CN108064291B - 用于途径工程中的寡核苷酸序列 - Google Patents
用于途径工程中的寡核苷酸序列 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108064291B CN108064291B CN201580064337.1A CN201580064337A CN108064291B CN 108064291 B CN108064291 B CN 108064291B CN 201580064337 A CN201580064337 A CN 201580064337A CN 108064291 B CN108064291 B CN 108064291B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- protein
- host cell
- oligonucleotide
- recombinant dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
- C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明包括可以在各种条件下以高水平启动基因的转录的新型人工寡核苷酸序列。本发明进一步涉及包含该人工寡核苷酸序列的重组DNA片段、包含该重组DNA片段的表达质粒和用该重组DNA片段转化的宿主细胞。
Description
技术领域
本发明包括可以在各种条件下以高水平启动基因的转录的新型人工寡核苷酸序列。本发明进一步涉及包含该人工寡核苷酸序列的重组DNA片段、包含该重组DNA片段的表达质粒和用该重组DNA片段转化的宿主细胞。
背景技术
数千年来,酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae)和狭义酵母属(S.sensu stricto)物种)用于生产面包和酒精饮料如清酒、葡萄酒或啤酒。通过这种长期的工业应用,酵母适应于多种工艺条件且可以耐受生物反应器中的机械力、抑制性物质和发酵产物。而且它们对于温度的波动是稳定的且可以在低pH值下发酵糖类,这使得污染风险最小化。除此之外,酿酒酵母是重要的实验室模型系统且可以容易地进行遗传修饰和是一般公认为安全的–GRAS状态。广泛的遗传工具集可用于酿酒酵母且许多细胞内过程如代谢、分泌、转运、信号传导和其它途径经充分研究,这有助于成功地对酵母工程化以用于多种多样的应用。
尤其,引入多酶途径需要对特别是关键酶(其可能是异源的或原来的)的基因表达水平的精确控制以最大化底物利用和/或产物形成。由此,转录控制在位于基因上游区域中的寡核苷酸序列(启动子)处发生。因此,启动子强度和调控是代谢工程的关键点。
因为内源启动子通常不完全满足转录控制的必要连续且因此未使细胞内可实现的转录水平最大化,酵母工程的关键步骤是选择适当的启动子。
不同类型的启动子是本领域中已知的。
诱导型或脱阻抑启动子允许高水平的转录控制,但它们依赖于诱导剂或限定的处理条件。调控的启动子限于产生毒性蛋白质或建立具有毒性中间体的途径。此外,现有技术的大多数启动子仅已知为使得能够控制一个特定的基因的组的转录。
因此,本领域技术人员迄今已知的启动子总是涉及严重地限制其用途至仅几种特定应用的某些缺点。
发明内容
本发明的发明人因此为他们自己设定了开发新型的和改进的启动子的任务,其能够对更广泛的基因实现高的转录控制和对于工业应用是高度可行的。
本发明的发明人惊异地发现这一任务可以通过以下寡核苷酸序列达成:
该寡核苷酸序列特征在于其提高类型为编码选自酶、结构蛋白、辅酶、转运蛋白、抗体、激素和调控因子的蛋白质的信使RNA片段、类型为调控RNA片段、类型为酶活性RNA片段或类型为转移RNA片段的RNA的转录速率,所述寡核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80%的序列同一性。
本申请中氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名遵循IUPAC的建议。一般地,氨基酸在本文内按照单字母代码命名。
根据本发明的术语“寡核苷酸”理解为包含2-1000核酸,优选10-900核酸,更优选50-850核酸和最优选100-820核酸的单链或双链DNA或RNA分子。
术语“DNA”和“RNA”是本领域技术人员公知的。DNA包含脱氧核糖,而RNA包含核糖(在脱氧核糖中,没有在2'位连接于戊糖环的羟基)。腺嘌呤的互补碱基不是如在DNA中时的胸腺嘧啶,而是尿嘧啶,其是胸腺嘧啶的未甲基化形式。
根据本发明的寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性,优选至少82%,更优选至少85%,特别优选至少90%,甚至更优选至少92%,还优选至少95%,进一步优选至少98%和最优选至少99%的序列同一性的核酸序列。
在特别优选的实施方式中,核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
根据本发明的寡核苷酸提高某些RNA片段的转录速率。术语“提高转录速率”在此理解为与具有当前技术水平的启动子活性的寡核苷酸相比的提高。“转录速率的提高”一般如下测定:
RTLI-通过根据本发明的寡核苷酸控制的报告基因系统的相对转录物水平。
RTLS-通过根据现有技术的寡核苷酸控制的报告基因系统的相对转录物水平。
在此,相对转录物水平测定为相对于细胞提取物中管家基因的RNA浓度,相同细胞提取物中所述报告基因系统的RNA浓度。
然而,RTLI和RTLS通过使用相同类型的宿主细胞测定,而宿主细胞用包含相应寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化且宿主细胞在相同的现有技术条件下生长,而宿主细胞在指数生长期中收获。
在优选实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸盐和乳酸盐的至少两种底物上生长用包含根据本发明的寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的酵母宿主细胞,优选酿酒酵母时,转录速率高至少2倍。所述提高如下测定:
RTLIe–通过寡核苷酸SEQ ID NO:1控制的编码SEQ ID NO:17的信使RNA的相对转录物水平。
