CN108103054A - 一种rna保存液及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种RNA保存液，其包含金精三甲酸铵盐、防腐剂和苯丁抑制素盐酸盐；所述防腐剂选自甘氨酸、ε‑聚赖氨酸或半胱氨酸。本发明提供的RNA保存液可以有效防止游离RNA的降解，为RNA提供稳定的环境，延长RNA的保存时间，同时不影响RNA后续的检测效率和检测结果的准确性。

Description

一种RNA保存液及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种RNA保存液及其用途。
背景技术
核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名。每个RNA分子都由核苷酸单元长链组成，每个核苷酸单元含有一个含氮碱基、一个核糖和一个磷酸基。含RNA的生物样品一旦从体内采集分离，它的RNA会变得非常不稳定，极易被降解。且RNA是单链结构，在提取过程或保存过程中都极易发生降解。因此，RNA的提取和保存过程需要进行严格的处理，防止RNA发生特异或非特异的降解。
RNA为细胞的主要成分之一，参与细胞的各种功能活动，是生物学、医学和药学等生命有关学科的重要研究对象，RNA检测更是分子生物学研究的一个重要技术，包括生物芯片、基因表达矩阵分析(Array Analysis)和定量RT-PCR检测等。大多数情况下，由于各种各样的原因，RNA从生物样本中提取出来后并不能立刻得到检测，而需进行保存，以便后续的研究使用。因此，RNA保存过程中的质量和完整性会显著影响检测结果的准确性和可靠性。在生物样品中广泛存在并极度稳定的RNase对RNA的水解作用很强，许多RNase对RNA的降解作用不需任何辅助因子，给RNA的纯化、储存和使用带来极大困难。因此，一种能够有效防止RNA降解，不影响后续检测结果的RNA保存液，对RNA的分子生物学检测非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解决的技术难题。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种RNA保存液，可以有效防止游离RNA降解，为RNA提供稳定的环境，延长RNA的保存时间。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种RNA保存液，包含金精三甲酸铵盐、防腐剂和苯丁抑制素盐酸盐；所述防腐剂选自甘氨酸、ε-聚赖氨酸或半胱氨酸。
优选地，所述RNA保存液包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(80000～200000)：(0.02～0.06)。
优选地，所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为300：100000：0.04。
优选地，所述RNA保存液包含金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的质量比为(0.047～0.237)：(20～40)：(0.0000069～0.000021)。
优选地，所述金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的质量比为0.142：30：0.000014。
优选地，所述RNA保存液包含金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(50000～100000)：(0.02～0.06)。
优选地，所述金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为300：75000：0.04。
本发明还提供了所述RNA保存液在RNA保存中的用途。
优选地，所述RNA包括mRNA、miRNA、snRNA、scRNA、端粒酶RNA、反义RNA和核酶。
优选地，所述RNA溶液中RNA保存液的组分金精三甲酸铵盐的摩尔浓度为100～500μM，甘氨酸的摩尔浓度为80～200mM，ε-聚赖氨酸的质量浓度为2～4mg/ml，半胱氨酸的摩尔浓度为5～10mM，苯丁抑制素盐酸盐的摩尔浓度为20～60nM。
优选地，所述RNA溶液中RNA保存液的组分金精三甲酸铵盐的摩尔浓度为300μM，甘氨酸的摩尔浓度为100mM，ε-聚赖氨酸的质量浓度为3mg/ml，半胱氨酸的摩尔浓度为7.5mM，苯丁抑制素盐酸盐的摩尔浓度为40nM。
本发明还提供了一种RNA保存试剂盒，所述试剂盒含有上述RNA保存液。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明RNA保存液的组分和用量是发明人通过大量的研究和分析得来的，可有效防止RNA降解，使其更稳定，更易保存；(2)本发明保存液在保存过程中不会影响RNA的特性，保证了后续检测结果的效率和准确性。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为100：80000：0.02。
实施例2
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为500：200000：0.06。
实施例3
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为300：100000：0.04。
实施例4
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的质量比为0.047：20：0.0000069。
实施例5
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的质量比为0.237：40：0.0000069。
实施例6
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的质量比为0.142：30：0.000014。
实施例7
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为100：50000：0.02。
实施例8
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为500：100000：0.06。
实施例9
本发明RNA保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为300：75000：0.04。
实施例10
本发明RNA保存试剂盒的一种实施例，包含以下浓度的组分：金精三甲酸铵盐300uM、甘氨酸100mM、ε-聚赖氨酸30mg/ml、半胱氨酸75mM和苯丁抑制素盐酸盐40nM。
实施例11
本实施例对发明所述RNA保存液对RNA的保存效果进行研究。
1、实验设计
利用Trizol法提取293T细胞的RNA，分别利用实施例1～9中的RNA保存液在不同条件下对提取获得的RNA溶液进行保存，并设置不使用RNA保存液的对照组，所述对照组中添加相同体积的DEPC水，具体如表1所示：
