CN108037257A - 一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法及装置，所述试验采用四个EGSB反应器，模拟废水由进水恒流泵泵入EGSB反应器，在升流运动中完成氮素转化，气体由顶部的气室排出，出水由溢流堰排放，排入出水箱和通过循环水泵循环使用，EGSB反应器出水回流比为8，液面上升速度为0.1m/h，模拟废水pH调节在6.7‑6.8，曝高纯氮气至溶解氧低于0.5mg/L后，进入密封进水箱，EGSB反应器连续进水，温度通过夹套层控制在35±1℃。总之，本发明设计合理，提供了多种指标试验的方法，解决了现有技术中没有相关铁离子研究的系统化的试验方法，并提供了一种可稳定控制温度和循环废水的试验装置。
Description
技术领域
本发明涉及污水生物处理技术领域，具体是涉及一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法及装置。
背景技术
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)作为一种新型生物脱氮工艺，具有脱氮效能高、节省有机碳源和曝气动力消耗、污泥产生量小等优势，受到越来越广泛的关注。而作为其功能承载者的厌氧氨氧化菌，细胞产率低、生长缓慢、对环境条件敏感，极大限制了工艺的推广应用。铁元素作为血红素必要组分，参与多种功能蛋白合成，对厌氧氨氧化菌的生理生化作用产生重要影响。研究表明，厌氧氨氧化研究中常用模拟废水中铁元素含量不足，当前关于铁元素强化厌氧氨氧化工艺的研究主要集中于亚铁离子，而铁离子对厌氧氨氧化工艺启动及运行过程的影响则较少有研究涉及。
2009年，张蕾等考察了亚铁离子对厌氧氨氧化反应器性能的影响，发现添加亚铁离子可显著提高反应器基质转化能力。当亚铁离子浓度为0.075mmol/L时，反应器对NH4 +-N和NO2 --N的最大去除速率分别为对照(铁离子浓度为0.03mmol/L)的1.8倍和1.6倍，并且细胞生长量为对照的1.36倍，挥发性固体浓度(VS)为对照的2.15倍。Bi等发现进水添加0.09mmol/L亚铁离子可使厌氧氨氧化工艺启动时间减少到50天，同时可促进细胞色素c的合成，脱氢酶活性也得到增强。Shu等考察亚铁离子对厌氧氨氧化反应器中微生物群落、氮素转化途径的影响，借助动力学和宏基因组学分析发现，随着亚铁离子浓度由0.02mmol/L提升至0.08mmol/L，厌氧氨氧化菌生长速率由0.1787d-1提高至0.2648d-1，而亚铁离子浓度进一步提升至0.12mmol/L时，厌氧氨氧化菌生长速率轻微降低至0.2210d-1。
现有技术中，涉及铁离子对厌氧氨氧化能效影响研究很少，尚未有铁离子对厌氧氨氧化能效影响的系统试验方法；现有技术中厌氧膨胀床反应装置不能循环废水或循环废水过程过于复杂，且不能稳定控制反应器内的温度，因此研究提供一种铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法和一种简单循环且能稳定反应器内的温度的装置，对于污水生物处理具有重要意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是：针对现有技术中未研究提供一种铁离子对厌氧氨氧化能效影响的系统试验方法，试验装置的反应器不能循环废水或循环废水过程过于复杂且不能稳定控制反应器内的温度等问题，提供了一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法及装置。
一种微型厌氧膨胀床反应的试验方法，包括以下步骤：
S1、分组：所述试验采用四个EGSB反应器，编号R1、R2、R3、R4，其中R1为对照组，R2、R3、R4为试验组；
S2、反应操作过程：所述R2、R3和R4进水添加铁离子，模拟废水由进水恒流泵泵入EGSB反应器，在升流运动中完成氮素转化，气体由顶部的气室排出，出水由溢流堰排放，排入出水箱和通过循环水泵循环使用，EGSB反应器出水回流比为8，液面上升速度为0.1m/h，模拟废水pH调节在6.7-6.8，曝高纯氮气(>99.5％)至溶解氧(dissolved oxygen,DO)低于0.5mg/L后，进入密封进水箱，EGSB反应器连续进水，温度通过夹套层控制在35±1℃；