RTLSe-通过寡核苷酸SEQ ID NO:9控制的编码SEQ ID NO:17的信使RNA的相对转录物水平。
在此,相对转录物水平测定为相对于酵母(酿酒酵母)细胞提取物中编码肌动蛋白的管家基因的信使RNA浓度,相同酵母细胞提取物中编码SEQ ID NO:17的信使RNA的浓度。
然而,RTLIe和RTLSe通过使用相同类型的酵母宿主细胞(酿酒酵母)测定,而酵母宿主细胞用包含相应寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化且酵母宿主细胞在相同的现有技术条件下生长,而酵母宿主细胞在指数生长期中收获。
在本发明的特别优选的实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸盐和乳酸盐的至少两种底物上生长用包含根据本发明的寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的酵母宿主细胞时,该酵母宿主细胞中基因的转录速率提高至少2倍,更优选至少4倍,特别优选至少6倍和最优选至少10倍。
在本发明的更特别优选的实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油和乙醇的至少两种底物上生长所述宿主细胞时,宿主细胞中基因的转录速率提高至少2倍,优选至少4倍,更优选至少6倍,特别优选至少8倍和最优选至少10倍。
在本发明的另一特别优选的实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、甘油、乙醇和木糖的至少两种底物上生长所述宿主细胞时,宿主细胞中基因的转录速率提高至少2倍,优选至少4倍,更优选至少6倍,特别优选至少8倍和最优选至少10倍。
根据本发明的寡核苷酸的另一优势是其提高通过该寡核苷酸控制的RNA所编码的酶的酶活性。术语“x-倍高的酶活性”在此理解为与具有当前技术水平的启动子活性的寡核苷酸相比的提高。“x倍高的酶活性”一般如下测定:
EAI-通过根据本发明的寡核苷酸控制的报告基因系统的酶活性。
EAS-通过根据现有技术的寡核苷酸控制的报告基因系统的酶活性。
由此,酶活性测定为通过确定量的细胞提取物每分钟转化的底物的量(排除报告基因系统的背景活性)。
然而,EAI和EAS通过使用相同类型的宿主细胞测定,而宿主细胞用包含相应寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化且宿主细胞在相同的现有技术条件下生长,而宿主细胞在指数生长期中收获。
在优选实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸盐和乳酸盐的至少两种底物上生长用包含根据本发明的寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的酵母宿主细胞,优选酿酒酵母时,酶活性提高至少2倍。
所述提高如下测定:
EAIe-通过寡核苷酸SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的衍生物控制的蛋白质SEQ ID NO:17的酶活性。
EASe-通过寡核苷酸SEQ ID NO:9控制的蛋白质SEQ ID NO:17的酶活性。
在此,酶活性测定为通过确定量的细胞提取物每分钟转化的木糖的量(排除报告基因系统的背景活性)。
然而,EAIe和EASe通过使用相同类型的宿主细胞(酿酒酵母)测定,而宿主细胞用包含相应寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化且宿主细胞在相同的现有技术条件下生长,而宿主细胞在指数生长期中收获。
在本发明的特别优选的实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸盐和乳酸盐的至少两种底物上生长用包含根据本发明的寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的酵母宿主细胞时,酵母宿主细胞中的酶活性提高至少2倍,优选至少4倍,更优选至少6倍,特别优选至少8倍和最优选至少10倍。
在本发明的更特别优选的实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油和乙醇的至少两种底物上生长所述宿主细胞时,宿主细胞中的酶活性提高至少2倍,优选至少4倍,更优选至少6倍,特别优选至少8倍和最优选至少10倍。
在本发明的更特别优选的实施方式中,当在选自葡萄糖、甘露糖、甘油、乙醇和木糖的至少两种底物上生长所述宿主细胞时,宿主细胞中的酶活性提高至少2倍,优选至少4倍,更优选至少6倍,特别优选至少8倍和最优选至少10倍。
在本发明中,术语“调控RNA片段”(rRNA片段)理解为具有通过与mRNA或基因的DNA的部分互补而下调基因表达的能力的RNA链。“rRNA片段”的实例是通过RNA干扰(RNAi)发挥作用的微RNA(miRNA),其中miRNA和酶的效应复合物(effector complex)可以切割互补的mRNA、阻断mRNA的翻译或加速其降解。mRNA本身可以在5'非翻译区或3'非翻译区中包含调控元件如核糖开关;这些顺式调控元件调节该mRNA的活性。非翻译区也可以包含调节其它基因的元件。
在本发明中,术语“酶活性RNA片段”理解为作为可以在细胞内催化酶反应的蛋白质复合物的部分的RNA,如核糖体RNA或本身形成催化活性复合物如核酶(核糖核酸酶)的RNA。
在本发明中,术语“转移RNA片段”(tRNA片段)理解为具有在翻译过程中在蛋白质合成的核糖体位点处转移特定氨基酸到生长的多肽链的能力的约80个核苷酸的小RNA链。它具有用于氨基酸附着的位点和用于密码子识别的反密码子区域,其通过氢键键合结合信使RNA链上的特定序列。
在本发明中,术语“信使RNA片段”(mRNA片段)理解为具有向核糖体传送关于蛋白质序列的信息的能力的小RNA链。每三个核苷酸(密码子)对应于一个氨基酸。在真核细胞中,一旦前体mRNA(前-mRNA)从DNA转录,其被加工成成熟mRNA。这除去其内含子—前-mRNA的非编码区段。mRNA然后从细胞核输出到细胞质,其在此处与核糖体结合并在tRNA的帮助下翻译成其对应蛋白质形式。在不具有细胞核和细胞质区室的原核细胞中,mRNA可以在从DNA转录的同时结合核糖体。在一定的时间后,信使RNA在核糖核酸酶的帮助下降解成其组分核苷酸。
