CN108088660A - 宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统，其中，方法包括以下步骤：对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布；根据荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数；根据荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。该方法可以在非理想点光源与低信噪比条件下依然能够较好地描述相机系统的光学特性，从而提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

Description

宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统

技术领域

本发明涉及计算机图像处理、显微成像技术领域，特别涉及一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统。

背景技术

点扩散函数用于描述一个光学系统的脉冲响应，在衡量系统的成像质量时起到重要作用，并广泛应用于荧光显微成像、反卷积三维重建、傅里叶光学等领域。

目前获取相机点扩散函数的方法，主要分为理论计算与实际测量两种。理论计算法虽不受噪声影响，但也无法考虑到实际系统与理想情况的差别。实际测量法，普遍采用的方法是拍摄荧光小球焦栈，并将小球视作理想点光源，以小球的光场分布直接作为相机的点扩散函数，该方法通常要求荧光小球的直径小于相机横向分辨率的1/3。

然而在宽场荧光显微镜下，满足上述直径要求的荧光小球通常由于体积过小而亮度过低，难以被清晰观测。故实际拍摄的小球直径略大于相机的横向分辨率，不能被视作理想点光源，再考虑到低信噪比对图像的影响，采用上述方法进行测量时得到的结果与实际偏差相对较大。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，该方法提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

本发明的另一个目的在于提出一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统。

为达到上述目的，本发明一方面实施例提出了一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，包括以下步骤：拍摄荧光小球焦栈，并对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布；根据所述荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数；根据所述荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使所述不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对所述相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。

本发明实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，可以在非理想点光源与低信噪比条件下依然能够较好地描述相机系统的光学特性，相比于假定为理想点光源的普遍测量方法，能够得到更加准确的测量结果，提供了一种更加符合实际相机系统光学特性的点扩散函数测量方法，从而提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

另外，根据本发明上述实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布，包括：对所述荧光小球焦栈图像进行时域滤波和背景噪声的去除；筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与所述荧光小球混淆的残余噪声，以得到所述荧光小球的三维光场分布。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与所述荧光小球混淆的残余噪声，以得到所述荧光小球的三维光场分布，包括：通过对所述荧光小球焦栈图像进行二值化处理，以剔除形状不规则的荧光小球，并通过对二值化后的图像进行膨胀处理以剔除聚集成团或距离过近的荧光小球，以及根据所述二值化后的图像的灰度值随离焦距离的变化特点剔除与荧光小球混淆的残余噪声。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述根据所述荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数，包括：对距离物镜的距离超过预定距离的平面，根据高斯分布拟合得到二维点扩散函数；对距离物镜的距离未超过预定距离的平面，根据圆环分布直接求取二维点扩散函数。

进一步地，在本发明的一个实施例中，相机的不同离焦距离处二维点扩散函数的能量的由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。

为达到上述目的，本发明另一方面实施例提出了一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，包括：预处理模块，用于拍摄荧光小球焦栈，并对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布；二维点扩散函数计算模块，用于根据所述荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数；三维点扩散函数生成模块，用于根据所述荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使所述不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对所述相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。

本发明实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，可以在非理想点光源与低信噪比条件下依然能够较好地描述相机系统的光学特性，相比于假定为理想点光源的普遍测量方法，能够得到更加准确的测量结果，提供了一种更加符合实际相机系统光学特性的点扩散函数测量方法，从而提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

另外，根据本发明上述实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述预处理模块包括：去除模块，用于对所述荧光小球焦栈图像进行时域滤波和背景噪声的去除；筛选剔除模块，用于筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与所述荧光小球混淆的残余噪声，以得到所述荧光小球的三维光场分布。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述筛选剔除模块还用于通过对所述荧光小球焦栈图像进行二值化处理，以剔除形状不规则的荧光小球，并通过对二值化后的图像进行膨胀处理以剔除聚集成团或距离过近的荧光小球，以及根据所述二值化后的图像的灰度值随离焦距离的变化特点剔除与荧光小球混淆的残余噪声。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述二维点扩散函数计算模块还用于对距离物镜的距离超过预定距离的平面，根据高斯分布拟合得到二维点扩散函数，且对距离物镜的距离未超过预定距离的平面，根据圆环分布直接求取二维点扩散函数。

