CN108096575B - 一种用于脱敏疫苗的佐剂及一种新型脱敏疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于脱敏疫苗的佐剂，包括诱导免疫耐受的成分，所述诱导免疫耐受的成分为抗炎化合物。本发明还提供了一种使用抗炎化合物作为佐剂的新型脱敏疫苗。本发明将抗炎化合物作为佐剂与过敏原共同注射，以防止过敏疫苗在该部位发生炎症；所述抗炎化合物具有抑制抗原呈递细胞成熟的作用，抗炎化合物直接作用于抗原呈递细胞，抑制它们在抗原摄取和呈递过程中成为成熟的细胞；抗炎化合物通过迅速诱导Treg细胞的生成实现了对过敏症的长效治疗。本发明提供的脱敏疫苗能够从致敏的机理对过敏症状实现快速、长效、有效的治疗。

Description

一种用于脱敏疫苗的佐剂及一种新型脱敏疫苗

技术领域

本发明涉及一种疫苗及其佐剂，尤其涉及一种脱敏疫苗及其佐剂

背景技术

过敏是免疫系统对环境中无害的物质的超敏性反应。引起过敏的常见原因主要包括室内尘螨、植物花粉、霉菌、药物、食物、动物皮屑和昆虫的毒液等。免疫疗法可以长期缓解症状，防止疾病从鼻炎到过敏性哮喘发展，甚至治愈。过敏发生的过程包括致敏阶段和过敏反应阶段。在致敏阶段，当机体第一次接触到过敏原时发生了免疫反应，从而产生大量的2型T辅助淋巴细胞(T helper 2，Th2)和对特定过敏原的IgE抗体。IgE抗体与呼吸道粘膜或皮肤里的主细胞和嗜碱性细胞的表面的受体结合。机体致敏后，当再次遇到相同的过敏原时，就会发生过敏反应。在过敏反应阶段，过敏原的分子与主细胞和嗜碱性细胞表面的IgE抗体结合，触发脱粒过程，即这些细胞释放组织胺和其他炎症化学介质(如细胞因子、白细胞介素、白细胞介素、前列腺素)进入周围的组织和血液。这些化学介质引起局部或全身的反应，如血管舒张、粘液分泌、神经刺激、平滑肌收缩等，症状表现为鼻漏、瘙痒、呼吸困难甚至引起过敏性休克。

过敏人体的Th2淋巴细胞及其分泌的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)在过敏反应的发生和发展过程中起着至关重要的作用。IL-4增强免疫球蛋白类转化为IgE，调控产生IgE的B细胞的扩增，以及肥大细胞的生成。IL-13与气道中的粘液分泌过多有关。IL-5促进嗜酸性粒细胞的分化、成熟和激活，并浸润到呼吸道黏膜上。在慢性过敏原暴露后，气道内肥大细胞和嗜酸性粒细胞的积累导致肺组织病理和功能病理。

长期的过敏会导致呼吸道尤其是肺部的慢性炎症。过敏患者到老年时往往会发生肺组织的纤维化，出现肺功能降低，表现过敏性哮喘和呼吸困难症状。

在现有技术中，治疗过敏和过敏性哮喘的药物种类繁多，包括减充血剂、抗组胺剂、受体激活剂、铬酸钠和抗炎药，如皮质类固醇。这些疗法纯粹是减轻症状的，只提供短期的效果，而不会对疾病或其进展产生任何影响。

例如，一种常用的治疗过敏和哮喘的方法是皮质类固醇，特别是糖皮质激素(GCs)。GCs用于治疗过敏和过敏性哮喘的消炎药。在现有的过敏治疗中，GCs的作用是作为消炎药使用，GCs通过与炎症组织细胞内细胞的糖皮质激素受体结合发挥作用，从而提高了在细胞核中抗炎蛋白的表达，抑制了细胞浆中诱发炎症的蛋白质的表达。作为抗炎药的GCs通常是局部的配方，如皮肤治疗的药膏、鼻炎的鼻腔喷雾剂或哮喘的吸入器。当直接应用于炎症组织时，这些制剂的优点是只对目标区域进行治疗，而不会造成人的全身的副作用。因此在现有技术中，将GCs作为消炎药用于过敏的治疗其作用仅仅是减轻过敏症状的消除，对过敏症状的致敏机制和致敏过程没有任何作用。

在现有技术中GCs也是一种免疫抑制剂。注射或口服可以对全身的免疫系统产生抑制作用，也能够治疗过敏反应，减轻过敏的症状。这种免疫系统的抑制作用与GCs治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应相似。在这个应用中，GCs经常被注射或口服，并通过血液输送至患者全身，从而对机体产生免疫抑制作用，进而影响整个免疫系统的B细胞和T细胞，即GCs的这一治疗方法不限于过敏反应部位。免疫抑制的主要机制是通过抑制激活B细胞的kappa-光链增强因子，这是一种关键的转录因子，参与细胞因子和其他蛋白质的合成。因此，抑制这种转录因子会降低免疫系统的反应能力，比如对过敏原的反应。由于潜在的副作用，包括感染风险和神经系统症状，系统地将GCs作为免疫抑制药物治疗过敏并不常用。即，现有技术中，GCs作为免疫抑制剂治疗过敏症状，主要是通过抑制激活B细胞的kappa-光链增强因子降低免疫系统对过敏原的反应能力，其缺点是，不仅对免疫部位发生影响，对全身的免疫系统均会产生抑制作用，从而对人体具有极大的副作用。

现有技术中，对于过敏的另一种治疗方法为免疫疗法，是一种通过纠正免疫系统的敏感状态，从而有可能改变疾病的进程(例如从鼻炎到哮喘的进展)，并提供持久的症状缓解。目前有两种特殊的过敏免疫治疗方法，皮下注射和舌下施药。皮下注射脱敏通常包括6个月的剂量升级阶段(大约每周1-2次注射越来越高剂量的过敏原，直到达到治疗的剂量)，以及3-5年的剂量维持阶段(例如每月1次注射一次治疗的剂量)。舌下免疫疗法，在2013年以前仅在欧洲实施(2013年开始在美国应用)，包括每天或每隔一天服用过敏原提取物，持续3-5年(共计1000剂)。舌下施药的剂型包括液体的滴剂或固体的片剂。

