CN108096240B - 一种治疗肺纤维化的中药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了银杏内酯组合物在制备治疗肺组织纤维化药物中的应用。通过实验证明银杏内酯组合物剂量依赖性改善提高小鼠生存率、改善小鼠肺组织病变，降低肺组织内羟脯氨酸含量，从而达到治疗肺组织纤维化的作用。因此，银杏内酯组合物具有制备成治疗肺组织纤维化药物的作用与应用价值。

Description

一种治疗肺纤维化的中药组合物

技术领域

本发明属于涉及医药技术领域，特别是涉及银杏内酯组合物在治疗肺组织纤维化中的应用。

背景技术

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是由于正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常导致的疾病，以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征。肺纤维化以特发性肺组织纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)最为常见，临床表现为干咳、进行性呼吸困难，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化，由于氧不能进入血液，患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力、靠呼吸机生存，最后衰竭、死亡。特发性肺纤维化发病率和死亡率较高，诊断后的平均生存期约为2.8年，死亡率高于大多数肿瘤。

PF的发病机制目前尚未完全明了，肺上皮损伤是引起肺纤维化的重要因素之一，肺部受感染或损伤后，首先肺泡上皮细胞和(或)血管内皮细胞受损，增生的上皮细胞和受损的血管内皮细胞产生大量的细胞因子，刺激炎症细胞的聚集、活化和一系列的连锁反应。巨噬细胞的活化，炎症细胞聚集和活化最终导致大量纤维细胞增生和胶原产生是目前发现的机制。

到目前为止，几乎没有哪种药物被证明能够治愈肺纤维化，目前常用的药物是吡非尼酮和肾上腺皮质激素类药物，吡非尼酮主要通过降低血小板衍生生长因子水平和抑制胶原的合成来控制病情，能够有效延长病人的生存时间，改善生存质量，肾上腺皮质激素主要通过抑制炎症减缓病情的发展。

肺组织纤维化动物模型造模方法主要有博来霉素、百草枯肺部灌注等。采用博来霉素造模是建立肺组织纤维化模型常用的方法。银杏叶提取物是目前国际上使用最为广泛的中药提取物之一，其中银杏内酯是银杏叶提取物及其制剂主要的药效活性成分，目前还未见银杏叶提取物能对肺组织纤维化具有治疗或预防作用的相关报道。

发明内容

本发明以在小鼠模型上进行验证的方式对银杏内酯组合物进行研究，旨在得到一种具有治疗或预防肺组织纤维化的银杏内酯组合物。

由此，本发明提出了一种银杏内酯组合物在制备治疗肺组织纤维化药物中的应用。

进一步地，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40)：(50～75):(0.2～5)。进一步，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35)：(50～70):(0.5～4)。更进一步，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30)：(50～65):(0.8～4)。

优选地，在上述组合物中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为20:50:5。更优选地，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为30:75:0.2。

进一步地，所述治疗肺组织纤维化药物还包括药学上可接受的辅料。

具体地，所述治疗肺组织纤维化药物选自口服给药剂型、注射给药剂型、吸入给药剂型。

具体地，当银杏内酯组合物选自口服给药时，经换算，其治疗有效量推荐为3.93-15.72mg·kg^-1/d以上。需要注意的是，该治疗有效量作为推荐剂量并不对剂量范围产生严格限制。本领域人员能理解，实际给药的用量可能低于上述剂量范围。针对某一对象的治疗有效量和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括给药对象的年龄、体重、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程、医生的判断。此外，本发明所述银杏内酯组合物可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。

所述治疗，可以是包括预防在内的一切有益于改善患者肺纤维化症状的方式，本领域技术人员可以根据本发明的组合物所具有的治疗肺组织纤维化的作用，合理推测出其可能也具有相应的预防作用。

进一步地，银杏内酯组合物可以制备成胶囊剂、片剂、粉针剂、透皮剂等等。

本发明通过肺部灌注博来霉素建立肺组织纤维化小鼠模型，给予银杏内酯组合物治疗后发现银杏内酯组合物剂量依赖性改善小鼠的肺部病变，提高小鼠生存率，降低肺系数，降低肺组织的羟脯氨酸水平等。因此，实验证实银杏内酯组合物具有治疗肺组织纤维化的作用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式的内容仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。

实施例1银杏内酯组合物和吡非尼酮溶液的配制

1.药物

(1)原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制，具体如下；

(2)吡非尼酮标准品购于Sigma公司。

2.试剂的配制

(1)0.9％氯化钠溶液(生理盐水)；称取氯化钠4.5g，加蒸馏水至500mL,完全溶解，灭菌后于4℃保存备用。

(2)将银杏内酯按比例组合用生理盐水配成0.131、0.262、0.524、0.393、0.786、1.572mg/ml。

(3)将吡非尼酮用生理盐水配成5mg/ml。

(4)羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒购于Solarbio公司。

实施例2银杏内酯组合物注射给药对博来霉素肺部灌注小鼠模型的保护作用

1.材料与方法

1.1.动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠，购于青龙山实验动物中心；

1.2试剂

(1)博来霉素购于Sigma公司；生理盐水购于金健药业有限公司。

(2)PBS缓冲液:将8.0gNaCl，0.2gKCl、3.62gNa₂HPO₄·12H₂O、0.24gKH₂PO₄溶于双蒸水中，搅拌溶解，调pH为7.2。高压灭菌锅灭菌，保存到4℃冰箱。