进一步地，在本发明的一个实施例中，相机的不同离焦距离处二维点扩散函数的能量由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明一个实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法的流程图；

图2为根据本发明一个具体实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法的流程图；

图3为根据本发明一个实施例的荧光小球的拍摄、检测与筛选流程图；

图4为根据本发明一个实施例的二维点扩散函数的计算流程图；

图5为根据本发明一个实施例的二维点扩散函数合并为三维点扩散函数的流程图；

图6为根据本发明一个实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在介绍宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统之前，先简单介绍一下相关技术的缺陷。

相关技术通过高斯函数或贝塞尔函数对显微镜的点扩散函数进行拟合，但并未针对小球的非理想点光源特性做其他的处理，效果提升不明显；基于卡尔曼滤波估计点扩散函数，无先验分布假设以提高自适应性，但也因无先验约束而在噪声干扰下可能过度偏离真实解，且实际操作中无法保证迭代的收敛性。

因此，如何在非理想点光源与低信噪比条件下，对荧光小球的三维光场分布数据进行处理分析，得到实际相机系统的点扩散函数是研究人员面临的主要课题。

正是基于上述原因，本发明实施例提出了一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统。

下面参照附图描述根据本发明实施例提出的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法及系统，首先将参照附图描述根据本发明实施例提出的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法。

图1是本发明一个实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法的流程图。

如图1所示，该宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法包括以下步骤：

在步骤S101中，拍摄荧光小球焦栈，并对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布。

也就是说，如图2所示，首先，进行荧光小球的拍摄、检测与筛选。本发明实施例可以拍摄荧光小球焦栈和背景噪声图像，并通过对拍摄的荧光小球焦栈和背景噪声图像进行筛选，从而得到荧光小球的三维光场分布。

进一步地，在本发明的一个实施例中，对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布，包括：对荧光小球焦栈图像进行时域滤波和背景噪声的去除；筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与荧光小球混淆的残余噪声，以得到荧光小球的三维光场分布。

可以理解的是，本发明实施例可以通过对拍摄荧光小球焦栈和背景噪声图像进行时域滤波，背景噪声去除，并借助连通域特性对小球做形态筛选，且根据离焦亮度信息抑制残余噪声，剔除形状不规则、聚集成团或距离过近的小球，并剔除与小球混淆的残余噪声，从而得到荧光小球的三维光场分布。

具体而言，本发明实施例可以根据相机的横向分辨率选取合适直径的小球拍摄其焦栈，并根据轴向分辨率选取适当的拍摄步长。对图像进行时域滤波和背景噪声去除后，根据连通域的面积和离心率特征，剔除形状不规则、聚集成团或距离过近的小球。

需要说明的是，在进行荧光小球的拍摄、检测与筛选时，关键在于将聚集成团或距离过近的小球剔除，以避免出现在离焦较远处不同小球的扩散斑彼此重叠影响的情况；同时，需剔除与小球大小相似的噪声点，避免造成混淆。

如图3所示，荧光小球的荧光小球的拍摄、检测与筛选的具体过程如下：

步骤301，拍摄荧光小球焦栈。由于待测系统，即多维多尺度高分辨率计算摄像仪器的样机，其相机的横向分辨率为860nm，轴向分辨率为10um，故选取直径为1um的荧光小球，焦栈步长为1um，拍摄范围满足在离焦最远处几乎不可见小球扩散斑。在同一位置处拍摄5张荧光小球的图像，另外拍摄10张无小球样本时的背景噪声图像。