目前，过敏免疫疗法的疫苗是从过敏性物质中提取的物质，如花粉或室内尘螨等，现有技术中的脱敏疫苗不包括任何的佐剂。正在研发的过敏疫苗包括使用重组蛋白、合成肽、编码特定过敏原的DNA质粒等。

目前的脱敏疫苗存在缺陷，注射和舌下施药通常会导致症状评分降低20-50％和降低化药物的使用；皮下注射的脱敏治疗有可能会引起导致过敏性休克，因此必须在过敏专科医生的指导下在医院完成。

在现有技术中，用于预防传染病的疫苗使用的传统佐剂包括具有免疫刺激性的有CpG的DNA序列、铝盐、去毒的细菌毒素(如单磷酸脂A或热不稳定毒素)等。尽管已有文献报道其中许多免疫刺激佐剂作为疫苗的组成部分能够提高脱敏疫苗的功效，并且有些佐剂已评估或正在评估。但是，这些传统佐剂的共同特性是它们能够在免疫部位触发促炎细胞因子的产生，促炎细胞因子充当“危险信号”，诱发免疫系统做出反应，根据使用的具体佐剂，免疫反应的类型可能会偏向Th1细胞(T helper 1，1型T辅助淋巴细胞)，Th17细胞，或IgG抗体。因此，在脱敏疫苗中，这些传统佐剂的使用触发促炎细胞因子的产生，引起机体的炎症反应，抵消或部分抵消脱敏疫苗的功效，甚至引发其他过敏症状。陈德祥等在《过敏的临床免疫学》杂志曾发表论文，证明预防传染病的疫苗的常用佐剂，例如CpG基因序列，能够激发注射部位的炎症，促进抗原呈递细胞的成熟，不能够诱导免疫耐受。(An antigen-independent but not antigenspecific TH1response provides protection in themurine airway inflammation model.2004)

最近的研究表明，过敏免疫疗法，通过数年的一个疗程，诱导产生外周免疫耐受性。免疫耐受性主要是由一个特殊的T细胞亚群，称为T调节(Treg)细胞调节的。在生理状态下，Treg细胞通过避免对自身组织的免疫反应来维持体内平衡预防产生自身免疫性疾病。Treg细胞的另一个作用是，在成功消灭入侵的微生物后，关闭免疫反应。在过敏性免疫治疗的情况下，诱导产生了抗原特异性的Treg细胞，这些细胞可以抑制与过敏有关的Th2细胞的活性。在接受过敏免疫治疗的患者中，Treg细胞数量的增加与症状的改善呈正相关。陈德祥等在“疫苗”杂志发表的论文证明静脉注射蛋清白蛋白的短肽可以诱导产生CD4+CD25+的调节性T细胞和IL-10阳性的T cells，这些细胞在免疫耐受和脱敏治疗中起关键的作用(Peptide induces CD4(+)CD25+and IL-10+T cells and protection in airwayallergy models.2005)。基于此证据，一种有效的免疫治疗策略应该是诱导Treg细胞及其所主导的外周免疫耐受性。

发明内容

本发明提供了一种用于脱敏疫苗的佐剂及一种新型的脱敏疫苗。本发明的有益效果在于，本发明提供的佐剂能够迅速的诱导Treg细胞的产生来进行脱敏，在本发明的背景下，抗炎化合物作为佐剂使用，其作用不是缓解过敏或过敏性哮喘的症状，而是对致敏过程进行干预，从而从根本上治疗过敏。本发明所提供的脱敏疫苗，能够有效的诱导机体产生免疫耐受，用于治疗各种过敏、过敏性哮喘和其他免疫系统疾病。同时，过敏原和抗炎化合物都被传递到相同的位置，以达到抗炎化合物的佐剂效应和抗过敏免疫疗法的增强效果。

本发明发一种用于脱敏疫苗的佐剂，包括诱导免疫耐受的成分，所述诱导免疫耐受的成分为抗炎化合物。本发明所述抗炎化合物，作为过敏疫苗的一种成分，能够迅速并有效的诱导Treg细胞的产生来进行脱敏。作为脱敏疫苗的佐剂，与疫苗中的过敏原成分共同实现过敏症的长效治疗，并从发病机理的角度达到治疗效果，减轻过敏症状。即在本发明的背景下，抗炎化合物的作用与其在现有技术中的技术不同，其作用不是缓解过敏或过敏性哮喘的症状，而是作为一种“佐剂”来快速的达到脱敏的疗效，从根本上对过敏症进行治疗。

本发明所指的抗炎化合物是用于治疗组织受到损伤后所发生的反应炎症的药物，所述抗炎化合物具有减轻疼痛、消除发炎、消除肿胀等症状的作用，消除炎症及其症状。抗炎药有两大类：一类是甾体抗炎药或糖皮质激素，另一类是非甾体抗炎药，即医疗实践中所指的解热镇痛抗炎药如阿司匹林等。其中糖皮质激素类药物根据其血浆半衰期分短、中、长效三类。临床常用的糖皮质激素药物有：短效激素包括(如氢化可的松、可的松等)、中效激素包括(如泼尼松，泼尼松龙，曲安西龙强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松等)、长效激素包括(如地塞米松、倍他米松等)。目前常用的非甾体类抗炎药很多，大致可分为以下几种：(1)

水杨酸类：最常用的是乙酰水杨酸，即阿司匹林；(2)丙酸类：市场常见的品种有布洛芬、芬必得、萘普生等。(3)吲哚类：有吲哚美辛(消炎痛)、奇诺力(舒林酸)等；(4)灭酸类：有甲灭酸、氯灭酸、双氯灭酸和氟灭酸等；(5)乙酸类：以双氯芬酸钠，即扶他林为最常用；(6)喜康类：有炎痛喜康等，因其副作用很大，近来已很少使用。(7)吡唑酮类：有保泰松，羟基保泰松等。

