CN108078976B - Imca在制备抗胃癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及IMCA在制备抗胃癌药物中的应用，所述IMCA的化学结构如下所示：

Description

IMCA在制备抗胃癌药物中的应用
技术领域
本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种IMCA在制备抗胃癌药物中的应用。
背景技术
胃癌是中国人群中最主要的恶性肿瘤之一，每年新发病例和死亡病例的发生率超过70%。世界范围内胃癌发病率地域差异明显，东南亚发病率较高。胃癌的发生率不断升高，对其治疗、预防已引起社会的广泛关注。到目前为止，对于胃癌的治疗，虽然有中医药辅助治疗等多种手段，但仍以手术、化疗治疗为主。手术治疗对病人身体有较大程度的损伤，而且肿瘤的进展分期也决定着手术的可行性。目前的化疗药物也存在不同程度的副作用。因此，开发新的胃癌治疗药物仍然是众多相关科研工作者的首要任务。
NR4A1属于NR4A孤儿核受体超家族的一员，作为主要转录因子，在调节细胞增殖与凋亡、能量代谢、炎症反应等方面发挥重要的作用。近来发现，NR4A1是一种双向转录因子，即具有类癌基因样活性，又是重要的抑癌基因，在多种肿瘤的发生发展中起着重要的作用。NR4A1从细胞核出核定位到细胞质中，将与Bcl2结合形成凋亡复合体，诱导细胞的凋亡，因此NR4A1出核进到细胞质中是其诱导凋亡效应的主要途径。NR4A1拥有经典的N端功能激活结构域、DNA结合结构域及C端配体结合结构域，但其配体结合结构域是非典型的，缺乏经典的核受体配体结构域中的配体接受袋和共激活位点，因此他们没有特定的配体。但近年发现，多种小分子配体可以和NR4A1结合，影响其功能，如TMPA、CnsB等。因此，NR4A1是一个研发抗肿瘤小分子化合物的重要的靶点，进一步研发能高效调节NR4A1活性的小分子化合，开发新的抗肿瘤药物具有巨大的应用前景。IMCA是一种Benzopyrano[2,3-d]pyrimidine 衍生物，目前没有关于该化合物相关活性的研究。
发明内容
本发明目的是提供一种IMCA作为药物的新用途，即IMCA在制备抗胃癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
IMCA在制备抗胃癌药物中的应用，所述IMCA的化学结构如下所示：
。
其相关性质如下：
化学名称：2-imino-6-methoxy-2H-chromene-3-carbothioamide (IMCA)；
分子式：C11H10N2O2S；分子量：234.28；CAS号：71796-75-3；检测方式：HNMR（见图1）；性状：本品为淡黄色粉末；来源：Specs多样性化合物库。药理性质：不溶于水，溶于DMSO。本发明的IMCA购自上海陶术生物科技有限公司，货号：AE-848/32005043；此外，也可以通过常规的方法制备获得，如，采用人工化学合成的方法。
具体的，可以是IMCA在抗胃癌AGS细胞、MGC-803细胞或HGC-27细胞中的应用。该化合物通过与NR4A1相互作用从Specs多样性化合物库中筛选所获得。该化合物主要用以抗胃癌AGS细胞、MGC-803细胞或HGC-27细胞等。
进一步的，所述IMCA的作用浓度为12.5－200 μM。
本发明的IMCA（小分子化合物）通过与NR4A1分子对接虚拟筛选得到，提供了一种IMCA与NR4A1计算基础的分子对接模拟。对接模拟结果显示：IMCA与NR4A1结合的结合能为-6.09 kcal/mol，并分别与NR4A1的 Glu109、Ser110和Glu114形成三个氢键（见图2）。Autodock对接结果显示：IMCA能与NR4A1表面配体结合区较好结合。
本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其将IMCA加入肿瘤细胞的培养液中，加入IMCA的终浓度为12.5－200 μM。所述肿瘤细胞可以是胃癌AGS细胞、MGC-803细胞和HGC-27细胞等。
本发明还提供了一种诱导体外肿瘤细胞凋亡的方法，其将IMCA加入肿瘤细胞的培养液中，加入IMCA的终浓度为12.5－200 μM。所述肿瘤细胞可以是胃癌AGS细胞、MGC-803细胞和HGC-27细胞等。
细胞免疫荧光结果显示，IMCA能诱导NR4A1从细胞核定位到细胞质中。因此，本发明公开了一种诱导体外肿瘤细胞中NR4A1从细胞核到细胞质的方法，其将IMCA加入肿瘤细胞的培养液中，加入IMCA的终浓度为12.5－200 μM。所述肿瘤细胞可以是胃癌AGS细胞、MGC-803细胞和HGC-27细胞等。
本发明还提供了一种抗胃癌药物，该抗胃癌药物的活性成分为IMCA。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了IMCA在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：IMCA能够显著抑制肿瘤细胞增殖，并诱导NR4A1从细胞核到细胞质的定位。Annexin V and PI双染凋亡检测结果显示：IMCA能诱导细胞凋亡。本发明的小分子化合物作为新的抗胃肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈胃肿瘤提供了新的途径和手段。
附图说明
图1是IMCA结构鉴定的HNMR图谱数据；
图2是IMCA与NR4A1分子对接相互作用，图A为作用位点，图B为IMCA与NR4A1形成的三个氢键；
