CN108101885A - 含异丙胺和硝基噻吩酰胺类结构化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体而言，本发明涉及一种异丙胺和硝基噻吩酰胺类结构的化合物、其制备方法以及在制备治疗炎症性疾病、眼科疾病及呼吸系统疾病等中的应用。

Description

含异丙胺和硝基噻吩酰胺类结构化合物、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地讲，本发明涉及对抑制ROCK而产生治疗作用的一种含异丙胺和硝基噻吩酰胺类结构化合物，可作为ROCK抑制剂、其制备方法，以及在制药上的用途。
背景技术
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ROCK在人体内由两种亚型ROCK I及ROCK II组成。ROCK I在18号染色体被编码，而ROCK II(也称之为Rho激酶)则位于12号染色体。两者的分子质量均约为160kD。两者(的氨基酸序列)具有65％的同源性，其中激酶区的同源性高达95％。尽管它们的序列很相似，但组织分布却各有不同。ROCK I最高水平的表达可从心脏、肺和骨骼组织观察到，而ROCK II则主要在大脑表达。最近的数据显示这两种异构体有部分的功能丰余性，ROCK I更多地涉及于免疫活性，而ROCK II则涉及于平滑肌功能。
ROCK活性已被证明由Rho(Ras同源物)GTP结合蛋白的一成员—GTPase RhoA所影响而增强。活性型GTP结合态的RhoA与位于自抑制羧基末端环的ROCK Rho蛋白结合域(RBD)产生相互作用。在结合后，ROCK负性调节区及激酶区之间的相互作用被破坏。这个过程使得激酶获取完全处于活性状态的开放构象。该开放构象也由脂质激活因子(例如花生四烯酸)与激酶羧基末端结构域的PH结构域的结合所致。也描述了细胞凋亡过程中另一个激活机制，并涉及经胱天蛋白酶(caspase)-3及-2(或粒酶granzyme B)分别对ROCK I及II进行的羧基端裂解。
ROCK在各种细胞功能中起到重要作用，例如平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架的组织、血小板活化、肌球蛋白磷酸酶细胞粘附的下调、主动脉平滑肌细胞的迁移、增生、存活及凝血酶诱导反应、心肌细胞肥大、支气管平滑肌收缩、平滑肌收缩及非肌肉细胞骨架重组、容量调控阴离子通道的激活、神经突回缩、伤口愈合、细胞转化和基因表达。ROCK也在涉及自身免疫和炎症方面的许多信号途径中发挥作用。ROCK已被证明在NF-κB的激活方面发挥作用，该NF-κB是一种导致肿瘤坏死因子TNF和其他炎性细胞因子产生的关键分子。据报告，ROCK抑制剂能对抗脂多糖(LPS)刺激THP-1巨噬细胞中TNF-α和IL-6因子的产生。因此，ROCK抑制剂提供了有益的疗法来治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病及氧化应激反应。
总的来说，ROCK是平滑肌细胞功能的主要控制点，并且是各种炎性细胞的炎症过程以及许多患病器官的纤维化和重塑过程的关键信令成分。有明显的迹象表明ROCK涉及了许多疾病的发病机制，当中包括了哮喘、慢性阻塞性肺病和青光眼。此外，ROCK牵连到各种疾病和障碍，当中包括了眼疾、呼吸道疾病、心血管疾病和血管疾病、炎症性疾病、神经系统和中枢神经系统疾病、增生性疾病、肾脏疾病、性功能障碍、血液系统疾病、骨骼疾病、糖尿病、良性前列腺增生症、移植排斥反应、肝脏疾病、系统性红斑狼疮、痉挛、高血压、慢性阻塞性膀胱疾病、早产、感染、过敏症、肥胖症、胰腺疾病和艾滋病。
以基因敲除模型和大量的学术研究作为例证，ROCK看起来是一个安全的靶点。这些基因敲除小鼠的数据与法舒地尔(Fasudil)的上市后监测研究(用于治疗蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛的适度有力ROCK抑制剂)结合，表明了ROCK是一个真正和显著的药物靶标。ROCK抑制剂可用作治疗涉及ROCK途径的障碍的治疗性药物。因此，我们极度需要开发一种可用于治疗各种与ROCK激活相关的ROCK抑制剂，特别是考虑到目前这些疾病大多数都治疗不足。一些非限制的例子是青光眼、哮喘和慢性阻塞性肺病。