S3、进行以下指标检测：
A、常规指标测定与分析：
出水水样采集后，经0.45μm玻璃纤维膜过滤后，保存于4℃冰箱供后续分析。所测定的水质指标有NH4 +-N、NO2 --N、NO3 --N、COD、总溶解性铁、DO、pH，其检测方法根据国家标准[114]，如表4所示。
表1常规指标分析检测方法
氨氮、亚硝酸盐及总氮去除率参照式1、2、3计算。容积氮负荷(nitrogen loadingrate,NRR)及氮去除速率(nitrogen removal rate,NRR)根据式4，5计算。
C(Inf.NH4 +)、C(Eff.NH4 +)、C(Inf.NO2 -)、C(Eff.NO2 -)、C(Inf.TN)、C(Eff.TN)分别代表进出水中氨氮、亚硝酸盐及总氮浓度，HRT为水力停留时间(hydraulic retentiontime)。
B、比厌氧氨氧活性测定：
从EGSB反应器中取一定量污泥加入100mL血清瓶中，使血清瓶内VSS为2.0g/L，加入NH4 +-N及NO2--N浓度分别为70和92mg/L的模拟废水80mL，用高纯氮(>99.5％)置换血清瓶中空气15min，保证其无氧环境。血清瓶用丁基橡胶塞塞紧，并用铝盖加固，置于恒温振荡器中，温度设定为35℃，转速为180rpm。用注射器间隔取样，测定血清瓶中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N浓度，由基质降解曲线计算污泥比厌氧氨氧化活性(specific anammox activity,SAA)，所有样品做三个平行；
C、氮素转化功能基因及功能菌丰度测定：
(1)DNA提取
从EGSB反应器中取一定量污泥，使用试剂盒FastDNATM Spin Kit for soil提取DNA，具体步骤按照配套的说明书进行。
(2)PCR扩增及质粒制备
本研究中定量PCR分析选取bacterial 16S rRNA(细菌16S rRNA)，Anammoxbacterial 16S rRNA(厌氧氨氧化菌16S rRNA)及相关氮素转化功能基因，包括：amoA(编码氨单加氧酶)，napA(编码周质硝酸盐还原酶)，narG(编码膜结合硝酸盐还原酶)，nirK(编码铜型亚硝酸还原酶)，nirS(编码血红素cd1型亚硝酸还原酶)，hzsB(编码联胺合成酶b亚基)。引物选取参考已发表文献，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。具体引物序列、目标基因片段长度及扩增条件见表2-5。
普通PCR反应体系为25μL，包括：12.5μL的PCR SuperMix，2μL DNA模板(稀释至20ng/μL)，正反向引物各1μL(20μM)及8.5μL的ddH2O。扩增程序循环数为25，其余参数与表2-5相同。含目标基因的扩增产物经AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化试剂盒(Axygen，美国)纯化，将纯化产物连接19-T Vector(TaKaRa，日本)克隆载体，转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，构建质粒标准品。使用MiniBest Plasmid PurificationKit Ver.3.0质粒DNA提取试剂盒(TaKaRa，日本)提取质粒标准品，由公式计算对应目标基因的拷贝数以备后续分析。
(3)实时荧光定量PCR扩增
定量PCR扩增在实时荧光定量PCR仪AB7500(Life Technologies,美国)上进行，反应体系25μL，包括12.5μLGreen PCR Master Mix(Vazyme，中国)，2μL DNA模板(稀释至20ng/μL)，正反向引物各0.2μL及10.1μL ddH2O。具体扩增程序如表5所示。本试验中目标基因扩增效率均在90％-110％之间，标准曲线的相关系数R2大于0.99。
表2定量PCR分析的引物及扩增程序
D、微生物群落结构分析：
微生物群落结构分析基于Illumina Miseq测序平台的16S rRNA高通量测序技术，具体步骤包括DNA样品提取、PCR扩增、扩增产物验证与纯化、测序及后续数据处理。
