者和欺骗者均带有荧光标记。
优选地，合作者带有绿色荧光蛋白，欺骗者带有红色荧光蛋白。
优选地，合作者带有绿色荧光蛋白(GFP，来自于质粒pTS1)，欺骗者带有红色荧光蛋白(mCherry，来自于质粒ptetmCherry)。
在一个优选的实施方式中，细菌动力学变化包括细菌的生长速率、死亡速率及合作者和欺骗者的荧光强度变化。
通过测定细菌的生长速率和死亡速率，能够有效评估在不良环境中合作者的主动死亡量与欺骗者的生存率之间的关系，通过荧光显微镜检测在整个过程中微液滴中两种荧光强度的变化，得出细菌数目的变化情况，从而得出细菌耐药性的变化。
在一个优选的实施方式中，微液滴的数量为50-150万个，例如可以为，但不限于50万个、60万个、70万个、80万个、90万个、100万个、110万个、120万个、130万个、140万个或150万个。
微液滴的数量优选为100万个。
在一个优选的实施方式中，细菌在利用微流控技术生成微液滴前，先进行密度校正，使合作者和欺骗者的密度接近，达到OD600值为0.5-1.5。
当细菌密度达到OD600值为0.5-1.5时，细菌生长趋于稳定，有利于将合作者和欺骗者的数目调至一致。
其中，细菌密度的OD600值例如可以为，但不限于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5。
细菌密度的OD600值优选为1。当细菌密度达到OD600值为1时，细菌生长达到平台期，数目变化变慢，有利于调节两种细菌数目。
在一个优选的实施方式中，应用培养基进行密度校正，所用的培养基为未使用过的新培养基。
在一个更优选的实施方式中，密度校正前还包括过夜培养。
过夜培养的条件典型但不限制为37℃，过夜培养所用的培养基典型但不限制为LB培养基。
校正合作者和欺骗者的密度接近，能够保证每个微液滴环境中合作者和欺骗者的密度接近，从而更易控制微液滴中合作者与欺骗者的数量比例。
在一个优选的实施方式中，利用微流控技术，调节培养基相和油相的流速相同，至0.02-2mL/h，生成含有细菌的微液滴。
当培养基相和油相的流速为0.02-2mL/h时，流速不会因太慢或太快而形成不了微液滴。
其中，培养基相和油相的流速例如可以为，但不限于0.02mL/h、0.06mL/h、0.1mL/h、0.2mL/h、0.3mL/h、0.4mL/h、0.5mL/h、0.6mL/h、0.7mL/h、0.8mL/h、0.9mL/h、1mL/h、1.2mL/h、1.4mL/h、1.6mL/h、1.8mL/h或2mL/h。
培养基相和油相的流速优选为1mL/h。当培养基相和油相的流速为1mL/h时，液滴形成的大小足以培养实验所需数量的细菌，并且液滴与液滴之间的距离合适，不会因太近而碰撞破裂，也不会因为太远而浪费时间。
本发明所发明之方法可以模拟自然界环境下细菌受到环境压力刺激后细菌数目的变化情况，有利于确定确切的抗生素使用剂量，进而减少耐药菌的传播，避免过度用药。在本体系建立起来后，可以将细菌分离，使用微流控装置产生微液滴包埋细菌，并使用抗生素处理细菌，明确使用的抗生素种类以及剂量。
需要说明的是，本发明提供的细菌耐药性变化的检测方法非疾病的诊断与治疗手段。
为了有助于更清楚的理解本发明，下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
本实施例中所使用的细菌为大肠杆菌(Escherichia coli SN0301)，由Lindberg等所突变，其中，合作者和欺骗者为本实验室构建，相关参数已发表(Programming stress-induced altruistic death in engineered bacteria)；培养基为LB培养基，购自环凯微生物科技公司(HKM)。
具体操作步骤如下：
(a)、将合作者和欺骗者于37℃，LB培养基中过夜培养，之后用新培养基校正合作者与欺骗者细菌的密度，使其两者密度接近，OD600为1，载入微流控装置进行微液滴制备。
(b)、调节培养基相和油相流速至1mL/h，产生大量微液滴(数量为100万个)，并收集所有微液滴样品，储存于液池中。
其中，微液滴包括仅含有合作者(cooperator，C)的微液滴、仅含有欺骗者(defector，D)的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为1:9的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为2:8的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为3:7的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为4:6的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为5:5的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为6:4的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为7:3的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为8:2的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为9:1的微液滴。
(c)、37℃培养6～7小时，至微液滴中细菌的密度为300细胞/液滴。
(d)、在线将抗生素(6APA)和诱发剂(IPTG)注射到每个微液滴环境中，最终微环境中的6APA浓度为100μg/ml，IPTG浓度为1mM。
(e)、将微液滴再次置于37℃培养，同时，监测微液滴菌群的细菌动力学变化(生长速率、死亡速率以及两种菌群的荧光强度变化信息)，至细菌动力学进入稳态。
实验结果如图1和图2所示。从图1中可以看出，随着培养时间的延长，细菌的OD600趋近于1，且包含合作者越多的菌群OD600越低，说明合作者受到抗生素刺激之后大量死亡，而欺骗者菌群还可以继续生长。从图2中可以看出，随着细菌菌群中合作者的比例增大，在抗生素处理不同时间点后，合作者的数目相对稳定且随着一开始合作者比例的增大而增大，说明合作者的数量越多，细菌所表现的耐药性越强。
实施例2