表1实验设计
2、实验方法
利用Trizol法提取293T细胞的RNA，测定浓度和OD260nm/OD280nm比值(1.86)后，平均分为20个组，按表1的设计添加RNA保存液或DEPC水。将各组样品保存在相应的条件下，3周后利用NanoDrop2000超微量分光光度计分别测定各组样品RNA的浓度，同时利用以下公式计算RNA的降解率：降解率％＝(实验前RNA浓度-实验后RNA浓度)/实验前RNA浓度×100％。
3、实验结果
2周后，对各组样品进行检测，具体实验结果如表2所示：
表2实验结果
由上述实验结果可知，本发明提供的RNA保存液在-80℃(实验组1～9)和37℃(实验组10～18)时都能显著提高RNA的稳定性，可有效防止其在保存过程中的降解。其中，实施例3中的RNA保存液对RNA的保存效果最好。而在相同保存条件下，不使用本发明保存液的RNA溶液(对照组1～2)的降解率显著高于使用本发明保存液的RNA溶液。尤其是在37℃(对照组2)保存条件下，不使用发明保存液的RNA溶液在3周后完全降解(降解率100％)。
实施例12
本实施例对发明所述RNA保存液对RNA的检测结果进行研究。
为研究使用本发明所述RNA保存液保存RNA是否会影响后续检测结果，本实施例对使用RNA保存液保存RNA后的样品进行基因的表达检测，检测基因为内参基因GAPDH。
1、实验方法
利用Trizol法提取293T细胞的RNA，测定浓度和OD260nm/OD280nm比值(1.90)后，利用荧光定量PCR法检测样品中内参基因GAPDH的表达，并记录检测结果。检测方法为SYBRGreen法，检测体系和程序严格按照说明书进行。检测上游引物为：5’-GGTAGGGAGTTCGAGACCAG-3’；下游引物为：5’-GCCTCTTGAGTAGCTGGGAT-3’。剩余的RNA溶液平均分为9个组，实验组分别使用实施例1～9的保存液对RNA进行保存。各组样品在-80℃保存1个月后，再次利用荧光定量PCR法检测样品中GAPDH的表达，并对结果进行分析。
2、实验结果
1个月后，对各组RNA样品中内参基因GAPDH的表达进行检测，具体实验结果如表3所示：
表3实验结果
由上述实验结果可知，实验组19～27的RNA样品中内参基因GAPDH均能检出，且CT值属于正常范围内。说明本发明提供的RNA保存液在保存RNA时不会影响后续检测结果的准确性。
实施例13
本申请发明人发现RNA溶液中RNA保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为100～500μM，甘氨酸摩尔浓度为80～200mM，ε-聚赖氨酸质量浓度为2～4mg/ml，半胱氨酸摩尔浓度为5～10mM，苯丁抑制素盐酸盐摩尔的浓度为20～60nM时可有效防止游离RNA的降解。本实施例研究RNA保存液组分的使用量对RNA保存效果的影响。
1、实验设计
本实施例以RNA保存液组分金精三甲酸铵盐在RNA样品中的浓度为例，研究本发明RNA保存液在保存RNA时组分浓度对保存效果的影响，具体设计如表4所示。
表4实验设计
2、实验方法
利用Trizol法提取人外周血细胞中的RNA，测定浓度和OD260nm/OD280nm比值(1.83)后，平均分为5个组，按表4的设计添加RNA保存液各组分。将各组样品保存在-80℃，1个月后利用NanoDrop2000超微量分光光度计分别测定各组样品RNA的浓度，同时利用以下公式计算RNA的降解率：降解率％＝(实验前RNA浓度-实验后RNA浓度)/实验前RNA浓度×100％。
3、实验结果
1个月后，对各组样品进行检测，具体实验结果如表5所示：
表5实验结果
组别 RNA降解率
实验组28 0.19％
实验组29 0.23％
实验组30 0.11％
实验组31 0.71％
实验组32 0.68％
由上述实验结果可知，本发明提供的RNA保存液组分金精三甲酸铵盐在RNA样品中的浓度为100～500μM时可取得很好的保存效果，其中金精三甲酸铵盐在RNA样品中的浓度为300μM时保存效果最好。本发明RNA保存液的使用量是发明人经过研究和统计分析得出的最优比例，不在本发明范围内的使用量的减少(实验组31)或增加(实验组32)均会影响RNA保存液对RNA的保存效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种RNA保存液，其特征在于，包含金精三甲酸铵盐、防腐剂和苯丁抑制素盐酸盐；所述防腐剂选自甘氨酸、ε-聚赖氨酸或半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于，包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(80000～200000)：(0.02～0.06)。
3.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于，包含金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、ε-聚赖氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的质量比为(0.047～0.237)：(20～40)：(0.0000069～0.000021)。
4.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于，包含金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐，且所述金精三甲酸铵盐、半胱氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(50000～100000)：(0.02～0.06)。
5.根据权利要求1～4任一项所述的RNA保存液在RNA保存中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述RNA包括mRNA、miRNA、snRNA、scRNA、端粒酶RNA、反义RNA和核酶。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述RNA溶液中RNA保存液的组分金精三甲酸铵盐的摩尔浓度为100～500μM，甘氨酸的摩尔浓度为80～200mM，ε-聚赖氨酸的质量浓度为2～4mg/ml，半胱氨酸的摩尔浓度为5～10mM，苯丁抑制素盐酸盐的摩尔浓度为20～60nM。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述RNA溶液中RNA保存液的组分金精三甲酸铵盐的摩尔浓度为300μM，甘氨酸的摩尔浓度为100mM，ε-聚赖氨酸的质量浓度为3mg/ml，半胱氨酸的摩尔浓度为7.5mM，苯丁抑制素盐酸盐的摩尔浓度为40nM。
9.一种RNA保存试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1～4任一项所述的RNA保存液。
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