(1)DNA样品提取
取适量污泥样品，用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒进行DNA提取，提取的DNA样品用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计定量后，置于-20℃条件保存。
(2)PCR扩增
采用细菌通用引物对污泥样品DNA进行16S rRNA扩增，引物序列为：正向引物(5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)，反向引物(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)[122]。扩增体系为50μL，包括2μL DNA模板(稀释至20ng/μL)，4μL MgCl2，4μL DNTP Mixture，0.25μL Ex Taq DNA聚合酶，5μL 10×PCR Buffer(TaKaRa，日本)，正反引物各1μL，剩余体积以无菌超纯水补足，所有样品一式四份。
PCR反应于Veriti PCR仪(Life Technologies，美国)进行，扩增程序为：预变性98℃/5min，扩增循环20次(变性98℃/30s，退火50℃/30s，延伸72℃/40s)，最终延伸72℃/10min。
(3)扩增产物验证与纯化
取5μL扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶做电泳验证，电泳在100V电压下进行，20min后取下置于凝胶成像仪中观察，对检验正常的样品，混合四份PCR扩增产物，用E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit试剂盒进行纯化，纯化后的样品用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计定量。
(4)测序及后续数据处理
纯化后的样品送至江苏中宜金大分析检测有限公司，基于Illumina Miseq测序平台进行高通量测序分析。数据经Sickle及Mothur软件处理后，使用Heml(Version 1.0)绘制热图。
E、污泥形貌粒径及能谱分析：
(1)环境样品扫描电镜(E-SEM)观察
污泥样品预处理参考Araujo JC等进行，具体操作步骤如下：①从EGSB反应器中取适量污泥于离心管中，用超纯水清洗三次，弃上清液；②离心管中加入含2.5％戊二醛的0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，淹没样品，置于4℃冰箱中固定12h；③用0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)冲洗固定好的污泥3次，每次10min；④将污泥样品经系列浓度50％、70％、80％、90％、95％的乙醇中脱水处理，每次10min；⑤将污泥样品用100％的乙醇脱水处理3次，每次10min，而后进行冷冻干燥；⑥冷冻干燥后的污泥，用离子溅射仪(IONSPUTTER,JFC-1100)喷金镀膜，采用环境样品扫描电镜(QuantaTM 250FEG，美国FEI公司)观察。
(2)污泥粒径分析
从EGSB反应器中取出典型污泥样品至50mL离心管中，置于激光粒度仪(Mastersizer 3000，英国马尔文仪器有限公司)检测。样品充分混匀后，以水为分散剂进行分析测试，并使用机器配置的软件进行记录，使用一次性塑料滴灌吸取搅拌均匀的样品，污泥样加至遮光度在10％～15％时进行测试。单一样品重复测定三次，以降低误差。
(3)能谱分析
能谱仪(energy dispersive spectrometer，EDS)是用来对微区成分元素种类与含量分析，配合环境样品扫描电镜(QuantaTM 250FEG，美国FEI公司)使用，分析污泥样品微生物元素组成，前处理步骤见(1)。
进一步的，所述R2、R3和R4进水添加铁离子浓度分别为0.04、0.08、0.14mmol/L，以氯化铁形式提供，氯化铁效果优于其他含铁离子化合物。
进一步的，试验方法中使用的接种污泥为反硝化污泥，取自南京某市政污水厂氧化沟工艺缺氧段，为黄棕色絮状污泥，成本低，效用好。