青光眼，一种因视神经损伤而可能会导致视力减退和失明的疾病，是因眼内压力增加而引起的。这是成人失明的常见原因，大多是一种在确诊后需要终身控制的慢性疾病。由于目前的治疗只能控制且无法根治疾病，并进一步遭受刺激、局部和全身的副作用，该疾病需要一个改善的治疗法。此外，其它的正面影响，也就是ROCK抑制剂的抗炎和神经再生成分将被优先考虑。引用诸如Y-27632的ROCK抑制剂能改变细胞形态及减少温育的TM人类细胞的张力纤维、焦点粘着和MLC磷酸化；它们舒张体外培养的人小梁网状组织、舒张体外的人类Schlemm管道内皮细胞，当局部应用到动物身上将能显著增加小梁流出，导致有利地降低眼内压力。
过敏性哮喘是一种因遗传性易感者对无处不在的环境蛋白产生非适应性免疫反应，从而引发的呼吸道慢性炎症疾病。虽然有相当成功的治疗方法，患病率却因这些疗法无法根治而有所增加；现在情况仍在加剧，并有越来越多的无反应者。能对付该疾病所有因素的新型、高效、节制激素疗法是必需的。
慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一组以慢性不可逆性呼吸道受制、与异常炎性反应、支气管收缩、以及肺组织的重塑和损害为特征的疾病。它是人类死亡的主要原因之一，患病率正稳步地增加。由于目前的疗法不足以治愈疾病，我们迫切的需要寻求新的治疗方法。由于糖皮质激素只具有有限或根本无效的作用，因此到现在为止仅使用支气管扩张剂。引用诸如Y-27632的ROCK抑制剂能舒张分离的人支气管制备物，抑制麻醉动物的呼吸道阻力增加，加强体外和体内的β-受体激动剂的舒张作用，并在吸入后给予迅速的支气管扩张。此外，ROCK抑制剂能阻断H2O2诱导的气管平滑肌收缩(氧化应激反应的临床标记)。
与呼吸道炎症相关的是，ROCK抑制剂能对抗消炎药介导的跨内皮细胞通透性的增强、保持血管内皮的屏障完整性、抑制体内卵清蛋白激发后的嗜酸性粒细胞的流入、防止肺水肿的形成及中性粒细胞迁移、抑制过敏小鼠呼吸道内对乙酰甲胆碱和5-羟色胺的过敏反应及阻断LPS诱导的肿瘤坏死因子(TNF)释放。至于呼吸道纤维化和重塑方面，ROCK抑制剂能阻断呼吸道平滑肌细胞诱导的迁移。ROCK对于呼吸道重塑作用的体外证据可见于人类的肺癌细胞系、小牛的气管平滑肌细胞和人类呼吸道平滑肌。ROCK对于纤维化作用的体内证据一般产生于小鼠中(其中ROCK的部分缺失引起衰减的心肌纤维化)。Y-27632对于心肌梗塞以及法舒地尔(fasudil)对于慢性高血压大鼠模型的充血性心脏衰竭的心肌纤维化衰减为ROCK对于重塑的重要性带来另外的适应症。最后，ROCK抑制剂增加平滑肌细胞的凋亡细胞损失。
男性和女性的人体性反应会因生理、心理和激素因素的相互作用而产生。男性和女性人体性反应的其中一个共同之处是血管作用应答，它会因性刺激带来的血管平滑肌松弛、从而令生殖器的性组织充血。因此，当会阴血管的平滑肌放松时，阴茎和阴蒂内的血压和血流量也随之增加。动脉血的流入将导致阴茎或阴蒂海绵体扩大，从而导致勃起。阳痿(男性勃起功能障碍)一般界定为无法达到和维持足够进行满意性表现和性交的勃起能力。阳痿可能是因为心理障碍、神经系统异常或其他包括激素缺乏的生理障碍，或多种原因的结合导致而成。在美国，男性阳痿估计影响到40％的40岁男性，随着年龄增加到50岁将提高至约50％，到70岁时将高达67％。女性随着年龄的增加也会面对性功能障碍，并伴有更年期发作和增加血管疾病的风险。因此，跟男性一样，女性的性唤起至少有一部分会伴有令阴蒂充血的血流量增加。阴道的血流量也增加了阴道的润滑程度。因此，女性性功能障碍可能是由于在整个性活动时期无法达到或维持阴蒂充血和/或阴道润滑而引起的。目前，大部分用于治疗勃起功能障碍的血管扩张剂能靶向减少钙离子的信号转导途径，这需要启动血管平滑肌的收缩活动。然而，从生理角度来看，血管收缩的启动是一个非常急性的活动，持续时间仅从数秒钟到数分钟。勃起组织通过钙非依赖性信号转导途径的长期的血管收缩保持在松弛状态。保持钙非依赖性血管收缩的信号途径是RhoA/Rho激酶途径。ROCK抑制剂对于治疗勃起功能障碍也相应有用。因此，从一方面来看，本发明包含一种用于治疗男性或女性性功能障碍的方法，其包括向有此需要的个体局部施用包含能在器官受试体中减弱对性刺激的Rho激酶活性的化合物。
目前有几种已知的ROCK抑制剂类型。当前的重点是肿瘤和心血管疾病的应用。到现在为止，ROCK抑制剂的杰出治疗潜力只限于有限的范围内。其原因在于ROCK是这样一种有效和广泛的生化调节剂，ROCK的全身性抑制作用能带来强大的生物效应，但也被视为是大多数疾病治疗的副作用。事实上，ROCK抑制剂用较强抗炎成分治疗疾病的医疗用途受到ROCK关键作用在调节平滑肌细胞收缩的进补阶段时的阻碍。全身性给药的ROCK抑制剂会诱发血压明显下降。因此，我们对不同性质的ROCK抑制剂有极高的需求。