(3)10％水合氯醛溶液：称取水合氯醛10g，加蒸馏水至100mL，完全溶解，棕色瓶避光4℃保存备用。

(4)0.333mg/mL博来霉素生理盐水溶液：称取3mg博来霉素，加无菌生理盐水至9mL，4℃保存备用。

(5)10％多聚甲醛溶液:取10g多聚甲醇固体粉末，加入磷酸缓冲液摇床过夜溶解，定容至100mL。

1.3仪器

显微镜购于OLYMPUS公司：多功能酶标仪购于MolecularDevices公司；电子天平购于METTLERTLLEDO公司。

1.4实验方法

1.4.1动物分组及模型建立

将300只SPF级8周龄，体重在18±2g的C57BL/6雄性小鼠在清洁级无菌环境中饲养,实验前适应性喂养1周。随机分为空白(control)组、模型(model)组、吡非尼酮(50mg·kg^-1)组、每种组合物设置低、中、高剂量三个剂量梯度，分别为1.31mg·kg^-1、2.62mg·kg^-1、5.24mg·kg^-1各20只。将小鼠腹腔注射水合氯醛(360mg·kg^-1)麻醉，仰卧固定，颈部除毛后用碘酒消毒，沿颈前正中线作一长约1cm切口，小心切开颈部皮肤，逐层钝性分离颈前组织并暴露气管，头朝上抬高小鼠固定板，并于桌面成30°，然后用1mL注射器经气管软骨环间隙穿剌向气管内缓慢注入0.3mL博来霉素溶液，剂量为5mg·kg^-1，然后迅速直立并旋转动物，使药液在肺内均匀分布。术后第10天银杏内酯治疗组开始尾静脉注射给药，吡非尼酮组灌胃给药，每天1次，连续给予11d，空白组及模型组给予等体积的生理盐水。1.4.2动物样本采集和处理

每组小鼠均于造模后第21天随机选取6只，采用腹腔注射10％水合氯醛(360mg·kg^-1)进行麻醉，摘除眼球放血致死，打开胸腔，完整分离气管以及肺组织，尽量去除结缔组织及周围脂肪，用生理盐水冲洗后予以滤纸吸干,称量肺湿重并记录。取右肺完全浸泡于10％多聚甲醛溶液中固定24小时后进行石蜡包埋备做病理切片，取左肺上叶装入冻存管中，于液氮中冻存60min后转至-70℃冰箱中储存，待测羟脯氨酸含量。

1.4.3肺系数测定

肺系数(lungcoefficient)是反映肺重和小鼠体重之间关系的一个指标，肺系数是反映肺组织炎症和肺纤维化程度的指标之一，按下列公式计算肺系数：

肺系数＝肺湿重(mg)/体重(g)

1.4.4组织病理学分析

将右肺完全浸泡于10％多聚甲醛溶液中，固定24小时后，采用常规石蜡包埋，用石蜡切片机做连续切片，厚度为5μm，备做H&E染色和Masson染色，于100倍光学显微镜下观察肺组织肺泡炎症和纤维化程度并做出评分。肺泡炎评分和纤维化评分是由专业病理学人员根据肺组织病理学切片的病变情况对肺组织病变程度进行评估。根据肺组织病变程度况分为0～Ⅲ级(记0～3分)，得分越高表示肺组织病变程度越重。肺组织损伤评分标准见表1。

表1小鼠肺泡炎和肺纤维化分级及评分标准

1.4.5肺组织羟脯氨酸(HYP)含量测定

根据羟脯氨酸检测试剂盒的操作说明检测小鼠左肺上叶的羟脯氨酸含量。

1.4.6数据处理

实验结果以Mean±SD表示，所有数据用SPSS17.0软件进行分析。采用方差分析统计，P﹤0.05有统计学差异。

2实验结果

2.1生物学观测

在空白组中，小鼠的食物摄入量和体质量逐渐增加，呼吸频率稳定，无呼吸道分泌物，而模型组小鼠食欲减退，在前7天中平均体重低于空白组，呼吸急促，表明该组肺功能减低，肺部有噪音。阳性药吡非尼酮治疗组小鼠体重情况明显改善，呼吸频率比较稳定，死亡情况改善。银杏内酯各组症状明显好于模型对照组，小鼠体重和呼吸频率优于模型组，银杏内酯组合物中、高剂量组小鼠呼吸频率稳定，且生存率较高。