进一步的，所述EGSB反应器悬浮固体浓度(suspended solids,SS)为20.0g/L,接种前用pH＝7.2的K2HPO4/KH2PO4缓冲液冲洗污泥3次，以洗去污泥中残余物质(氨氮、有机物、亚硝酸盐及硝酸盐)，防止残余物质影响反应结果。
一种微型厌氧膨胀床反应试验装置，所述试验装置由EGSB反应器、进水箱、出水箱、进水恒流泵、循环水泵和恒温循环水槽组成，所述EGSB反应器能使微生物有效持留，并使污泥流态化，促进基质传递及产气释放。此外，维持污泥膨胀所进行的出水回流，可削弱基质自抑制效应，非常适于厌氧氨氧化工艺的启动及运行。所述EGSB反应器筒壁外设有夹套层，所述EGSB反应器由有机玻璃制成，其高径比为6，有效容积为0.8L，所述进水恒流泵一端与所述进水箱通过管道连接，另一端与所述EGSB反应器底部的入水口通过管道连接，所述循环水泵一端与所述EGSB反应器的溢流堰通过管道连接，另一端与所述EGSB反应器底部的入水口通过管道连接，所述出水箱与所述EGSB反应器的溢流堰通过管道连接，所述恒温循环水槽与所述夹套层通过管道连接。
进一步的，所述EGSB反应器为小试规模的厌氧膨胀床反应器(expanded granularsludge bed,EGSB)，试验效果好，结构简单，成本低。
进一步的，所述试验装置设有4个完全一致的ESGB反应器。
进一步的，所述EGSB反应器外裹锡纸，有效防止光的负面影响。
进一步的，所述EGSB反应器设有四个取样点，所述取样点1、取样点2、取样点3和取样点4从上到下依次设在EGSB反应器筒壁上，可以方便采集反应器各个位置的采样。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种铁离子对厌氧氨氧化能效影响的系统试验方法，提供了多种指标的试验方法，解决了现有技术中尚未有铁离子对厌氧氨氧化能效影响的系统试验方法。
(2)本发明提供了一种试验装置，通过夹套层和恒温循环水槽共同作用下可以稳定控制反应器内温度，通过设置循环水泵和溢流堰共同作用下使试验中废水循环，解决了现有技术中反应器不能循环废水或循环废水过程过程过于复杂且不能稳定控制反应器内的温度。
附图说明
图1是本发明的试验装置结构示意图。
其中，1-EGSB反应器、11-夹套层、12-进水口、13-溢流堰、14-气室、2-入水箱、3-出水箱、4-进水恒流泵、5-循环水泵、6-恒温循环水槽、7-取样点1、8-取样点2、9-取样点3、10-取样点4。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明，以更好地体现本发明的优势。
接种污泥与模拟废水
在硝化污泥、反硝化污泥以及厌氧消化污泥中，均有具备厌氧氨氧化活性的菌株，并有成功接种启动厌氧氨氧化反应器的先例。本试验接种污泥为反硝化污泥，取自南京某市政污水厂氧化沟工艺缺氧段，为黄棕色絮状污泥。各反应器悬浮固体浓度(suspendedsolids,SS)为20.0g/L,接种前用pH＝7.2的K2HPO4/KH2PO4缓冲液冲洗污泥3次，以洗去污泥中残余物质(氨氮、有机物、亚硝酸盐及硝酸盐)，成本低，效用好。
试验采用模拟废水，氮素以硫酸铵及亚硝酸钠提供，浓度按需配制。模拟废水组分如表1所示，为满足微生物生长要求，模拟废水中加入1.25mL/L微量元素浓缩液，组分如表2所示。
表3模拟废水组分
表4微量元素浓缩液组成
试验仪器
本试验过程中主要用到的仪器设备如表3所示。
表5试验过程主要使用的仪器设备
试验试剂
化学试剂：试验所用化学药品如葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾等均购自南京聚康化学品科技有限公司，品质为分析纯。
分子生物学试剂：引物(金斯瑞生物科技有限公司)、PCR SuperMix(TransGen，中国)、双蒸水(TransGen，中国)；1×TAE电泳缓冲液(TaKaRa，日本)、琼脂糖(Biowest，法国)、GelRed核酸染料(Biotium，美国)、6×Loading Buffer、DNA Marker(TransGen，中国)；LB培养基、氨苄青霉素、X-Gal、IPTG(TransGen，中国)、19-TVector、感受态细胞(TaKaRa，日本)、Green PCR Master Mix(Vazyme，中国)。