本实施例中所使用的细菌为大肠杆菌(Escherichia coli SN0301)，由Lindberg等所突变，其中，合作者和欺骗者为本实验室构建，相关参数已发表(Programming stress-induced altruistic death in engineered bacteria)；培养基为LB培养基，购自环凯微生物科技公司(HKM)。
具体操作步骤如下：
(a)、将合作者和欺骗者于37℃，LB培养基中过夜培养，之后用新培养基校正合作者与欺骗者细菌的密度，使其两者密度接近，OD600为1.5，载入微流控装置进行微液滴制备。
(b)、调节培养基相和油相流速至1mL/h，产生大量微液滴(数量为100万个)，并收集所有微液滴样品，储存于液池中。
其中，微液滴包括仅含有合作者(cooperator，C)的微液滴、仅含有欺骗者(defector，D)的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为1:9的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为2:8的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为3:7的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为4:6的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为1:1的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为6:4的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为7:3的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为8:2的微液滴，合作者和欺骗者的数量比为9:1的微液滴。
(c)、37℃培养6～7小时，至微液滴中细菌的密度为400细胞/液滴。
(d)、在线将抗生素(6APA)和诱发剂(IPTG)注射到每个微液滴环境中，最终微环境中的6APA浓度为400μg/ml，IPTG浓度为1mM。
(e)、将微液滴再次置于37℃培养，同时，监测微液滴菌群的细菌动力学变化(生长速率、死亡速率以及两种菌群的荧光强度变化信息)，至细菌动力学进入稳态。
实验结果如图3和图4所示。从图3中可以看出，随着培养时间的延长，细菌在受到抗生素刺激后继续生长，且包含合作者越多的菌群恢复生长的时间越长，说明合作者受到抗生素的影响更大且随着浓度的增加而增加。从图4中可以看出，合作者在受到抗生素处理的9小时至36个小时，细菌数目还一直在降低，抗生素仍然影响着合作者，到36个小时后才趋于稳定。而且在高浓度的抗生素处理后，细菌的变化和低浓度相比不呈线性关系，出现了一个波峰。说明越高浓度的抗生素对菌群的影响越大，并且存在某一个比例的欺骗者和合作者可以在36个小时后适应高浓度的抗生素，所表现的耐药性较强。
综上所述，本发明提供的细菌耐药性变化的检测方法，利用合成生物学技术构建二元微生态体系，能够简化程序性死亡体系，使检测结果更直观、更准确。同时，使用微液滴技术产生大量不同合作者和欺骗者组合的细菌的微液滴，使细菌密度可控，且离散性好，能够单独观测细菌中的合作者或欺骗者，测得的结果误差小，能够更直观、更准确地检测微液滴菌群的细菌动力学变化，从而使得到的细菌耐药性的变化检测结果也更加准确。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
利用微流控技术生成含有细菌的微液滴，将不同浓度的抗生素加入所述微液滴中共培养后，检测微液滴菌群的细菌动力学变化，得到所述细菌耐药性变化；
其中，所述细菌包括合作者和欺骗者。
2.根据权利要求1所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述微液滴中细菌的密度为200-500个/微液滴。
3.根据权利要求1所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述合作者与所述欺骗者的数量比为1:9-9:1。
4.根据权利要求1所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述抗生素为青霉素类抗生素；
优选地，所述抗生素为6-氨基青霉烷酸；
优选地，所述6-氨基青霉烷酸的浓度为50-500μg/ml；
优选地，所述6-氨基青霉烷酸的浓度为100-400μg/ml；
更优选地，所述6-氨基青霉烷酸的浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml或400μg/ml。
5.根据权利要求1所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，在向所述微液滴中加入不同浓度的抗生素的同时加入不同浓度的诱发剂。
6.根据权利要求5所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述诱发剂为糖类、苷类或氨基酸；
优选地，所述诱发剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-2mM；
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-1mM；
优选地，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.1mM、0.3mM、0.7mM或1mM。
7.根据权利要求1所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，从加入抗生素开始检测所述微液滴菌群的细菌动力学变化至细菌进入稳定期。
8.根据权利要求1所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述合作者和所述欺骗者均带有荧光标记。
9.根据权利要求8所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述细菌动力学变化包括细菌的生长速率、死亡速率及所述合作者和欺骗者的荧光强度变化。
10.根据权利要求1-9任一项所述的细菌耐药性变化的检测方法，其特征在于，所述微液滴的数量为50-150万个。
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