有选的是，所述抗炎化合物包括甾体类抗炎化合物和/或非甾体类抗炎化合物。

上述任一项中优选的是，所述甾体类抗炎化合物包括糖皮质激素及其衍生物。

上述任一项中优选的是，所述糖皮质激素及其衍生物包括氟轻松醋酸酯(或称醋酸氟轻松，英文名成为fluocinonide)、皮质醇(或称氢化可的松，英文名成为Cortisol)、醋酸氢化可的松(英文名称hydrocortisone)、强的松(或称泼尼松，英文名称prednisone)、醋酸泼尼松(英文名称prednisolone)、甲基强的松龙(或称甲基泼尼松龙，英文名称methylprednisolone)、地塞米松(或称氟美松、醋酸地塞米松，英文名称dexamethasone)、倍他米松(英文名称betamethasone)、去炎松(或称氟羟氢化泼尼松、氟羟泼尼松龙、氟羟强的松龙，英文名称triamcinolone)、去炎松醋酸酯(或称曲安奈德、丙炎松、去炎松缩酮，英文名称triamcinolone acetonide)、倍氯米松(英文名称beclometasone)、醋酸氟氢可的松(英文名称fludrocortisone acetate)、醋酸去氧皮质酮(英文名称deoxycorticosteroneacetate)、醛固酮(或称醛甾酮，英文名称aldosterone)、丙酸氯倍他索(或称氯倍他索丙酸酯、丙酸氯氟美松，clobetasol propionate)、二丙酸倍他米松(英文名称betamethasonedipropionate)、丙酸乌倍他索(英文名称halobetasol proprionate)、醋酸双哈西奈德(英文名称diflorasone diacetate halcinonide)、安西奈德(或称安西缩松，英文名称amcinonide)、莫米松糠酸酯(或称糠酸莫米松，英文名称mometasone furoate)、丙酸氟替卡松(或称氟替卡松丙酸酯，英文名称fluticasone propionate)、肤轻松醋酸酯(或称肤轻松、氟新诺龙丙酮，英文名称fluocinolone acetonide)、氟尼缩松(或称9-去氟肤轻松，英文名称flunisolide)、布地奈德(或称布地缩松，英文名称budesonide)、二丙酸倍氯米松(或称二丙酸氯地米松，英文名称beclomethasone dipropionate)的至少一种。

上述任一项中优选的是，所述非甾体类抗炎化合物包括布洛芬、塞来考昔(或称塞来昔布，英文名称celecoxib)、阿司匹林、吲哚美辛(或称消炎痛，英文名称indomethacin)、双氯芬酸(英文名称diclofenac)、萘普生钠、舒林酸(英文名称sulindac)、奥沙普秦(或称丙嗪，英文名称oxaprozin)、双水杨酯(或称水杨酰水杨酸、水杨酸水杨酸酯，英文名称salsalate)、二氟尼柳(或称二氟苯水杨酸，英文名称diflunisal)、吡罗昔康(英文名称piroxicam)、依托度酸(或称乙哚乙酸，英文名称etodolac)、美洛昔康(英文名称meloxicam)、萘布美酮(或称萘丁美酮、奈丁美酮、萘纳布美酮，英文名称nabumetone)、酮咯酸氨丁三醇(英文名称ketorolac tromethamine)、埃索美拉唑(英文名称esomeprazole)中的至少一种。

本发明还提供了一种新型脱敏疫苗，包括过敏原和佐剂，所述佐剂为上述任一项所述的佐剂。

有选的是，所述过敏原包括过敏原提取物、重组过敏原蛋白、合成的过敏原多肽、基于核酸的过敏原中的至少一种。

上述任一项中优选的是，所述过敏原提取物包括草花粉、树花粉、室内尘螨、坚果、动物皮屑、昆虫毒液的至少一种。

上述任一项中优选的是，所述合成的过敏原多肽包括使用合成化学和/或基因工程产生的肽。

上述任一项中优选的是，所述基于核酸的过敏原包括含有过敏原的DNA和/或RNA编码序列的裸DNA和/或RNA分子。

上述任一项中优选的是，其特征在于，所述过敏原和所述佐剂分装，在使用时分别在同一部位施药；或者所述佐剂与所述过敏原预混在一起，一次性施药。

上述任一项中优选的是，所述施药部位含有大量未成熟的抗原呈递细胞，所述未成熟的抗原呈递细胞包括树突状细胞和朗格汉斯细胞。

上述任一项中优选的是，所述施药部位包括口腔、鼻腔粘膜以及皮肤的至少一处。

上述任一项中优选的是，所述脱敏疫苗的施药方式包括表皮注射、舌下含服和喷鼻施药的至少一种。

上述任一项中优选的是，所述表皮注射包括微针注射或纳米针注射。

上述任一项中优选的是，所述舌下含服包括舌下滴液或舌下速溶药剂含服。

上述任一项中优选的是，所述脱敏疫苗的施药方式不包括皮下注射、肌肉注射或静脉注射。

上述任一项中优选的是，所述脱敏疫苗为液体制剂、冻干速溶片剂、压缩的速溶片剂、微针递药固体制剂、微针递药液体制、纳米针递药液体制剂或纳米针递药固体制剂的至少一种。

本发明提供了一种免疫治疗过敏和过敏性哮喘的脱敏疫苗的佐剂。本发明还涉及到应用该佐剂的脱敏疫苗的配方、和传药技术，实现了迅速的诱导外周免疫耐受和脱敏效果。通过本发明提供了一种利用本发明所述的脱敏疫苗诱导免疫耐受的方法，用于治疗各种过敏、过敏性哮喘和其他免疫系统疾病。本发明涉及多类抗炎化合物(如糖皮质激素或其衍生物)与过敏原的配方，及其在治疗过敏和过敏性哮喘的应用。所述脱敏疫苗可以通过舌下、皮内或皮肤上的途径来施药。本发明提供的脱敏疫苗可以长期缓解过敏和过敏性哮喘的症状，并可防止过敏性鼻炎的疾病向哮喘的发展。

