CN108014103B - Imca在制备抗甲状腺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及IMCA在制备抗癌药物中的应用，所述IMCA的化学结构如下所示：

Description

IMCA在制备抗甲状腺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种IMCA在制备抗甲状腺癌药物中的应用。

背景技术

甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，在过去的30年里，其发病率增加了约2.4倍。虽然只占全身恶性肿瘤的1%，但近年来其发病率上升较快，已成为人类恶性肿瘤发病增长最快的肿瘤之一。甲状腺癌的发生率不断升高，对其治疗、预防已引起社会的广泛关注。到目前为止，对于甲状腺癌的治疗，虽然有中医药辅助治疗等多种手段，但仍以手术、放化疗治疗为主。手术治疗对病人身体有较大程度的损伤，而且肿瘤的进展分期、部位等也决定着手术的可行性。目前的化疗药物也存在不同程度的副作用。因此，开发新的甲状腺癌的治疗药物仍然是众多科研工作者的首要任务。

NR4A1属于NR4A孤儿核受体超家族的一员，作为主要转录因子，在调节细胞增殖与凋亡、能量代谢、炎症反应等方面发挥重要的作用。近来发现，NR4A1是一种双向转录因子，即具有类癌基因样活性，又是重要的抑癌基因，在多种肿瘤的发生发展中起着重要的作用。NR4A1从细胞核出核定位到细胞质中，将与Bcl2结合形成凋亡复合体，诱导细胞的凋亡，因此NR4A1出核进到细胞质中是其诱导凋亡效应的主要途径。NR4A1拥有经典的N端功能激活结构域、DNA结合结构域及C端配体结合结构域，但其配体结合结构域是非典型的，缺乏经典的核受体配体结构域中的配体接受袋和共激活位点，因此他们没有特定的配体。但近年发现，多种小分子配体可以和NR4A1结合，影响其功能，如TMPA、CnsB等。因此，NR4A1是一个研发抗肿瘤小分子化合物的重要的靶点，进一步研发能高效调节NR4A1活性的小分子化合，开发新的抗肿瘤药物具有巨大的应用前景。IMCA是一种Benzopyrano[2,3-d]pyrimidine 衍生物，目前没有关于该化合物相关活性的研究。

发明内容

本发明目的是提供一种IMCA作为药物的新用途，即IMCA在制备抗甲状腺癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

IMCA在制备抗癌药物中的应用，所述IMCA的化学结构如下所示：

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其相关性质如下：

化学名称：2-imino-6-methoxy-2H-chromene-3-carbothioamide (IMCA)；

分子式：C₁₁H₁₀N₂O₂S；分子量：234.28；CAS号：71796-75-3；检测方式：HNMR(见图1)；性状：本品为淡黄色粉末；来源：Specs多样性化合物库。药理性质：不溶于水，溶于DMSO。本发明的IMCA购自上海陶术生物科技有限公司，货号：AE-848/32005043；此外，也可以通过常规的方法制备获得，如，采用人工化学合成的方法。

具体的，可以是IMCA在制备抗甲状腺癌药物中的应用。该化合物通过与NR4A1相互作用从Specs多样性化合物库中筛选所获得。该化合物主要用以抗甲状腺癌TT细胞、甲状腺癌ARO细胞等。

本发明的IMCA（小分子化合物）通过与NR4A1分子对接虚拟筛选得到，提供了一种IMCA与NR4A1计算基础的分子对接模拟。对接模拟结果显示：IMCA与NR4A1结合的结合能为-6.09 kcal/mol，并分别与NR4A1的 Glu109、Ser110和Glu114形成三个氢键（见图2）。Autodock对接结果显示：IMCA能与NR4A1表面配体结合区较好结合。

进一步的，所述IMCA的作用浓度为6.25－100 μM。

本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其将IMCA加入肿瘤细胞的培养液中，加入IMCA的终浓度为6.25－100 μM。所述肿瘤细胞可以是甲状腺癌TT细胞、或甲状腺癌ARO细胞。

本发明还提供了一种诱导体外肿瘤细胞凋亡的方法，其将IMCA加入肿瘤细胞的培养液中，加入IMCA的终浓度为6.25－100 μM。所述肿瘤细胞可以是甲状腺癌TT细胞、甲状腺癌ARO细胞。