步骤302，时域滤波和背景噪声去除。将相同位置处的荧光小球图像各像素点的最大值和最小值去除后取平均，完成时域滤波。对10张背景噪声图像取均值后做高斯滤波，再将时域滤波后的小球焦栈图像减去该背景噪声，得到去噪后的荧光小球焦栈图像。

步骤303，荧光小球的形态筛选。根据各像素点最大亮度所在平面的众数确定焦平面大致位置，并将焦平面附近的小球焦栈图像沿光轴方向取最大值，得到一张图像。对该图二值化，并通过膨胀、连通域检测，连通域面积、离心率的筛选操作，剔除形状不规则、聚集成团或距离过近的荧光小球。

步骤304，残余噪声的抑制。由于荧光小球的灰度值随离焦距离的增大而逐渐减小，而噪声则是随机变化，故根据该特征可将与小球混淆的残余噪声剔除。

步骤305，筛选结果的存储。依据筛选所得小球的中心坐标信息，从去噪后的小球焦栈中切割出指定大小的三维矩阵。从中挑选处矩阵最大值唯一的小球，并令最大值位于各自三维矩阵的中轴线上相同位置，该平面即焦平面位置，如此即可合并得到一个四维矩阵。

可选地，在本发明的一个实施例中，筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与荧光小球混淆的残余噪声，以得到荧光小球的三维光场分布，包括：通过对荧光小球焦栈图像进行二值化处理，以剔除形状不规则的荧光小球，并通过对二值化后的图像进行膨胀处理以剔除聚集成团或距离过近的荧光小球，以及根据二值化后的图像的灰度值随离焦距离的变化特点剔除与荧光小球混淆的残余噪声。

可以理解的是，本发明实施例剔除形状不规则的小球是通过对图像二值化，并剔除离心率过大的连通域实现；剔除聚集成团或距离过近的小球是对二值化后的图像膨胀处理，并剔除面积过大的连通域；剔除与小球混淆的残余噪声，则是基于灰度值随离焦距离的变化特点，即本发明实施例基于灰度值随离焦距离的分布特点抑制残余噪声。

在步骤S102中，根据荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数。

可以理解的是，如图2所示，对二维点扩散函数的计算。本发明实施例可以根据筛选所得荧光小球的光场分布，求取不同离焦距离的二维点扩散函数，并通过最优拟合与联合优化的方法提高拟合效果。

进一步地，在本发明的一个实施例中，根据荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数，包括：对距离物镜的距离超过预定距离的平面，根据高斯分布拟合得到二维点扩散函数；对距离物镜的距离未超过预定距离的平面，根据圆环分布直接求取二维点扩散函数。

可以理解的是，本发明实施例将筛选所得的荧光小球的三维光场分布作为原始数据，用于求解相机的点扩散函数，并对不同离焦距离处的平面分别求取其二维点扩散函数，针对相机特性，对距离物镜较远的平面，按照高斯分布拟合；距离物镜较近的平面，按圆环分布直接求取。

具体而言，本发明实施例对距离物镜较远的平面，按照高斯分布拟合；距离物镜较近的平面，则按圆环分布直接求取。对于高斯拟合的各平面，首先对图像进行高斯滤波减弱噪声影响，然后对每个荧光小球按高斯分布单独拟合，再从中选择拟合度较高的小球进一步做多小球的联合优化，最终根据预处理时的高斯滤波参数对结果进行修正。

进一步地，本发明实施例可以对距离物镜较远的平面，按照高斯分布拟合，即首先对图像高斯滤波，然后对每个荧光小球单独拟合，再从中选择拟合度较高的小球进一步做多小球的联合优化，最终根据预处理时的高斯滤波参数对结果进行修正。对距离物镜较近的平面，按照圆环分布求取，即对全部荧光小球图像取均值后，按照圆对称分布假设求平均，并减去图像的最小像素值滤除底噪；再通过二值化和连通域检测提取圆环位置，将圆环内部填充为实心圆，以滤噪后的荧光小球图像在该实心圆区域内的像素值作为该平面的二维点扩散函数。