在本发明的背景下，抗炎化合物不用于缓解过敏或变应性哮喘的症状。在现有技术中，传统佐剂具有免疫刺激性，传统疫苗正是利用其这一作用实现对疾病的免疫。本发明所述佐剂使用的是抗炎化合物，这些抗炎化合物通常具有免疫抑制特性，因此传统意义上的佐剂作用相反。在药物治疗应用中，抗炎化合物被用来缓解持续的炎症。本发明将抗炎化合物作为佐剂与过敏原共同注射，以防止过敏疫苗在该部位发生炎症；同时，所述抗炎化合物具有抑制抗原呈递细胞成熟的作用，抗炎化合物直接作用于抗原呈递细胞，抑制它们在抗原摄取和呈递过程中成为成熟的细胞；同时，抗炎化合物通过迅速诱导Treg细胞的生成实现了对过敏症的长效治疗。

本发明的一个方面特点是过敏原与佐剂在同一部位施药。包括在同一配方中含有过敏原和抗炎化合物，一次性施药；或者，过敏原和抗炎化合物储存在不同的容器中，分两个步骤在同一部位施药，例如首先应用过敏原，然后将抗炎化合物应用于同一部位(舌下或皮肤表层)。这是本发明所述脱敏疫苗在应用过程中很重要的一点，过敏原和抗炎化合物都被传递到相同的位置，以达到抗炎化合物的佐剂效应和抗过敏免疫疗法的增强效果。将过敏原和抗炎化合物分别单独施药到不同的部位，则无法产生两个成份的协同作用和治疗效果。

本发明还提供了所述脱敏疫苗的施药部位，具体的说，施药的组织中，必须有大量未成熟的抗原呈递细胞，即树突状细胞和朗格汉斯细胞。并且这些组织不利于药物的迅速扩散。该类组织包括口腔和鼻腔粘膜以及皮肤。抗炎化合物直接作用于抗原呈递细胞，抑制它们在抗原摄取和呈递过程中成为成熟的细胞。然而，疫苗成分不应该被送到炎症组织中，那里可能没有不成熟的抗原呈递细胞。另外，皮下注射，肌肉注射，静脉注射用导致抗炎化合物和过敏原的迅速扩散和分离，无法达到预期的疗效。

附图说明

图1作为本发明优选实施例1的一种新型脱敏疫苗的抑制皮肤细胞炎性的细胞因子变化水平。

图2作为本发明优选实施例3的一种新型脱敏疫苗减少小鼠呼吸道炎症的嗜酸性粒细胞的变化水平。

图3作为本发明优选实施例3的一种新型脱敏疫苗减少小鼠呼吸道炎症的细胞因子变化水平。

图4作为本发明优选实施例5的一种新型脱敏疫苗舌下施药进行脱敏治疗后嗜酸性粒细胞数量的变化水平。

图5作为本发明优选实施例6的一种新型脱敏疫苗治疗卵清白蛋白致敏小鼠模型Treg细胞占T细胞总数的比例。

图6作为本发明优选实施例6的一种新型脱敏疫苗治疗卵清白蛋白致敏小鼠模型卵清白蛋白体外刺激下脾细胞的繁殖指数。

图7作为本发明优选实施例6的一种新型脱敏疫苗治疗卵清白蛋白致敏小鼠模型T细胞共培养繁殖计数。

图8作为本发明优选实施例6的一种新型脱敏疫苗治疗卵清白蛋白致敏小鼠模型腹腔免疫后血液中对卵清白蛋白的IgG抗的滴度。

图9作为本发明优选实施例13非甾体类抗炎化合物对尘螨提取物在小鼠的尘螨过敏模型中对肺内嗜酸性粒细胞数量水平的影响。

图10作为本发明优选实施例13非甾体类抗炎化合物对尘螨提取物在小鼠的尘螨过敏模型中对肺内IL-5细胞因子水平的影响。

具体实施方式

本发明可通过结合如下实施例进一步论述，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅为了更好阐述本发明，而非对发明内容进行限制。本发明所使用的试剂或材料均采购自生物药剂公司或为现有的医学使用的药物。

实施例1

实施例1中的脱敏疫苗配方为含有糖皮质激素(醋酸地塞米松)和蛋清白蛋白，将所述疫苗施药于皮肤局部，可以抑制皮肤细胞的炎性细胞因子生产。如图1所示，为在施药的部位皮肤所产生的促炎症细胞因子的水平。实施例1中，脱敏治疗组的施药含蛋清白蛋白和糖皮质激素；标准治疗组的施药只含蛋清白蛋白；未处理组的施药为生理盐水。

实施例1的试验使用6到8周大的雌性Balb/c小鼠。小鼠的腹部皮肤毛发剃光，休息24小时。对脱敏治疗组小鼠，将糖皮质激素(0.1％的油膏)应用于脱毛的皮肤；第二天，将蛋清白蛋白的液体用棉球涂抹于同一部位的皮肤表层-皮肤可以是完整的或砂纸处理的表皮层。在同一部位马上涂抹糖皮质激素。为了便于比较，本实验还包括了两个对照组。第一个对照组是标准治疗组，即涂抹蛋清白蛋白(不含糖皮质激素)，其它处理方法与实验组相同。第二个对照组是未处理组(只接受皮肤脱毛和及局部涂抹生理盐水，无过敏原)。