分子生物学试剂盒：FastDNATM Spin Kit DNA提取试剂盒(MP Biomedicals，美国)；AxyPrep PCR产物纯化试剂盒(Axygen，美国)；MiniBest Plasmid Purification KitVer.3.0质粒DNA提取试剂盒(TaKaRa，日本)；E.Z.N.A.TM Cycle-Pure试剂盒(Omega Bio-tek Inc.,美国)。
一种微型厌氧膨胀床反应的试验方法，包括以下步骤：
S1、分组：试验采用四个EGSB反应器1，编号R1、R2、R3、R4，其中R1为对照组，R2、R3、R4为试验组；
S2、反应操作过程：R2、R3和R4进水添加铁离子浓度分别为0.04、0.08、0.14mmol/L，以氯化铁形式提供，氯化铁效果优于其他含铁离子化合物。模拟废水由进水恒流泵4泵入EGSB反应器1，在升流运动中完成氮素转化，气体由顶部的气室14排出，出水由溢流堰13排放，排入出水箱3和通过循环水泵5循环使用，EGSB反应器1出水回流比为8，液面上升速度为0.1m/h，模拟废水pH调节在6.7-6.8，曝高纯氮气(>99.5％)至溶解氧(dissolved oxygen,DO)低于0.5mg/L后，进入密封进水箱2，EGSB反应器1连续进水，温度通过夹套层11控制在35±1℃；
S3、进行以下指标检测：
A、常规指标测定与分析：
出水水样采集后，经0.45μm玻璃纤维膜过滤后，保存于4℃冰箱供后续分析。所测定的水质指标有NH4 +-N、NO2 --N、NO3 --N、COD、总溶解性铁、DO、pH，其检测方法根据国家标准，如表4所示。
表6常规指标分析检测方法
氨氮、亚硝酸盐及总氮去除率参照式1、2、3计算。容积氮负荷(nitrogen loadingrate,NRR)及氮去除速率(nitrogen removal rate,NRR)根据式4，5计算。
C(Inf.NH4 +)、C(Eff.NH4 +)、C(Inf.NO2 -)、C(Eff.NO2 -)、C(Inf.TN)、C(Eff.TN)分别代表进出水中氨氮、亚硝酸盐及总氮浓度，HRT为水力停留时间(hydraulic retentiontime)。
B、比厌氧氨氧活性测定：
从EGSB反应器1中取一定量污泥加入100mL血清瓶中，使血清瓶内VSS为2.0g/L，加入NH4 +-N及NO2--N浓度分别为70和92mg/L的模拟废水80mL，用高纯氮(>99.5％)置换血清瓶中空气15min，保证其无氧环境。血清瓶用丁基橡胶塞塞紧，并用铝盖加固，置于恒温振荡器中，温度设定为35℃，转速为180rpm。用注射器间隔取样，测定血清瓶中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N浓度，由基质降解曲线计算污泥比厌氧氨氧化活性(specific anammox activity,SAA)，所有样品做三个平行；
C、氮素转化功能基因及功能菌丰度测定：
(1)DNA提取
从EGSB反应器1中取一定量污泥，使用试剂盒FastDNATM Spin Kit for soil提取DNA，具体步骤按照配套的说明书进行。
(2)PCR扩增及质粒制备
本研究中定量PCR分析选取bacterial 16S rRNA(细菌16S rRNA)，Anammoxbacterial 16S rRNA(厌氧氨氧化菌16S rRNA)及相关氮素转化功能基因，包括：amoA(编码氨单加氧酶)，napA(编码周质硝酸盐还原酶)，narG(编码膜结合硝酸盐还原酶)，nirK(编码铜型亚硝酸还原酶)，nirS(编码血红素cd1型亚硝酸还原酶)，hzsB(编码联胺合成酶b亚基)。引物选取参考已发表文献，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。具体引物序列、目标基因片段长度及扩增条件见表2-5。