在本发明中,术语“结构蛋白质”是指对否则为流体的生物组分赋予硬度和刚性的蛋白质。优选的结构蛋白质选自纤维状蛋白质如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白;及球状蛋白质如肌动蛋白和微管蛋白。起到结构功能和在本发明中理解为“结构蛋白质”的其它蛋白质是马达蛋白如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白,其能够产生机械力。
编码结构蛋白质的优选的RNA片段选自肌动蛋白(actine)、弹性蛋白、细丝蛋白(filamine)、胶原蛋白、肌球蛋白、核纤层蛋白。
编码辅酶的优选RNA片段选自编码被翻译后修饰的多肽的RNA片段。实例是色氨酸色氨酰醌(TTQ)和4-亚甲基-咪唑-5-酮(MIO)。
编码转运蛋白的优选RNA片段选自编码单向运输、同向运输和反向运输载体、质子泵、离子通道和水通道蛋白的RNA片段。
编码抗体的优选RNA片段选自编码IgA、IgD、IgE、EgG、IgM、IgY和IgW的RNA片段。
编码激素的优选RNA片段选自编码小的肽激素如TRH和血管加压素;胰岛素;生长激素;糖蛋白激素如促黄体激素、促卵泡激素和促甲状腺激素的RNA片段。
编码调控因子的优选RNA片段选自编码受体、转录因子、代谢感受器、光感受器、电感受器、机械传感器和信号转导蛋白的RNA片段。
编码酶的优选RNA片段选自编码碳水化合物修饰酶的RNA片段。在本发明中,术语“碳水化合物修饰酶”理解为包括能够修饰任何种类的碳水化合物的任何酶,例如(但不限于)碳水化合物切割酶、碳水化合物氧化酶、碳水化合物还原酶、碳水化合物脱羧酶、碳水化合物脱乙酰酶、碳水化合物乙酰化酶、碳水化合物甲基化酶、碳水化合物脱甲基酶、碳水化合物胺化酶、碳水化合物磷酸化酶、碳水化合物脱磷酸酶、碳水化合物异构化酶、碳水化合物差向异构酶和碳水化合物脱氨基酶。
在本发明的特别优选的实施方式中,碳水化合物修饰酶选自类别EC 5.1.3、EC5.3.1、EC 2.7.1、EC 2.2.1、EC 2.2.1和EC 1.1.1,优选选自EC 5.1.3.3、EC 5.3.1.5、EC2.7.1.17、EC 2.2.1.2、EC 2.2.1.1和EC 1.1.1.1。在更特别优选的实施方式中,蛋白质选自SEQ ID NO:11-53。
在本发明的更优选的实施方式中,本发明寡核苷酸的1-80个核苷酸是“突变的”。在本发明中,术语“突变的”理解为“置换的”、“删除的”或“插入的”。术语“突变”理解为“置换”、“删除”或“插入”。置换分类为转换(其中嘌呤与嘌呤交换(A<->G)或嘧啶与嘧啶交换(C<->T))或者颠换(其中嘌呤与吡啶交换,反之亦然(C/T<->A/G))。插入将一个或多个附加的核苷酸(A、C、T或G)添加到寡核苷酸中。从DNA移除一个或多个核苷酸称为删除。
在进一步的实施方式中,本发明提供包含根据本发明的寡核苷酸的重组DNA片段。
特别优选的根据本发明的重组DNA片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的寡核苷酸及编码选自酶、结构蛋白、辅酶、转运蛋白、抗体、激素和调控因子的蛋白质的RNA片段。特别优选的是,蛋白质是酶且该酶选自类别EC 5.1.3、EC 5.3.1、EC2.7.1、EC 2.2.1、EC 2.2.1和EC1.1.1,优选选自EC 5.1.3.3、EC 5.3.1.5、EC 2.7.1.17、EC 2.2.1.2、EC 2.2.1.1和EC1.1.1.1。其它特别优选的重组DNA片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的寡核苷酸和选自SEQ ID NO:11-53的RNA片段。
在进一步的实施方式中,本发明提供包含至少一个根据本发明的重组DNA片段的表达质粒。
本发明进一步提供用包含根据本发明的寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的宿主细胞。根据本发明的宿主细胞优选用于途径工程或用于含木糖的底物至优选的代谢产物的代谢转化。
根据本发明的重组宿主细胞优选选自细菌、酵母或真菌细胞。在特别优选的实施方式中,宿主细胞选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces);酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Komagataella、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、青霉菌属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、鸡油菌属(Cantharellu)、Agraicus、Boletos、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛壳菌属(Chaetomium)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、踝节菌属(Talaromyces)和脉孢菌属(Neurospora)。
特别优选的是选择选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescence)、植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)、大肠杆菌(Escherichia coli)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uravum)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces kudriavzevii、Saccharomycesmikatae、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Yarrowina lipolytica、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、Komagataella pastoris、毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)的宿主细胞。
根据本发明的重组宿主细胞可以包含一种或多种根据本发明的质粒。