在施药48小时后采集每只老鼠的腹部皮肤样本，并冷冻在液氮中。皮肤样本在PBS+0.1％的tween-20中被捣碎成粉末和磨淬。均质化后离心，收集上层清液并储存在-80℃等待分析。用Becton-Dickinson的试剂盒(BD生物科学,圣地亚哥,CA)分析上层清液的炎性细胞因子和Th1/Th2细胞分泌的细胞因子(Th1细胞即1型T)。测量细胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)α-干扰素(IFN-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等。以下细胞因子的水平在脱敏治疗组、标准治疗组和未处理组之间无显著差异:IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFN-γ，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFN-γ与炎症反应无关。根据图1的结果显示，与标准治疗和未治疗的对照组比较，利用过敏原和糖皮质激素处理的脱敏治疗组显著降低了TNF-α、IL-6和MCP-1细胞因子的产生。三种细胞因子都与巨噬细胞和单核细胞渗透的局部炎症有关。本实施例所提供的疫苗在施药部位抑制了这些细胞因子，从而起到防止抗原呈递细胞成熟的作用，未成熟的抗原呈递细胞有利于诱导免疫耐受，从而达到抑制过敏的效果。

α-肿瘤坏死因子(TNF-α)是一个关键的炎症细胞因子并具有免疫增强功能。它通过提高共刺激分子CD80和CD86表达水平，促进未成熟的树突细胞和Langerhans细胞成熟。抑制α-肿瘤坏死因子的分泌在免疫接种可以预防局部炎症，防止抗原提呈细胞成熟。如图1所示，在本实施例中，脱敏治疗组的TNF-α水平显著低于标准治疗组，说明实施例1的脱敏疫苗模型能够防止抗原提呈细胞成熟，进而实现脱敏疗效。

MCP-1，也叫chemokine ligand 2(CCL2)，属于CC趋化因子家族。MCP-1将单核细胞和其他炎症细胞招募到由组织损伤或感染产生的炎症部位。CCL2与多种疾病的病因有关，如银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化等。如图1所示，本实施例中，脱敏治疗组MCP-1显著低于标准治疗组，有效的抑制了单核细胞和其他炎症细胞侵入到炎症部位，抑制炎症反应，有利于实现脱敏治疗。

实施例2

实施例2建立了小鼠的尘螨过敏和脱敏治疗模型。

本试验使用6到8周的雌性C57BL/6小鼠(Charles River,Wilmington,MA)或Balb/c小鼠(Charles River)。小鼠的过敏模型涉及致敏和攻毒两个步骤。致敏的步骤是在小鼠腹腔注射50μg屋尘螨提取物(吸附在1毫克氢氧化铝的表面)。注射量为0.5毫升。14天后攻毒。攻毒的步骤是在小鼠气管内的喷10μg HDM(HDM为尘螨提取物)进入到肺部。48小时在重复攻毒一次。在第二次攻毒的24小时后，使用二氧化碳将老鼠安乐死亡。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，进行各类细胞的计数和细胞因子分析，并收集肺组织进行切片染色检查。

小鼠死亡以后，肺部用1毫升无菌盐水冲洗3次。将肺部灌洗液离心，在-80℃保存上清液，用于后续的细胞因子分析。将沉淀的细胞用磷酸盐缓冲液重新悬浮。通过TrypanBlue染色，用血细胞计数对肺部灌洗液中的计算细胞总数。取2万5千个细胞用旋转离心机把细胞摔在显微镜载玻片上，用Diff-Quik染色(Dade Behring,Newark,DE)。用光学显微镜对各类细胞计数，计算嗜酸性粒细胞在所有细胞中占的百分数。根据制造商的说明(BDBiosciences,San Diego,CA)，将肺部灌洗液上清中的Th1和Th2细胞因子用酶联免疫反应进行定量。

致敏的未治疗的小鼠，嗜酸性粒细胞在肺部灌洗液中占细胞总数的约30-60％。嗜酸性粒细胞浸润到肺部是过敏反应的一个明显的标志，同时伴随着以下细胞因子水平的大幅度提高，包括IL-4、IL-5、TNF-α和IFN-γ(图3所示)。IL-4细胞因子的大量存在表明是Th2细胞主导的的免疫反应，标志着过敏及其有IL-5细胞因子与嗜酸性粒细胞浸润进入肺内。TNF-α和IFN-γ导致肺内存在炎症细胞如单核细胞、巨噬细胞和T细胞在炎性肺。

实施例3

实施例3利用含有糖皮质激素和室内尘螨提取物的脱敏疫苗，对实施2得到的致敏小鼠通过免疫疗法进行过敏症状的治疗，有效的减少了尘螨诱发的小鼠呼吸道炎症。如图2所示为在尘螨的小鼠模型中，脱敏治疗对肺内侵入肺内的嗜酸性粒细胞的影响。脱敏治疗组的施药含尘螨提取物的过敏原和糖皮质激素，标准治疗组的施药只含尘螨提取物，未处理组的施药为生理盐水。通过使用含有糖皮质激素和室内尘螨标准提取物的脱敏疫苗，利用免疫疗法减了小鼠呼吸道炎症，尤其是肺内的嗜酸性粒细胞数量的减少。图3所示为在尘螨的小鼠模型中，脱敏治疗对肺内细胞因子的影响。脱敏治疗组的施药含尘螨提取物的过敏原和糖皮质激素。标准治疗组的施药只含尘螨提取物。未处理组的施药为生理盐水。在实施例3中，糖皮质激素优选为醋酸地塞米松，但是本发明并不局限于此。

在第1天，按上述例2的方法对Balb/c小鼠进行尘螨提取物(吸附到氢氧化铝)致敏。在第3和17天,老鼠接受脱敏治疗。免疫制剂包含10μg屋尘螨提取物，并在免疫治疗的前一天和当天在同一部位的皮肤表面涂抹glucocorticoid-containing油膏(0.1％醋酸地塞米松)。

将两个对照组作为比较。动物在标准的治疗控制中接受了皮肤脱毛，局部分别使用生理盐水或尘螨提取物(无glucocorticoid)。对照组的动物在同一时间内接受皮肤剃须及局部应用生理盐水(无尘螨)。

在第31天和第33天，所有动物都受到了室内尘螨提取物的攻毒。第34天收集了肺部清洗液，然后采集肺叶做组织切片检查。用实施例2所述的方法，测量肺部清洗液中的细胞因子和嗜酸性粒细胞。