为了通过调节平滑肌功能和/或炎症过程和/或重塑展开疾病的针对性具体治疗，我们高度期望ROCK抑制剂能靶向目标器官，以避免大份量的药物进入其他器官。因此，本地或局部的药物应用是所期望的。通常情况下，局部应用的药物用于治疗呼吸道、眼睛、性功能障碍和皮肤疾患。
总而言之，目前我们依然有持续必要设计和开发ROCK抑制剂，以用于治疗范围广泛的疾病状态。这里描述的化合物和药学上可接受的组合物可用于治疗或减轻与ROCK激活相关的各种障碍或病症的严重性。更具体地说，本发明的化合物优选用于预防和/或治疗至少一种涉及ROCK的疾病或障碍，例如与平滑肌细胞的功能、炎症、纤维化、过度的细胞增殖、血管生成过度、高反应性、屏障功能障碍、神经退化病变和重塑有关的疾病。例如，本发明的化合物可用于预防和/或治疗如下的疾病和病症：眼科疾病或病症、呼吸道疾病、咽喉，鼻和耳的疾病、皮肤疾病、肠道疾病、心脏血管和血管疾病、炎症性疾病、神经系统疾病、增生性疾病、肾脏疾病、性功能障碍，等等。
本发明公开了一种异丙胺和硝基噻吩酰胺结构的ROCK抑制剂，这些化合物可用于制备性功能障碍、炎症性疾病、眼科疾病及呼吸系统疾病等的治疗药物。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有式I的ROCK抑制剂。
本发明的另一个目的是提供制备具有式I的化合物的方法。
本发明的再一个目的是提供含有式I的化合物在治疗性功能障碍、炎症性疾病、眼科疾病及呼吸系统疾病等方面的应用。
现结合本发明的目的对本发明内容进行具体描述。
本发明具有式(I)的化合物具有下述结构式：
本发明所述式(I)化合物可以通过以下路线合成：
噻吩羧酸化合物II与4-戊烯胺III在DCC存在下缩合，生成酰胺IV；萘羧酸化合物II与VI在DCC存在下缩合，生成酰胺VII；化合物VII在硼酸三异丙酯存在下使用正丁基锂处理，得到化合物VIII；化合物IV与化合物VIII在Suzuki反应条件下反应，偶合得到化合物IX；化合物IX使用OsO4和N-甲基吗啉N-氧化物(NMMO)处理，得到产物I。
本发明所述式I化合物具有ROCK抑制作用，可作为有效成分用于制备如性功能障碍、炎症性疾病、眼科疾病及呼吸系统疾病等的治疗药物。本发明所述式I化合物的活性是通过体外抑制ROCK实验来验证。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，下述实施例仅是用于说明，而并非用于限制本发明。本领域内一般的技术人员根据本发明的教导所做出的各种变化均应在本申请权利要求所要求的保护范围之内。
实施例1化合物I-1的合成
步骤1.化合物IV-1的合成
2.07g(10mmol)化合物II-1和0.85g(10mmol)化合物III溶于20mL干燥的THF中，室温下搅拌，加入2.48g(12mmol)N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)和0.1g 4-二甲胺基吡啶(DMAP)，加完后，反应混合物在室温下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，依次用100mL 1％稀盐酸和100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物IV-I,2.41g(收率88％)。ESI-MS,m/z＝275([M+H]+)。
步骤2.化合物VII-1的合成
2.51g(10mmol)化合物V溶于20mL干燥的THF中，室温下搅拌，加入2.48g(12mmol)N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)和0.1g 4-二甲胺基吡啶(DMAP)，加完后，反应混合物在室温下搅拌1小时，然后再加入5mL饱和的NH3/MeOH溶液，而后所得混合物在室温下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，依次用100mL 1％稀盐酸和100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物VII-1，2.28g(收率91％)。ESI-MS,m/z＝251([M+H]+)。
步骤3.化合物VIII-1的合成