具体实施方式
实施例和附图
在下文中,本发明通过实施例和附图进行描述。实施例和附图考虑用于说明性目的而不是在任何方面限制本发明和权利要求的范围。
实施例1:生长研究–筛选菌株的选择
5种不同的宿主细胞用包含示例寡核苷酸的质粒转化用于测试目的。
表1:测试的宿主细胞的列表
质粒通过在酿酒酵母中的重组克隆构建:酵母细胞用彼此提供45bp重叠的PCR产物转化。片段是酵母标志物(pUG6 87-1559bp)、大肠杆菌标志物和Ori(pUG19 754-2534bp)、酵母Ori(酿酒酵母S288C染色体IV 44978-449831和酿酒酵母S288C染色体II63156-63454bp)及功能部分(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:54、酿酒酵母S288C染色体XI326407-326108bp)。由此,该部分侧翼分别为限制性位点SapI、SbfI、StuI和NotI。
酵母菌株使用根据Gietz和Schiestl的高效率LiAc方法用重新分离的质粒转化。
宿主细胞然后在300ml摇瓶中厌氧条件下通过30℃和250rpm在50ml的含木糖基质(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l木糖+200mg/l G418)中培养。结果如图1中所示。
菌株B由于优良的生长性能选择用于进一步测试。
实施例2:生长研究–包含不同寡核苷酸的不同质粒的比较
菌株B用10种质粒转化。以如实施例1中描述的相同方式构建分别携带寡核苷酸SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的质粒。
菌株B如实施例1中描述的用质粒转化并在相同的条件下培养。结果显示于图2中。
通过包含根据本发明的寡核苷酸的质粒(通过SEQ ID NO:1-7调控的)转化的宿主细胞显示比通过包含现有技术的寡核苷酸SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的质粒转化的宿主细胞显著更高的生长性能。
实施例3:转录物水平–包含不同寡核苷酸的不同质粒的比较
实施例2中描述的携带不同质粒的酵母菌株在500ml摇瓶中通过30℃和250rpm在100ml的含葡萄糖-、甘露糖-、乙醇-、甘油-或木糖-的基质(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l碳源+200mg/l G418)中培养。5ml的培养物在大约OD600 2下收获–离心、用水洗涤和离心(两次)。之后,培养物的沉淀在-80℃下储存。
总RNA通过使用RNeasy Mini KitTM,Qiagen Germany根据生产商手册从细胞提取。然后500ng RNA通过使用ThermoScriptTM RT-PCR Kit,Life Technologies USA根据生产商手册翻译成cDNA。通过遵照生产商的信息使用iQTM Green Supermix和iQTMiCycler,BIO RAD Germany,ACT1和XylA mRNA的浓度可以通过扩增225和236bp tall PCR产物来计算。
相对转录物水平(XylA RNA的浓度除以ACT1RNA的浓度)显示于图3中。
表2:与SEQ ID NO:9控制下的XylA转录物水平相比,不同寡核苷酸控制下的XylA转录物水平的x倍变化
在根据本发明的寡核苷酸控制下的报告基因系统显示转录物水平4-29倍的提高。转录物水平在各种不同生长条件之间变化,但没有看到关于寡核苷酸SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:7的控制的明显不同。
实施例4:酶活性–包含不同寡核苷酸的不同质粒的比较
如实施例3中定义的50ml的培养物以大约OD600 2收获。之后,培养物的沉淀在-80℃下储存。另外,携带如实施例2中所述但没有功能部分的质粒(空质粒)的菌株B的培养物以相同的方式处理。
解冻的细胞沉淀悬浮在400μl缓冲液(100mM Tris pH 7.5,10mM MgCl2)中并均质化。在细胞裂解后,粗提取物稀释到1μg/μl的总蛋白质浓度(通过Bradford分析测量)。木糖异构酶活性分析在具有10%的稀释粗提取物、0.25mM NADH、3U/ml山梨醇脱氢酶和500mM木糖的100μl中进行。反应动力学在340nm下光度测量地跟踪。
测量的酶活性(减去背景活性–空质粒)显示于图4中。
表3:与SEQ ID NO:9控制下的木糖异构酶活性相比,不同寡核苷酸控制下的木糖异构酶活性的x倍变化
在根据本发明的寡核苷酸控制下的报告基因系统显示出酶活性的14-25倍的提高。而酶活性在各种不同生长条件之间变化,但没有看到关于寡核苷酸SEQ ID NO:1-SEQID NO:7的控制的明显不同。
附图说明
图1显示用包含通过按照现有技术的寡核苷酸:SEQ ID NO:10调控的编码SEQ IDNO:17的基因的质粒转化的5个不同酵母宿主细胞(A-E)的生长性能。
图2显示用包含不同寡核苷酸(现有技术的寡核苷酸和根据本发明的寡核苷酸)的不同质粒转化的菌株B的生长性能。
图3显示与现有技术的寡核苷酸SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10相比,在根据本发明的寡核苷酸(SEQ ID NO:1-7)控制下的报告基因系统在不同底物(葡萄糖、甘露糖、乙醇、甘油和木糖)上的转录物水平的4-29倍提高。
图4显示与现有技术寡核苷酸SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10相比,在根据本发明的寡核苷酸(SEQ ID NO:1-7)控制下的报告基因系统在不同底物(葡萄糖、甘露糖、乙醇、甘油和木糖)上的酶活性的14-25倍提高。
序列表说明:
SEQ ID NO:1:由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8的组合组成的合成寡核苷酸
SEQ ID NO:2:对应于包含以下突变的SEQ ID NO:1的合成寡核苷酸:g315a,c322g,a623-,t679c
SEQ ID NO:3:对应于包含以下突变的SEQ ID NO:1的合成寡核苷酸:t549c,a622-,a623-,c661a,t679c