如图4所示，对不同离焦距离的平面分别求取其二维点扩散函数，且距离物镜较远时按照高斯分布拟合，距离物镜较近时按照圆环分布直接求取，区分两种拟合的阈值可通过实验确定。该部分的流程框图见图4，具体包括：

步骤401：高斯分布层的单小球最优拟合。首先，对每个筛选得到的荧光小球单独拟合，其拟合公式如下：

其中x是像素中心点到光质心的距离，以pixel为单位，y是该点像素值，A,μ,σ,C均为待拟合参数。A相当于荧光小球的最大亮度；μ的值在理论上应为0，但考虑到测量误差以及荧光小球的非理想点光源特性，仍将其作为一个拟合参数；σ则为高斯分布的标准差；C相当于直流分量，即残余的背景噪声。

光质心的求取方式如下：

其中为像素点i在图像中的位置坐标，它是一个长度为2的向量，而m_i为该点的像素值，求和范围即图像的全体像素点。

为扩大拟合数据的分布范围，避免数据点全部位于x的正半轴，可对x的符号进行人为规定。若当前考察像素点的中心位置坐标而光质心坐标则拟合公式中x的表达式如下：

为减弱噪声对拟合的影响，在拟合前对图像进行高斯滤波，可使数据更加平滑。由于两个高斯函数的卷积仍为高斯函数，且卷积结果的方差为原有两个高斯函数的方差之和，故最终的结果σ可按照下式修正：

其中σ₁为修正前的拟合结果，σ₂为高斯滤波的标准差。

随着x的增大，数据点在x方向的分布更加密集，但对高斯拟合的贡献却变小。因此设定半径r₀＝3，当|x|<₀时保留全部数据点拟合，|x|≥r₀时则按区间等间隔分段，对每个区间内的全部数据点取均值仅作为一个拟合点，如此可使距离光质心较近的像素点在拟合中占有更大的权重，从而提高拟合效果。

步骤402：高斯分布层的多小球联合优化。在单小球最优拟合后，挑选出拟合的判定系数R²>0.95的小球，进行多小球的联合拟合。这里仍按照单小球时的公式拟合，但仅拟合σ一个参数，而A,μ,C则沿用之前各自单独拟合的结果，不同小球的A,μ,C并不完全相同。最终，即可得到不同离焦距离处的高斯分布标准差。

步骤403：圆环分布层的直接求取。当荧光小球所在平面距离物镜较近时，该层的点扩散函数不满足高斯分布，而是近似圆环分布。由于此时离焦距离较大，单个荧光小球测量误差相对较大，故首先对全体小球取均值，减弱噪声影响。然后按照圆对称分布假设，对相同半径的点像素值取均值，再减去层内像素最小值以适当滤除背景噪声。然后通过归一化、二值化、提取最大连通域、膨胀、腐蚀的方式提取出圆环的边界，将圆环填充为实心圆，并以滤除背景噪声后的小球在该实心圆区域内的像素值作为该层的点扩散函数。

在步骤S103中，根据荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。

可以理解的是，本发明实施例可以对不同离焦距离的平面按照能量分布加权，得到系统的三维点扩散函数。也就是说，本发明实施例可以将得到的不同离焦距离处的二维点扩散函数，按照各层的能量分布加权，构成三维点扩散函数

进一步地，在本发明的一个实施例中，相机的不同离焦距离处二维点扩散函数的能量的由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。

可以理解是，本发明实施例可以对不同离焦距离处的二维点扩散函数，按照能量分布进行加权，其能量由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。

举例而言，本发明实施例将不同离焦距离处的二维点扩散函数，按照各层的能量分布进行加权，得到最终的三维点扩散函数。其中，高斯拟合平面的能量等于，以荧光小球光质心为圆心，高斯分布标准差的3倍为半径的圆形区域内像素值之和；圆环拟合平面的能量为，荧光小球在由检测圆环所填充的实心圆区域内的像素值之和。