2.00g(8mmol)化合物VII-1和3.76g(20mmol)B(i-PrO)3溶于14mL干燥甲苯和7mL的THF中，搅拌，在氮气保护下冷却到-30℃，而后用注射器慢慢滴加10mL(16mmol)1.6M n-BuLi的正己烷溶液。滴加完毕后，反应化合物在该温度下搅拌3小时，而后在室温下再搅拌3小时，TLC跟踪发现反应完成。往反应混合物中慢慢加入1mL浓盐酸，室温下搅拌1小时，而后倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，用100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物VIII-1，1.38g(收率80％)。ESI-MS,m/z＝216([M+H]+)。
步骤4.化合物IX-1的合成
1.37g(5mmol)化合物IV-1，1.08g(5mmol)化合物VIII-1、0.18g(0.25mmol)Pd(dppf)Cl2和1.59g(15mmol)碳酸钠加入到21mL 1,4-二氧六环和7mL水中，反应混合物在氮气气氛中80℃下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，用100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物IX-I,1.51g(收率83％)。ESI-MS,m/z＝365([M+H]+)。
步骤5.化合物I-1的合成
1.09g(3mmol)化合物IX-1溶于7mL THF和3mL水中，室温下搅拌，加入0.70g(6mmol)NMMO和1.2mL(0.3mmol)0.25M OsO4溶于75％的叔丁醇水溶液制成的溶液，加完后，反应化合物在室温下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，依次用100mL 5％Na2S2O3水溶液和100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物I-I,1.05g(收率88％)。ESI-MS,m/z＝399([M+H]+)。
实施例2化合物I-2的合成
步骤1.化合物IV-2的合成
2.52g(10mmol)化合物II-2和0.85g(10mmol)化合物III溶于20mL干燥的THF中，室温下搅拌，加入2.48g(12mmol)N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)和0.1g 4-二甲胺基吡啶(DMAP)，加完后，反应混合物在室温下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，依次用100mL 1％稀盐酸和100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物IV-2。ESI-MS,m/z＝320([M+H]+)。
步骤2.化合物VII-2的合成
2.51g(10mmol)化合物V溶于20mL干燥的THF中，室温下搅拌，加入2.48g(12mmol)N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)和0.1g 4-二甲胺基吡啶(DMAP)，加完后，反应混合物在室温下搅拌1小时，然后再加入10mmol VI-2，而后所得混合物在室温下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，依次用100mL 1％稀盐酸和100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物VII-2。ESI-MS,m/z＝293([M+H]+)。
步骤3.化合物VIII-2的合成
2.34g(8mmol)化合物VII-2和3.76g(20mmol)B(i-PrO)3溶于14mL干燥甲苯和7mL的THF中，搅拌，在氮气保护下冷却到-30℃，而后用注射器慢慢滴加10mL(16mmol)1.6M n-BuLi的正己烷溶液。滴加完毕后，反应化合物在该温度下搅拌3小时，而后在室温下再搅拌3小时，TLC跟踪发现反应完成。往反应混合物中慢慢加入1mL浓盐酸，室温下搅拌1小时，而后倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，用100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物VIII-2。ESI-MS,m/z＝258([M+H]+)。