SEQ ID NO:4:对应于包含以下突变的SEQ ID NO:1的合成寡核苷酸:c495a,g674a,t679c,a687g
SEQ ID NO:5:对应于包含以下突变的SEQ ID NO:1的合成寡核苷酸:a171-,c322g,c430t,c431t,c495a
SEQ ID NO:6:对应于包含以下突变的SEQ ID NO:1的合成寡核苷酸:c181a,c205t,c322g,t549c,a623-,t679c
SEQ ID NO:7:对应于包含以下突变的SEQ ID NO:1的合成寡核苷酸:t186a,c322g,c430t,c431t,a623-,t679c
SEQ ID NO:8:来自酿酒酵母S288C,PFK2的上游区域的寡核苷酸
SEQ ID NO:9:来自酿酒酵母S288C,HXT7的上游区域的寡核苷酸
SEQ ID NO:10:来自酿酒酵母S288C,PGK1的上游区域的寡核苷酸
SEQ ID NO:11:来自酿酒酵母EC1118的具有醛糖-1-表异构酶活性的蛋白质,1O4_6579
SEQ ID NO:12:来自酿酒酵母EC1119的具有醛糖-1-表异构酶活性的蛋白质,1F14_0056
SEQ ID NO:13:来自酿酒酵母S288C的具有醛糖-1-表异构酶活性的蛋白质,YHR210C
SEQ ID NO:14:来自酿酒酵母x Saccharomyces kudriavzevii VIN7的具有醛糖-1-表异构酶活性的蛋白质,YHR210C-样
SEQ ID NO:15:来自酿酒酵母AWRI796的具有醛糖-1-表异构酶活性的蛋白质,YHR210C-样
SEQ ID NO:16:来自乳酸乳球菌的具有醛糖-1-表异构酶活性的蛋白质,XylM
SEQ ID NO:17:来自砂优杆菌(Eubacterium saburreum)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:18:来自梨囊鞭菌(Piromyces sp.)E2的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:19:来自根囊鞭菌(Orpinomyces sp.)ukk1的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:20:来自Clostridium phytofermentans的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:21:来自黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:22:来自单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:23:来自解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:24:来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:25:来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:26:来自粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:27:来自吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:28:来自栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:29:来自根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:30:来自嗜纤维杆菌(Clostridium cellulovorans)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:31:来自新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:32:来自乳酸乳球菌的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA蛋白
SEQ ID NO:33:来自热硫化氢高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:34:来自黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA蛋白,XylA
SEQ ID NO:35:来自牛瘤胃的未培养细菌的具有木糖异构酶活性的蛋白质,WO2014 164392内的序列号2
SEQ ID NO:36:来自牛瘤胃的未培养细菌的具有木糖异构酶活性的蛋白质,WO2014 164392内的序列号1
SEQ ID NO:37:来自毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ICM7的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:38:来自毛螺科菌oral taxon 107的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:39:来自毛螺科菌oral taxon 082的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:40:来自未培养细菌的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XYM1,来自Parachin,N.S.和Gorwa-Grauslund,M.F.Isolation of xylose isomerases bysequence-and function-based screening from a soil metagenome library,Biotechnol Biofuels 4(1),9(2011)
SEQ ID NO:41:来自未培养细菌的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XYM2,来自Parachin,N.S.和Gorwa-Grauslund,M.F.Isolation of xylose isomerases bysequence-and function-based screening from a soil metagenome library,Biotechnol Biofuels 4(1),9(2011)