如图5所示，二维点扩散函数合并为三维点扩散函数模块，将不同离焦距离的二维点扩散函数按照能量分布加权，构成最终的三维点扩散函数。该部分的流程框图见图5，具体包括：

步骤501：高斯分布层的能量计算。对全体荧光小球取均值并减去像素最小值后，若该层高斯拟合所得的标准差为σ，则计算到光质心距离小于3σ的像素点的像素值之和，作为该层的能量。

步骤502：圆环分布层的能量计算。圆环分布层的能量直接由上述求取的二维点扩散函数各点像素值之和表征即可，因在求取二维点扩散函数时，已完成对全体荧光小球取均值再减去像素最小值，并将圆外像素值置0的操作。

步骤503：层间能量加权整合。求得荧光小球焦栈的各层能量后，将各个二维点扩散函数按对应的比例进行缩放，使得其各层能量之比与小球各层能量之比保持一致。为保证能量守恒，对整个三维点扩散函数矩阵进行归一化即为最终结果。

综上，本发明实施例具有以下优点：由于传统的按照理想点光源假设测量点扩散函数的方法，直接以荧光小球的三维光场分布作为系统的点扩散函数，而为保证足够的观测亮度与信噪比，所用荧光小球的直径略大于相机横向分辨率，这会导致所测得的点扩散函数是实际系统点扩散函数与荧光小球亮度分布的卷积结果，其与真实值偏差较大。

尽管噪声不可能完全去除，点光源的非理想性也必然对测量结果有所影响，但本发明通过采取一系列措施以尽可能减弱上述影响，提高测量的准确性。本发明针对相机特性，对不同的离焦距离采用了不同的模型求解，部分平面按照高斯分布拟合，部分平面按照圆环分布求取。对高斯拟合平面，以光质心代替像素中心点计算扩散距离，减小了由像素点采样导致的误差；对图像做高斯滤波的预处理，并最终根据该参数对结果进行修正，减弱了噪声的影响；通过单小球最优拟合加多小球联合优化的方法，提高了拟合的准确度。最后，对各平面的二维点扩散函数按照能量分布加权，构成三维点扩散函数，有效地将不同离焦距离处的点扩散函数联系在一起。

根据本发明实施例提出的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，可以在非理想点光源与低信噪比条件下依然能够较好地描述相机系统的光学特性，相比于假定为理想点光源的普遍测量方法，能够得到更加准确的测量结果，提供了一种更加符合实际相机系统光学特性的点扩散函数测量方法，从而提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

其次参照附图描述根据本发明实施例提出的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统。

图6是本发明一个实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统的结构示意图。

如图6所示，该宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统10包括：预处理模块100、二维点扩散函数计算模块200和三维点扩散函数生成模块300。

其中，预处理模块100用于拍摄荧光小球焦栈，并对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布。二维点扩散函数计算模块200用于根据荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数。三维点扩散函数生成模块300用于根据荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。本发明实施例的系统10可以在非理想点光源与低信噪比条件下依然能够较好地描述相机系统的光学特性，从而提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

进一步地，在本发明的一个实施例中，预处理模块100包括：去除模块和筛选剔除模块。

其中，去除模块用于对荧光小球焦栈图像进行时域滤波和背景噪声的去除。筛选剔除模块用于筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与荧光小球混淆的残余噪声，以得到荧光小球的三维光场分布。

进一步地，在本发明的一个实施例中，筛选剔除模块还用于通过对荧光小球焦栈图像进行二值化处理，以剔除形状不规则的荧光小球，并通过对二值化后的图像进行膨胀处理以剔除聚集成团或距离过近的荧光小球，以及根据二值化后的图像的灰度值随离焦距离的变化特点剔除与荧光小球混淆的残余噪声。

进一步地，在本发明的一个实施例中，二维点扩散函数计算模块200还用于对距离物镜的距离超过预定距离的平面，根据高斯分布拟合得到二维点扩散函数，且对距离物镜的距离未超过预定距离的平面，根据圆环分布直接求取二维点扩散函数。