图2中的结果证明了脱敏疫苗对嗜酸性粒细胞浸润肺部的保护作用。在未经治疗的对照组中，嗜酸性粒细胞占侵入细胞总数的56％。嗜酸性粒细胞浸润到肺部是过敏反应的一个标志。在没有glucocorticoid佐剂的情况下，单独使用尘螨提取物的标准治疗没有降低嗜酸性粒细胞的侵入；接受本发明提供的脱敏疫苗进行脱敏治疗的小鼠，其肺内清洗液中只有2％的嗜酸性粒细胞。

图3的数据说明了脱敏治疗与过敏反应相关的炎症细胞因子的变化。未经处理的小鼠的肺内清洗液中有大量的细胞因子，包括IL-4,IL-5,TNF-α和IFN-γ等，表明这些小鼠有典型的过敏反应。仅用尘螨提取物的治疗，对呼吸道内炎性细胞因子的水平没有影响。然而，有脱敏治疗大大降低了呼吸道内所有4种细胞因子的水平。

采集的肺叶经过切片，染色，和显微镜检查发现，用本发明所提供的脱敏疫苗进行脱敏治疗的小鼠肺没有炎症细胞浸润。然而，致敏的小鼠肺叶组织含有大量的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和红细胞。显示出典型的过敏反应引起气道炎症的标志。标准治疗的小鼠的肺有同样的的炎症细胞侵入。

以上结果表明，实施例3中采用过敏原和糖皮质激素形成的脱敏疫苗，能够有效的减少了尘螨诱发的小鼠呼吸道炎症。

实施例4

通过实施例4，证明脱敏疗效需要尘螨提取物和糖皮质激素(醋酸地塞米松)在同一个部位施药。

BALB/c小鼠(每组8只)在第1天用氢氧化铝吸附的尘螨提取物致敏(方法同实施例2)。第3日和17日，分别在小鼠的腹部剃去毛发的同一皮肤表面涂抹10微克的尘螨提取物和含0.1％醋酸氟轻松乳膏。对照组动物在腹部皮肤上涂屋尘螨提取物，背部皮肤含含糖皮质激素的乳膏。未经处理的对照组动物在腹部皮肤局部应用生理盐水(无尘螨提取物)。

第31日和33日，所有的动物都接受气管喷雾的尘螨攻毒。在第34天收集肺灌洗液，按实施例2所描述的方法计算灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量。

在腹部同一部位接受尘提取物和糖皮质激素治疗的动物的灌洗液中只有3.4±3.4％嗜酸性粒细胞。在腹壁皮肤接受尘螨提取物在背部皮肤接受糖皮质激素处理的对照组动物的肺灌洗液中有37.1±8.0％的嗜酸性粒细胞，与使用生理盐水处理的对照组无显著性差异(41.1±4.8％)。

这一结果表明，利用本发明提供的脱敏疫苗进行的脱敏治疗，只有当把过敏原和糖皮质激素传递到相同的部位时才能有效的抑制过敏的发生。

实施例5

实施例5通过在小鼠舌下施药，诱导免疫耐受和脱敏。图4显示了，在小鼠的尘螨过敏模型中，舌下脱敏治疗对肺部灌洗液中嗜酸性粒细胞数量的影响。实施例5采用的脱敏疫苗包括尘螨提取物(过敏原)和丙酸氟替卡松，脱敏治疗组的施药含尘螨提取物的过敏原和糖皮质激素，标准治疗组的施药只含尘螨提取物，安稳剂组的施药包括尘螨提取物的过敏原和糖皮质激素以外的所有配方的成份，未处理组的施药为生理盐水。

在本实施例中，所有的小鼠在第一天接受致敏处理。即腹腔注射50微克的尘螨提取物(吸附在0.5毫克氢氧化铝)。第7,14，21天，分别于脱敏治疗组、标准治疗组、安稳剂对照组的小鼠舌下点滴10μL脱敏药(其中脱敏药的组成为：脱敏治疗组为含有10微克尘螨提取物和10微克丙酸氟替卡松的脱敏疫苗、标准治疗组为10微克尘螨提取物过敏原、安稳剂治疗组为安稳剂)。本实施例中优选的是，脱敏治疗组的脱敏药含有过敏原、丙酸氟替卡松、卡波姆941、Pluronic 127和壳聚糖。卡波姆941、Pluronic 127和壳聚糖，这三种混合成份通过延长疫苗在施药部位的停留时间，增加疫苗的吸收量和提高治疗的效果。具体的，本实施例脱敏治疗组使用的脱敏药的组成为：每10微升脱敏药包含10微克尘螨提取物、2.5微克丙酸氟替卡松、5微克卡波姆941、50微克Pluronic 127和5微克壳聚糖。安稳剂的组成为除脱敏疫苗和丙酸氟替卡松外的所有成分。

第35和37天，所有的动物都接受气管攻毒，把10微克的尘螨提取物喷入肺内。在第38天收集收集肺灌洗液进行灌洗液中嗜酸性粒细胞计数，如图4所示。脱敏治疗引起嗜酸性粒细胞显著减少。与致敏但没有接受任何处理的动物相比，用尘螨提取物单独处理(无丙酸氟替卡松)或安稳剂，没有显著减低对嗜酸性粒细胞的数量。

结果表明，本发明提供的脱敏疫苗通过舌下滴服的方式能够达到治疗过敏的效果。

实施例6

实施例6中，利用卵清白蛋白致敏的小鼠模型对免疫耐受机制进行了研究。利用本发明提供的新型脱敏疫苗，诱导了免疫耐受并诱导抗原特异性的调节性T细胞(Treg细胞，即CD4+CD25+T细胞)的数量增加和激活。实施例6优选的佐剂为醋酸地塞米松，过敏原成分为卵清白蛋白(OVA)。其中，图5所示为在不同的处理状况下，小鼠脾内调节性T细胞(CD4+CD25+T细胞)所占T细胞总数的比例；图6所示为脾细胞在体外用卵清白蛋白刺激后的繁殖指数；图7所示为在T细胞的共培养中(脱敏处理组的递倍增加的脾细胞与固定数量致敏小鼠的脾细胞共同培养，比例如图中所示)，并用卵清白蛋白刺激后的繁殖结果，所示数据是放射性同位素标记的胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷)计数；图8所示为经过图中标明的不同的处理的小鼠接受腹腔免疫后(吸附在氢氧化铝上的卵清白蛋白)，血液中对卵清白蛋白的IgG抗体的滴度，在外周免疫耐受的情况下(如脱敏组)，动物产生抗体的能力减低。