2.2小鼠生存率

小鼠在吸入博来霉素后，肺泡表面细胞被破坏，肺部组织发生炎性病变，小鼠发生呼吸困难，严重时会窒息死亡。在吸入博来霉素的第5天，模型组的小鼠就开始死亡，这个过程一直延续到第14天，小鼠存活率仅为40％。吡非尼酮治疗组小鼠的生存率为85％。与模型组比较，银杏内酯各给药组小鼠的生存情况均有不同程度的改善且呈剂量依赖关系，其中组合物YXNZ-1和YXNZ-2效果最好，在中剂量时与吡非尼酮效果相当，而高剂量时效果优于吡非尼酮。

表2银杏内酯组合物对肺组织纤维化模型小鼠的生存率的影响

2.3肺系数

肺系数是通过肺重比上体重，肺系数在一定程度反映了肺部病变的严重程度，肺系数越大，肺部病变越严重。模型组小鼠解剖后发现肺脏颜色趋于苍白，光泽度变差，质地较硬，肺脏表面凹凸不平，可见散在分布的大小不等的灰白色结节。经过吡非尼酮和银杏内酯组合物治疗的小鼠肺脏外观、质地、光泽度等均有不同程度的改善且呈剂量依赖性。

模型组与对照组相比较，肺系数明显增大，表明肺部发生严重病变，而银杏内酯组合物治疗组与模型组相比，肺系数有明显下降且呈剂量依赖关系；表明银杏内酯组合物对小鼠肺组织的炎性病变有显著的改善作用。

表3银杏内酯组合物对肺组织纤维化模型小鼠的肺系数的影响

^#p＜0.001vs对照组；^##p＜0.001vs对照组；^###p＜0.001vs对照组；^*p＜0.05vs模型组；^**p＜0.01vs模型组；^***p＜0.001vs模型组。

2.4肺组织内羟脯氨酸含量

羟脯氨酸是胶原纤维的特征物质，它的含量能够反映肺组织的纤维化程度。各组动物羟脯氨酸(Hyp)含量的变化表4所示：模型组小鼠肺组织羟脯氨酸含量较空白组明显升高(P<0.05)，吡非尼酮治疗组肺组织中羟脯氨酸含量较模型组有明显下降(P<0.05)；而银杏内酯组合物治疗组的肺组织羟脯氨酸含量均有所下降且呈剂量依赖性。

表4银杏内酯组合物对肺组织纤维化模型小鼠肺组织内羟脯氨酸的影响

#p＜0.001vs对照组；##p＜0.001vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。

2.5肺组织病理切片的炎症程度评分和组织纤维化评分

采用H&E染色和Masson三色复染法进行染色，参照Szapiel等的方法建立染色评分标准，将各组小鼠肺组织切片在100倍光镜下观察并对肺组织肺泡炎程度进行评分。其具体评分见表5。H&E染色结果发现空白组小鼠肺组织结构完整，肺泡间隔未见有增厚，肺泡腔内无渗出液，而模型组小鼠的肺组织内可见明显的炎性细胞浸润，主要可见有较多的巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等并伴有水肿及肺泡腔内有散在出血，出现成纤维细胞增生，成纤维细胞主要分布于间质内，肺泡壁和肺泡间隔增宽，大量的肺泡结构破坏消失，部分残余的肺泡扩张成囊状，可见明显的成纤维细胞灶。阳性药吡非尼酮治疗组的肺泡腔及间质内炎症细胞浸润减少，间隔内出现一定的胶原沉积及斑片状纤维化改变，而银杏内酯组合物治疗组小鼠病情都有一定程度减轻,其YXNZ-1-中、高组和YXNZ-2-中、高组小鼠肺组织的炎性浸润程度都较轻，肺泡结构未见明显破坏。在Masson染色结果中发现模型组小鼠肺组织中可见大量蓝色胶原，胸膜下、大气道、血管壁周围的基质胶原明显增多，增厚的肺泡壁中可见明显胶原沉积及成纤维细胞增生，肺泡腔被纤维蛋白占据，可见纤维母细胞灶形成。而吡非尼酮组较模型组有明显减轻，肺组织切片内有少量淡蓝色胶原，主要分布在大气道及血管壁周围。银杏内酯组合物治疗组小鼠肺组织胶原沉积随剂量升高呈逐渐减少趋势，肺纤维化评分均低于模型组且呈剂量依赖性。

表5银杏内酯组合物对肺组织纤维化模型小鼠肺组织炎症情况和纤维化程度的影响

^#p＜0.001vs对照组；^##p＜0.001vs对照组；^###p＜0.001vs对照组；^*p＜0.05vs模型组；^**p＜0.01vs模型组；^***p＜0.001vs模型组。

本发明的上述实施例仅仅是为了能够清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种银杏内酯组合物在制备治疗肺组织纤维化药物中的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物由银杏内酯A、B、K组成，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40)：(50～75):(0.2～5)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35)：(50～70):(0.5～4)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30)：(50～65):(0.8～4)。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为20:50:5。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为30:75:0.2。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述治疗肺组织纤维化药物还包括药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗肺组织纤维化药物选自口服给药剂型、注射给药剂型、吸入给药剂型。