进一步地，在本发明的一个实施例中，相机的不同离焦距离处二维点扩散函数的能量的由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。

需要说明的是，前述对宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法实施例的解释说明也适用于该实施例的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，此处不再赘述。

根据本发明实施例提出的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，可以在非理想点光源与低信噪比条件下依然能够较好地描述相机系统的光学特性，相比于假定为理想点光源的普遍测量方法，能够得到更加准确的测量结果，提供了一种更加符合实际相机系统光学特性的点扩散函数测量方法，从而提高了测量结果的准确性，可以更好地描述系统的成像特性。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，其特征在于，包括以下步骤：

拍摄荧光小球焦栈，并对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布；

根据所述荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数；

根据所述荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使所述不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对所述相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。

2.根据权利要求1所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，其特征在于，所述对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布，包括：

对所述荧光小球焦栈图像进行时域滤波和背景噪声的去除；

筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与所述荧光小球混淆的残余噪声，以得到所述荧光小球的三维光场分布。

3.根据权利要求2所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，其特征在于，所述筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与所述荧光小球混淆的残余噪声，以得到所述荧光小球的三维光场分布，包括：通过对所述荧光小球焦栈图像进行二值化处理，以剔除形状不规则的荧光小球，并通过对二值化后的图像进行膨胀处理以剔除聚集成团或距离过近的荧光小球，以及根据所述二值化后的图像的灰度值随离焦距离的变化特点剔除与荧光小球混淆的残余噪声。

4.根据权利要求1所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，其特征在于，所述根据所述荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数，包括：

对距离物镜的距离超过预定距离的平面，根据高斯分布拟合得到二维点扩散函数；

对距离物镜的距离未超过预定距离的平面，根据圆环分布直接求取二维点扩散函数。

5.根据权利要求1所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量方法，其特征在于，相机的不同离焦距离处二维点扩散函数的能量由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。

6.一种宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，其特征在于，包括：

预处理模块，用于拍摄荧光小球焦栈，并对拍摄的荧光小球焦栈图像进行去噪及荧光小球的筛选，以得到荧光小球的三维光场分布；

二维点扩散函数计算模块，用于根据所述荧光小球的三维光场分布计算相机的不同离焦距离处二维点扩散函数；

三维点扩散函数生成模块，用于根据所述荧光小球在不同离焦距离处的能量分布，以相同的比例对各个二维点扩散函数进行加权，使所述不同离焦距离处的二维点扩散函数的能量之比与小球各层能量之比相同，对所述相机的不同离焦距离处二维点扩散函数进行合并，以得到宽场荧光显微镜的三维点扩散函数。

7.根据权利要求6所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，其特征在于，所述预处理模块包括：

去除模块，用于对所述荧光小球焦栈图像进行时域滤波和背景噪声的去除；

筛选剔除模块，用于筛选不满足预定形态的荧光小球，并剔除与所述荧光小球混淆的残余噪声，以得到所述荧光小球的三维光场分布。

8.根据权利要求7所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，其特征在于，所述筛选剔除模块还用于通过对所述荧光小球焦栈图像进行二值化处理，以剔除形状不规则的荧光小球，并通过对二值化后的图像进行膨胀处理以剔除聚集成团或距离过近的荧光小球，以及根据所述二值化后的图像的灰度值随离焦距离的变化特点剔除与荧光小球混淆的残余噪声。

9.根据权利要求6所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，其特征在于，所述二维点扩散函数计算模块还用于对距离物镜的距离超过预定距离的平面，根据高斯分布拟合得到二维点扩散函数，且对距离物镜的距离未超过预定距离的平面，根据圆环分布直接求取二维点扩散函数。

10.根据权利要求6所述的宽场荧光显微镜的点扩散函数测量系统，其特征在于，相机的不同离焦距离处二维点扩散函数的能量由荧光小球特定区域内的像素值之和表征。