SEQ ID NO:42:来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:43:来自大肠杆菌的具有木糖异构酶活性的蛋白质,XylA
SEQ ID NO:44:来自酿酒酵母S288C的具有木酮糖激酶活性的蛋白质,XKS1
SEQ ID NO:45:来自毕赤酵母(Scheffersomyces(Pichia)stipites)CBS 6054的具有木酮糖激酶活性的蛋白质,XKS1
SEQ ID NO:46:来自里氏木霉QM6a的具有木酮糖激酶活性的蛋白质,TRIREDRAFT_123288
SEQ ID NO:47:来自酿酒酵母S288C的具有转醛醇酶活性的蛋白质,TAL1
SEQ ID NO:48:来自酿酒酵母S288C的具有转醛醇酶活性的蛋白质,NQM1
SEQ ID NO:49:来自毕赤酵母CBS 6054的具有转醛醇酶活性的蛋白质,TAL1
SEQ ID NO:50:来自酿酒酵母S288C的具有转酮醇酶活性的蛋白质,TKL1
SEQ ID NO:51:来自酿酒酵母S288C的具有转酮醇酶活性的蛋白质,TKL2
SEQ ID NO:52:来自毕赤酵母CBS 6054的具有转酮醇酶活性的蛋白质,TKL1
SEQ ID NO:53:来自酿酒酵母S288C的具有醇脱氢酶活性的蛋白质,ADH1
SEQ ID NO:54:编码SEQ ID NO:17的合成DNA序列
Claims (9)
1.一种寡核苷酸序列,特征在于其提高以下类型的RNA的转录速率:编码选自酶、结构蛋白、辅酶、转运蛋白、抗体、激素和调控因子的蛋白质的信使RNA片段、调控RNA片段、酶活性RNA片段或转移RNA片段,其中所述寡核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
2.根据权利要求1的寡核苷酸序列,其中当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸盐和乳酸盐的至少两种底物上生长用包含所述寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的酵母宿主细胞时,所述RNA片段在酵母宿主细胞中的转录速率提高至少2倍。
3.根据权利要求1的寡核苷酸序列,其中当在选自葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、甘油、乙醇、乙酸盐和乳酸盐的至少两种底物上生长用包含所述寡核苷酸的至少一个重组DNA片段转化的酵母宿主细胞时,在酵母宿主细胞中由通过所述寡核苷酸控制的RNA片段编码的酶的活性提高至少2倍。
4.根据前述权利要求中任一项的寡核苷酸序列,其中所述酶是碳水化合物修饰酶。
5.根据前述权利要求中任一项的寡核苷酸序列,其中所述酶是选自EC 5.1.3、EC5.3.1、EC 2.7.1、EC 2.2.1、EC 2.2.1和EC 1.1.1的碳水化合物修饰酶。
6.根据前述权利要求中任一项的寡核苷酸序列,其中所述蛋白质选自SEQ ID No:11-53。
7.一种重组DNA片段,包含根据权利要求1-6中任一项的寡核苷酸序列。
8.一种表达质粒,包含至少一个根据权利要求7的重组DNA片段。
9.一种宿主细胞,其用至少一个根据权利要求7的重组DNA片段转化或用至少一个根据权利要求8的表达质粒转化。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14195026.1 | 2014-11-26 | ||
EP14195026.1A EP3026116B1 (en) | 2014-11-26 | 2014-11-26 | Oligonucleotide sequence for use in pathway engineering |
PCT/EP2015/076715 WO2016083180A1 (en) | 2014-11-26 | 2015-11-16 | Oligonucleotide sequence for use in pathway engineering |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108064291A CN108064291A (zh) | 2018-05-22 |
CN108064291B true CN108064291B (zh) | 2022-01-11 |
Family
ID=52000679
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580064337.1A Active CN108064291B (zh) | 2014-11-26 | 2015-11-16 | 用于途径工程中的寡核苷酸序列 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10400244B2 (zh) |
EP (1) | EP3026116B1 (zh) |
CN (1) | CN108064291B (zh) |
AR (1) | AR102762A1 (zh) |
AU (1) | AU2015352801B2 (zh) |
BR (1) | BR112017011182B1 (zh) |
CA (1) | CA2967751C (zh) |
DK (1) | DK3026116T3 (zh) |
EA (1) | EA037161B1 (zh) |
ES (1) | ES2626804T3 (zh) |
HR (1) | HRP20170884T1 (zh) |
HU (1) | HUE032941T2 (zh) |
MY (1) | MY176630A (zh) |
PL (1) | PL3026116T3 (zh) |
RS (1) | RS56018B1 (zh) |
SI (1) | SI3026116T1 (zh) |
WO (1) | WO2016083180A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112004930A (zh) * | 2018-03-27 | 2020-11-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 木糖代谢酵母 |