步骤4.化合物IX-2的合成
1.60g(5mmol)化合物IV-2、1.29g(5mmol)化合物VIII-2、0.18g(0.25mmol)Pd(dppf)Cl2和1.59g(15mmol)碳酸钠加入到21mL 1,4-二氧六环和7mL水中，反应混合物在氮气气氛中80℃下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，用100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物IX-2，ESI-MS,m/z＝453([M+H]+)。
步骤5.化合物I-2的合成
1.36g(3mmol)化合物IX-2溶于7mL THF和3mL水中，室温下搅拌，加入0.70g(6mmol)NMMO和1.2mL(0.3mmol)0.25M OsO4溶于75％的叔丁醇水溶液制成的溶液，加完后，反应化合物在室温下搅拌过夜，TLC跟踪发现反应完成。反应混合物倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mL×3CH2Cl2萃取，合并萃取相，依次用100mL 5％Na2S2O3水溶液和100mL 5％盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物I-2，白色固体，ESI-MS,m/z＝487([M+H]+)。
实施例3化合物体外抑制ROCK分析
使用来自Molecular Devices公司市售的ROCK IMAP试剂盒(产品编号R8093)，并基本根据制造商提供的方案以荧光偏振(FP)法执行抑制实验。所用的S6核糖体蛋白源性底物是(Fl)-AKRRRLSSLRA，同样来自Molecular Devices公司(产品编号R7184)。ROCKα/ROCKII的酶混合物来自Upstate Biotechnology公司(产品编号14-451)。简而言之，所有化合物被放入384孔板进行筛选以测定酶抑制，所用浓度介于100μM至0.1nM之间，采用循序渐进的3倍稀释法。Y-27632(由Tocris公司市售)被用作为参照(0.4μM)为了执行实验。将要在DMSO中测试的1μL化合物溶液(每个浓度)放入有10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、0.1％BSA、0.05％NaN3、pH值为7.2的2μL酶溶液中。酶的最终浓度为2.6nM。在室温下温育30分钟后，添加2μL的ATP与蛋白质底物在10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、0.1％BSA、0.05％NaN3、pH值为7.2的溶液中的混合物。ATP的终浓度为10μM，而蛋白底物的最终浓度则为0.2μM。在室温下温育60分钟后，添加12μL的IMAP结合溶液(IMAP结合缓冲液A(1x)及IMAP结合试剂(来自ROCK IMAP试剂盒)的混合物)。在室温下温育如此获得的混合物(总体积：17μL)60分钟，使用自动平板读数器(Perkin Elmer、Envision 2100-0010HTS型)测量荧光偏振度，其中FP滤波器使用FITC FP480激发滤光片及FITC FP P-pol535及FITC FP S-pol535放光滤光片(Perkin-Elmer)。使用XL-Fit算法将结果拟合成一个曲线，然后再次用XL-Fit算法计算每个拟合曲线的IC50值。
结果见下表：
化合物 IC50(nM)
化合物I-1 54.1
化合物I-2 12.5
从上表结果可以看出，本发明化合物对ROCK具有很强的抑制效果，可作为制备治疗炎症性疾病、眼科疾病及呼吸系统疾病等疾病药物中的应用。

Claims (3)

1.具有通式(I)结构的化合物，
2.合成权利要求1所述化合物的方法：
噻吩羧酸化合物II与4-戊烯胺III在DCC存在下缩合，生成酰胺IV；萘羧酸化合物II与VI在DCC存在下缩合，生成酰胺VII；化合物VII在硼酸三异丙酯存在下使用正丁基锂处理，得到化合物VIII；化合物IV与化合物VIII在Suzuki反应条件下反应，偶合得到化合物IX；化合物IX使用OsO4和N-甲基吗3啉N-氧化物(NMMO)处理，得到产物I。
3.权利要求1任一项所述化合物在制备炎症性疾病、眼科疾病及呼吸系统疾病药物方面的应用。
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