在第1天和14天，在小白鼠(每组10只)的腹部皮肤上接种模拟过敏原--卵清白蛋白(OVA)和糖皮质激素(GC，即醋酸地塞米松)治脱敏治疗。标准治疗组的对照组只用卵清蛋白(OVA)处理。在第28天，每组动物各取5只用二氧化碳安乐死亡，用抗体标记进行T细胞的测定。OVA+GC处理的动物的CD4+CD25+T细胞(图5)在CD4+T细胞中的数量增加了2％至3％。这些动物的脾细胞在体外OVA刺激，增殖不明显(图6)。另外，伴刀豆球蛋白A刺激后的繁殖指数在60以上，说明，脱敏组的免疫耐受是对特定抗原的，及抗原特异性的。并且，在T细胞共培养试验中抑制致敏动物(已被注射到氢氧化铝吸附的OVA)的脾细胞的增殖(图7)。相反，从OVA单独免疫小鼠(没有GC)的脾细胞中，在CD4+CD25+T细胞的数量与未处理的的对照组比没有增加，并没有抑制致敏动物的脾细胞的增殖(图7)。

对每组剩余的5只小鼠和5只新的的小鼠(致敏组)腹腔注射50微克的OVA(吸附0.5毫克氢氧化铝)。在第42天收集这些动物的血清样本，用酶联免疫方法法检测OVA特异性IgG抗体滴度(图8)。OVA+GC处理的动物的抗体滴度显著低于OVA处理的动物和未经处理的动物。证明用OVA和GC处理的动物产生了外周免疫耐受。

上述试验的结果证明，糖皮质激素作为一种免疫调节剂诱导抗原特异性免疫耐受，通过诱导免疫原特异性的调节性T细胞(Treg细胞)的数量增加，并激活和提高Treg细胞的功能而快速达到治疗过敏的作用。

实施例7

实施例7中，将1-2000微克的过敏原与1-200微克的抗炎化合物结合。

抗炎化合物选用：醋酸地塞米松、曲安奈德；施药方式选用：表皮施药，优选采用微针施药。

实施例7与实施例1至6相似，不同之处在于施药的部位和方式，实施例7提供的脱敏疫苗对于过敏症也具有有效的治疗效果。

实施例8

实施例8中，将1-2000微克的过敏原与1-200微克的抗炎化合物结合。

抗炎化合物选用：丙酸氟替卡松或beclomethasone dipropionate(倍氯米松或倍氯美松双丙酸酯)；施药方式选用：舌下滴服、舌下速溶片剂含服或喷鼻施药至少一种方式。

实施例8与实施例1至6相似，不同之处在于施药的部位和方式，实施例7提供的脱敏疫苗对于过敏症也具有有效的治疗效果。

实施例9

实施例9与实施例1至8相似，不同之处在于，其过敏原材料包括以下成分的至少一种：过敏原提取物、重组过敏原蛋白、合成过敏原多肽、DNA或RNA编码的过敏原。

所述过敏原提取物包括草花粉、树花粉、室内尘螨、坚果、动物皮屑、昆虫毒液的至少一种。所述合成的过敏原多肽包括使用合成化学和/或基因工程产生的肽。所述基于核酸的过敏原包括含有过敏原的DNA和/或RNA编码序列的裸DNA和/或RNA分子。

实施例10

实施例10与实施例1至9相似，不同之处在于，所述脱敏疫苗的形态为液体制剂、冻干、压缩的速溶片剂、用微针及纳米针递药的液体或固体制剂。

根据脱敏疫苗采用以下药剂形态并采用相应的给药方式：

优选的是，通过舌下途径传递的脱敏疫苗，优选配方为滴液或喷雾。

优选的是，将过敏原和抗炎化合物作通过冻干或压缩方法做成片剂(如快速溶解片)。药片可以放在病人的舌头下面含化。

优选的是，在一种温度响应的聚合物配方中形成混合配方。这些配方可以使用多种聚合物(壳聚糖、羟丙基纤维素、聚(n-异丙基丙基酰胺)、聚(乙烯基丙烯酯)或聚乙烯甲基醚(聚乙烯甲基醚)。本申请中，温度响应的聚合物是指疫苗在30℃以下保存期间为液体，施药后当接触到37℃的体温时，配方从液体变成粘性凝胶。采用温度响应的聚合物配方其有益效果为粘性凝胶在施药部位长时间停留，增加了疫苗的吸附和治疗的效果。

优选的是，通过皮肤途径传递脱敏疫苗，抗炎化合物和过敏原的共同配方可以做成水溶液、凝胶、软膏或干粉。

优选的是，通过皮肤途径传递脱敏疫苗，采用表皮直接施药或者使用一种注射技术，如常用的针头注射，或各种微针或纳米针片。

实施例11

实施例11与实施例1至10相似，不同的是，采用糖皮质激素氟辛尼奈德作为佐剂与室内尘螨的标准提取液共同使用，治愈室内尘螨在动物模型引起的过敏反应。在一起使用时，抗炎化合物增强了过敏疫苗中过敏原成分的功效。

实施例12

实施例12与实施例1至实施例11相似，不同之处在于采用非甾体类抗炎化合物作为佐剂。非甾体类抗炎化合物与糖皮质激素同样具有消炎、止痛、消除肿胀等消除炎症反应症状的作用。将非甾体类抗炎化合物作为佐剂与过敏原共同注射，能够防止过敏疫苗在该部位发生炎症；抑制抗原呈递细胞成熟的作用；诱导Treg细胞的生成并激活Treg细胞，诱导产生免疫耐受，达到对过敏症的治疗的效果。实施例12使用的非甾体类抗炎化合物包括：(1)