PL3690052T3 (pl) * | 2019-01-29 | 2023-08-14 | Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh | Chimeryczny promotor do stosowania w inżynierii metabolicznej |
US20210062178A1 (en) * | 2019-06-21 | 2021-03-04 | The Regents Of The University Of California | Novel xylose isomerase gene and polypeptide and uses thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010062597A1 (en) * | 2008-10-27 | 2010-06-03 | Butamax™ Advanced Biofuels LLC | Carbon pathway optimized production hosts for the production of isobutanol |
CN102060930A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-18 | 上海交通大学 | hHscFv-Rcr基因序列及转基因烟草的制备方法 |
WO2014035458A1 (en) * | 2012-08-29 | 2014-03-06 | Mascoma Corporation | Expression of enzymes in yeast for lignocellulose derived oligomer cbp |
WO2014080024A2 (en) * | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Itaconic acid and itaconate methylester production |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7504493B2 (en) * | 1997-01-23 | 2009-03-17 | The John Hopkins University | Characterization of the yeast transcriptome |
SE0202090D0 (sv) * | 2002-05-08 | 2002-07-04 | Forskarpatent I Syd Ab | A modifierd yeast consuming L-arabinose |
JP2010136627A (ja) * | 2008-12-09 | 2010-06-24 | Nippon Oil Corp | 酵母にガラクトースを利用させる方法 |
BRPI1010130B1 (pt) * | 2009-06-26 | 2021-08-03 | Archer Daniels Midland Company | Cepa de levedura e uso da cepa de levedura |
DE102012007491A1 (de) * | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Evonik Industries Ag | Neue Enzyme |
US8669076B1 (en) | 2013-03-11 | 2014-03-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Cow rumen xylose isomerases active in yeast cells |
-
2014
- 2014-11-26 PL PL14195026T patent/PL3026116T3/pl unknown
- 2014-11-26 ES ES14195026.1T patent/ES2626804T3/es active Active
- 2014-11-26 EP EP14195026.1A patent/EP3026116B1/en active Active
- 2014-11-26 DK DK14195026.1T patent/DK3026116T3/en active
- 2014-11-26 SI SI201430240T patent/SI3026116T1/sl unknown
- 2014-11-26 HU HUE14195026A patent/HUE032941T2/en unknown
- 2014-11-26 RS RS20170511A patent/RS56018B1/sr unknown
-
2015
- 2015-11-16 WO PCT/EP2015/076715 patent/WO2016083180A1/en active Application Filing
- 2015-11-16 BR BR112017011182-9A patent/BR112017011182B1/pt active IP Right Grant
- 2015-11-16 EA EA201791156A patent/EA037161B1/ru unknown
- 2015-11-16 US US15/529,577 patent/US10400244B2/en active Active
- 2015-11-16 CA CA2967751A patent/CA2967751C/en active Active
- 2015-11-16 AU AU2015352801A patent/AU2015352801B2/en not_active Ceased
- 2015-11-16 CN CN201580064337.1A patent/CN108064291B/zh active Active
- 2015-11-16 MY MYPI2017000774A patent/MY176630A/en unknown
- 2015-11-24 AR ARP150103828A patent/AR102762A1/es unknown