图3是IMCA对AGS、HGC-27和MGC-803细胞增殖影响的测定，图中，*，P<0.05；**，P<0.015； ***，P<0.001；
图4是IMCA对AGS、HGC-27和MGC-803细胞凋亡影响的测定，图中，*，P<0.05；**，P<0.015； ***，P<0.001；
图5是免疫荧光法测定IMCA对NR4A1在AGS细胞定位的作用；
图6是免疫荧光法测定IMCA对NR4A1在HGC-27细胞定位的作用；
图7是免疫荧光法测定IMCA对NR4A1在MGC-803细胞定位的作用。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实验方法：
化合物准备
IMCA溶于DMSO中，配置成100 mM母液备用。
应用实例1、 MTT法测定IMCA对胃癌AGS细胞的生长抑制作用
AGS细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）按 3×103/孔接种至96孔板，5%CO2、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640完全培养基37 ℃培养12 h后加入不同浓度（分别为200 μM、100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM）的IMCA，每个浓度设定3个复孔，继续培养48 h，弃培养液，MTT试剂测定细胞存活率。
测定方法为：无血清培养基洗涤细胞一次，50 μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4 h，吸弃上清，100 μL/孔加入DMSO 溶解还原产物，摇床震荡10 min，490 nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率，以测定IMCA干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞存活率的数值，并以此计算IMCA对AGS细胞的IC50值。
IC50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为AGS细胞数量为对照组一半时IMCA的浓度。
结果：IMCA对AGS细胞的IC50值为111.5 μM（见图3）。
同样的方法测定IMCA对胃癌HGC-27和MGC-803细胞的抑制作用，结果其对HGC-27的IC50值为171.6 μM,，对MGC-803的IC50值为171.9 μM（见图3）。
应用实例2、细胞凋亡的检测
取AGS细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，5%CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素的RPMI 1640完全培养基37 ℃培养48 h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，分别加入5 μL（2.5 μg/ml）的 Annexin-V-FITC 和5 μL（50 μg/ml）PI，染色15 min后用流式细胞仪测定细胞染色，用FlowJo 7.6.1分析细胞凋亡水平。
Annexin-V-FITC和PI染色结果显示，IMCA诱导AGS细胞凋亡（见图4）。
同样的方法测定IMCA对HGC-27、MGC-803细胞凋亡作用的影响，结果显示：IMCA诱导HGC-27、MGC-803细胞凋亡（见图4）。
应用实例3、IMCA诱导胃癌细胞NR4A1细胞质定位的检测
培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定爬片15 min并用PBS洗涤爬片3次。0.2% Triton X-100( PBS配制 )室温通透细胞膜5 min并用PBS浸洗玻片3次后，用含1% BSA的 PBST缓冲液室温封闭60min。每张爬片滴加足够稀释好的NR4A1抗体（购自武汉三鹰生物技术有限公司，货号12235-1-AP），4℃孵育过夜。PBST浸洗爬片3次，每张爬片滴加足够稀释好的荧光二抗（购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00006-2），湿盒中37℃孵育1 h。滴加DAPI染色液避光孵育5 min，复染细胞核，PBST洗涤多余的DAPI。封片液封片，荧光显微镜下观察。
荧光显微镜下观察，细胞核显蓝色荧光，NR4A1结合抗体后显绿色荧光。结果显示：IMCA诱导胃癌AGS细胞NR4A1细胞质定位（见图5）。
同样的方法测定IMCA对HGC-27、MGC-803细胞NR4A1细胞定位的影响，结果显示：IMCA诱导HGC-27、MGC-803细胞质定位（见图6和7）。

Claims (3)

1.IMCA在制备抗胃癌药物中的应用，所述IMCA的化学结构如下所示，IMCA通过与NR4A1分子对接虚拟筛选得到，
。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，IMCA在抗胃癌AGS细胞、MGC-803细胞和HGC-27细胞中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，IMCA的作用浓度为12.5－200 μM。
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