水杨酸类：最常用的是乙酰水杨酸，即阿司匹林；(2)丙酸类：市场常见的品种有布洛芬、芬必得、萘普生等。(3)吲哚类：有吲哚美辛(消炎痛)、奇诺力(舒林酸)等；(4)灭酸类：有甲灭酸、氯灭酸、双氯灭酸和氟灭酸等；(5)乙酸类：以双氯芬酸钠，即扶他林为最常用；(6)喜康类：有炎痛喜康等。(7)吡唑酮类：有保泰松，羟基保泰松等。具体来说，包括布洛芬、塞来考昔(或称塞来昔布，英文名称celecoxib)、阿司匹林、吲哚美辛(或称消炎痛，英文名称indomethacin)、双氯芬酸(英文名称diclofenac)、萘普生钠、舒林酸(英文名称sulindac)、奥沙普秦(或称丙嗪，英文名称oxaprozin)、双水杨酯(或称水杨酰水杨酸、水杨酸水杨酸酯，英文名称salsalate)、二氟尼柳(或称二氟苯水杨酸，英文名称diflunisal)、吡罗昔康(英文名称piroxicam)、依托度酸(或称乙哚乙酸，英文名称etodolac)、美洛昔康(英文名称meloxicam)、萘布美酮(或称萘丁美酮、奈丁美酮、萘纳布美酮，英文名称nabumetone)、酮咯酸氨丁三醇(英文名称ketorolac tromethamine)、埃索美拉唑(英文名称esomeprazole)等。

实施例13

实施例13选用3种不同的非甾体类抗炎化合物，实验表明非甾体类抗炎化合物作为佐剂使用，对尘螨提取物在小鼠的尘螨过敏模型具有抑制过敏反应，缓解过敏症状的作用。实施例13采用的脱敏疫苗包括尘螨提取物(过敏原)和非甾体类抗炎化合物，所述非甾体类抗炎化合物包括阿司匹林、布洛芬或舒林酸的至少一种。脱敏治疗组的施药采用本实施例所述的脱敏疫苗，标准治疗组的施药只含尘螨提取物，致敏组施药为生理盐水，未处理组的正常小白鼠是阴性对照。

除未处理组外，其余的小鼠在第一天接受致敏处理。即腹腔注射50微克的尘螨提取物(吸附在0.5毫克氢氧化铝)。第7,14，21天，分别于脱敏治疗组、标准治疗组、安稳剂对照组的小鼠舌下点滴10μL脱敏药(各试验组脱敏药的组成为：标准治疗组为10微克尘螨提取物，脱敏治疗组为尘螨提取物和非甾体类抗炎化合物，安稳剂对照组为生理盐水)。本实施例优选的是，在脱敏治疗组每10微升脱敏药包含10微克尘螨提取物、2.5微克非甾体类抗炎化合物(阿司匹林、布洛芬或舒林酸)、5微克卡波姆941、50微克Pluronic 127和5微克壳聚糖。卡波姆941、Pluronic 127和壳聚糖混合成份通过延长疫苗在施药部位的停留时间，增加疫苗的吸收量和提高治疗的效果。施药的途径为舌下。第35和37天，所有的动物都接受气管攻毒，把10微克的尘螨提取物喷入肺内。

在第38天收集肺灌洗液，进行灌洗液中嗜酸性粒细胞计数。如图9所示，脱敏治疗组引起嗜酸性粒细胞显著减少。与致敏但没有接受任何处理的动物相比，用尘螨提取物单独处理或用生理盐水处理没有显著减低嗜酸性粒细胞的数量。如图9所示，将阿司匹林、布洛芬或舒林酸作为脱敏疫苗的佐剂使用的脱敏治疗组嗜酸性粒细胞的数量显著降低，说明将阿司匹林、布洛芬或舒林酸作为脱敏疫苗的佐剂使用，能够有效缓解过敏症状。

在第38天收集肺灌洗液进行IL-5细胞因子定量分析。如图10所示，致敏组和标准治疗组的小鼠肺内含有大量的IL-5细胞因子，而将阿司匹林、布洛芬或舒林酸作为脱敏疫苗的佐剂使用的脱敏治疗组，IL-5细胞因子水平显著降低。IL-5作为过敏的象征，其水平的降低说明将阿司匹林、布洛芬或舒林酸作为脱敏疫苗的佐剂使用，能够有效缓解过敏症状。

IL-5的主要功能是刺激嗜酸性粒细胞增殖、分化及活化，人类IL-5还能促进嗜碱性粒细胞释放组胺和白三烯等炎症介质，从而提高嗜碱性粒细胞的活性。本实施例采用非甾体类抗炎化合物可有效抑制IL-5的产生，抑制炎症反应同时抑制嗜酸性粒细胞的增殖及活化。

实施例13表明，以阿司匹林、布洛芬或舒林酸等非甾体类抗炎化合物作为佐剂的脱敏疫苗，具有缓解过敏反应的作用，能够达到治疗过敏症的效果。

Claims (2)

1.一种脱敏疫苗，其特征在于，包括过敏原和佐剂，

所述的脱敏疫苗为舌下滴服型疫苗；

所述的过敏原为过敏原提取物；

所述的佐剂包括：甾体类抗炎化合物或非甾体类抗炎化合物、卡波姆941、pluronic127、壳聚糖；

所述的甾体类抗炎化合物为：丙酸氟替卡松；

所述的非甾体类抗炎化合物为：布洛芬或舒林酸。

2.根据权利要求1所述的脱敏疫苗，其特征在于，

每10ul疫苗中含有：

(1)10ug的尘螨提取物；

(2)2.5ug的丙酸氟替卡松，或2.5ug的布洛芬，或2.5ug的舒林酸；

(3 )5ug的卡波姆941、50ug的pluronic127、5ug的壳聚糖。

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