细胞免疫荧光结果显示，IMCA能诱导NR4A1从细胞核定位到细胞质中。因此，本发明公开了一种诱导体外肿瘤细胞中NR4A1从细胞核到细胞质的方法，其将IMCA加入肿瘤细胞的培养液中，加入IMCA的终浓度为6.25－100 μM。所述肿瘤细胞可以是甲状腺癌TT细胞、或甲状腺癌ARO细胞。

本发明还提供了一种抗甲状腺癌药物，该抗甲状腺癌药物的活性成分为IMCA。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了IMCA在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：IMCA能显著抑制甲状腺肿瘤细胞的增殖，并诱导NR4A1从细胞核到细胞质的定位。Annexin V and PI双染凋亡检测结果显示：IMCA能诱导细胞凋亡。本发明的小分子化合物IMCA作为新的抗甲状腺肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈甲状腺肿瘤提供新的途径和手段。

附图说明

图1是IMCA结构鉴定的HNMR图谱数据；

图2是IMCA与NR4A1分子对接相互作用，图A为作用位点，图B为IMCA与NR4A1形成的三个氢键；

图3是IMCA对TT细胞和ARO细胞的增殖（图A和B）和凋亡（图C和D）的影响，图中，*，P<0.05；**，P<0.015； ***，P<0.001；

图4是利用免疫荧光法测定IMCA对TT细胞和ARO细胞中NR4A1定位。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实验方法：

化合物准备

IMCA溶于DMSO中，配置成100 mM母液备用。

应用实例1、MTT法测定IMCA对甲状腺癌TT细胞的生长抑制作用

TT细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）按 3×10³/孔接种至96孔板，应用5% CO₂、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM完全培养基37 ℃培养12 h后，加入不同浓度（分别为100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM）的IMCA，每个浓度设定3个复孔，继续培养48 h，弃培养液，MTT试剂测定细胞存活率。

测定方法为：无血清培养基洗涤细胞一次，50 μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4 h，吸弃上清，100 μL/孔加入DMSO 溶解还原产物，摇床震荡10 min，490 nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率，以测定IMCA干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞存活率的数值，并以此计算IMCA对TT细胞的IC₅₀值。

IC₅₀指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为TT细胞数量为对照组一半时IMCA的浓度。

结果：IMCA对TT细胞的IC₅₀值为13.18 μM（见图3中A）。

同样的方法测定IMCA对甲状腺癌ARO细胞的抑制作用，结果其对ARO的IC₅₀值为31.99 μM（见图3中B）。

应用实例2、细胞凋亡的检测

取TT细胞1×10⁴接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO₂培养箱DMEM完全培养基培养48 h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，分别加入5 μL（2.5 μg/ml）的 Annexin-V-FITC 和 5 μL（50 μg/ml）PI（碘化丙啶），染色15 min后用流式细胞仪测定，用FlowJo 7.6.1分析细胞凋亡水平。

Annexin-V-FITC 和 PI的染色结果显示：IMCA诱导TT细胞凋亡（见图3中C）。

同样的方法测定IMCA对ARO细胞凋亡作用的影响，结果显示：IMCA诱导ARO细胞凋亡（见图3中D）。

应用实例3、IMCA诱导甲状腺癌细胞NR4A1细胞质定位的确定

培养板中将已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定爬片15 min并用PBS洗涤爬片3次。0.2%Triton X-100( PBS配制 )室温通透细胞膜5 min并用PBS浸洗玻片3次后，用含1% BSA的 PBST缓冲液室温封闭60min。每张爬片滴加足够稀释好的NR4A1抗体（购自武汉三鹰生物技术有限公司，货号12235-1-AP），4℃孵育过夜。PBST浸洗爬片3次，每张爬片滴加足够稀释好的荧光二抗（购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00006-2），湿盒中37℃孵育1 h。滴加DAPI染色液避光孵育5 min，复染细胞核，PBST洗涤多余的DAPI。封片液封片，荧光显微镜下观察。

荧光显微镜下观察，细胞核显蓝色荧光，NR4A1结合抗体后显绿色荧光。结果显示：IMCA诱导甲状腺癌TT细胞NR4A1细胞质定位（见图4）。

同样的方法测定IMCA对ARO细胞NR4A1细胞定位的影响，结果显示：IMCA诱导ARO细胞NR4A1细胞质定位（见图4）。

Claims (2)

1.IMCA在制备抗甲状腺癌药物中的应用，IMCA通过与NR4A1分子对接虚拟筛选得到，所述IMCA的化学结构如下所示：

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2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，IMCA的作用浓度为6.25－100 μM。