-
2017
- 2017-06-09 HR HRP20170884TT patent/HRP20170884T1/hr unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010062597A1 (en) * | 2008-10-27 | 2010-06-03 | Butamax™ Advanced Biofuels LLC | Carbon pathway optimized production hosts for the production of isobutanol |
CN102060930A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-18 | 上海交通大学 | hHscFv-Rcr基因序列及转基因烟草的制备方法 |
WO2014035458A1 (en) * | 2012-08-29 | 2014-03-06 | Mascoma Corporation | Expression of enzymes in yeast for lignocellulose derived oligomer cbp |
WO2014080024A2 (en) * | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Itaconic acid and itaconate methylester production |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2015352801A1 (en) | 2017-05-25 |
EP3026116A1 (en) | 2016-06-01 |
EA037161B1 (ru) | 2021-02-12 |
EP3026116B1 (en) | 2017-03-15 |
BR112017011182A2 (pt) | 2018-02-06 |
DK3026116T3 (en) | 2017-06-06 |
PL3026116T3 (pl) | 2017-09-29 |
AR102762A1 (es) | 2017-03-22 |
CA2967751C (en) | 2020-08-11 |
CA2967751A1 (en) | 2016-06-02 |
EA201791156A1 (ru) | 2017-09-29 |
SI3026116T1 (sl) | 2017-10-30 |
BR112017011182A8 (pt) | 2022-08-30 |
RS56018B1 (sr) | 2017-09-29 |
US20170314029A1 (en) | 2017-11-02 |
US10400244B2 (en) | 2019-09-03 |
MY176630A (en) | 2020-08-19 |
AU2015352801B2 (en) | 2018-11-01 |
WO2016083180A1 (en) | 2016-06-02 |
HRP20170884T1 (hr) | 2017-09-08 |
BR112017011182B1 (pt) | 2024-02-15 |
CN108064291A (zh) | 2018-05-22 |
HUE032941T2 (en) | 2017-11-28 |
ES2626804T3 (es) | 2017-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106687576B (zh) | 用于提高乙醇生产的改变的宿主细胞途径 | |
EP2679686B1 (en) | Nucleic acid molecule encoding xylose isomerase and xylose isomerase encoded thereof | |
US9045745B2 (en) | Pentose fermentation by a recombinant microorganism | |
WO2018114762A1 (en) | Improved glycerol free ethanol production | |
MX2010009465A (es) | Una celula fermentadora de azucar pentosa. | |
AU2013348272A1 (en) | Pentose fermentation by a recombinant microorganism | |
CN108064291B (zh) | 用于途径工程中的寡核苷酸序列 | |
EP2697252B1 (en) | Compositions and methods for increased ethanol production from biomass | |
CN104894077A (zh) | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用 | |
WO2013128948A1 (en) | Novel promoter and use thereof | |
EP3690052B1 (en) | Chimeric promoter for use in metabolic engineering | |
EP2626423A1 (en) | Pentose-fermenting microorganism | |
CN107429219B (zh) | 高效乙醇发酵菌 | |
CN113272438A (zh) | 重组酵母和使用其的乙醇的制造方法 | |
JP2015177766A (ja) | Kluyveromyces属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220613 Address after: Frankfurt, Germany Patentee after: Clariant products (Germany) Co. Address before: Swiss Mu Tengci Patentee before: CLARIANT INTERNATIONAL Ltd. |
|
TR01 | Transfer of patent right |