普通PCR反应体系为25μL，包括：12.5μL的PCR SuperMix，2μL DNA模板(稀释至20ng/μL)，正反向引物各1μL(20μM)及8.5μL的ddH2O。扩增程序循环数为25，其余参数与表5相同。含目标基因的扩增产物经AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化试剂盒(Axygen，美国)纯化，将纯化产物连接19-T Vector(TaKaRa，日本)克隆载体，转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，构建质粒标准品。使用MiniBest Plasmid Purification KitVer.3.0质粒DNA提取试剂盒(TaKaRa，日本)提取质粒标准品，由公式计算对应目标基因的拷贝数以备后续分析。
(3)实时荧光定量PCR扩增
定量PCR扩增在实时荧光定量PCR仪AB7500(Life Technologies,美国)上进行，反应体系25μL，包括12.5μLGreen PCR Master Mix(Vazyme，中国)，2μL DNA模板(稀释至20ng/μL)，正反向引物各0.2μL及10.1μL ddH2O。具体扩增程序如表2-5所示。本试验中目标基因扩增效率均在90％-110％之间，标准曲线的相关系数R2大于0.99。
表7定量PCR分析的引物及扩增程序
D、微生物群落结构分析：
微生物群落结构分析基于Illumina Miseq测序平台的16S rRNA高通量测序技术，具体步骤包括DNA样品提取、PCR扩增、扩增产物验证与纯化、测序及后续数据处理。
(1)DNA样品提取
取适量污泥样品，用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒进行DNA提取，提取的DNA样品用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计定量后，置于-20℃条件保存。
(2)PCR扩增
采用细菌通用引物对污泥样品DNA进行16S rRNA扩增，引物序列为：正向引物(5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)，反向引物(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)[122]。扩增体系为50μL，包括2μL DNA模板(稀释至20ng/μL)，4μL MgCl2，4μL DNTP Mixture，0.25μL Ex TaqDNA聚合酶，5μL 10×PCR Buffer(TaKaRa，日本)，正反引物各1μL，剩余体积以无菌超纯水补足，所有样品一式四份。
PCR反应于Veriti PCR仪(Life Technologies，美国)进行，扩增程序为：预变性98℃/5min，扩增循环20次(变性98℃/30s，退火50℃/30s，延伸72℃/40s)，最终延伸72℃/10min。
(3)扩增产物验证与纯化
取5μL扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶做电泳验证，电泳在100V电压下进行，20min后取下置于凝胶成像仪中观察。对检验正常的样品，混合四份PCR扩增产物，用E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit试剂盒进行纯化，纯化后的样品用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计定量。
(4)测序及后续数据处理
纯化后的样品送至江苏中宜金大分析检测有限公司，基于Illumina Miseq测序平台进行高通量测序分析。数据经Sickle及Mothur软件处理后，使用Heml(Version 1.0)绘制热图。
E、污泥形貌粒径及能谱分析：
(1)环境样品扫描电镜(E-SEM)观察
污泥样品预处理参考Araujo JC等进行，具体操作步骤如下：①从EGSB反应器中取适量污泥于离心管中，用超纯水清洗三次，弃上清液；②离心管中加入含2.5％戊二醛的0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，淹没样品，置于4℃冰箱中固定12h；③用0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)冲洗固定好的污泥3次，每次10min；④将污泥样品经系列浓度50％、70％、80％、90％、95％的乙醇中脱水处理，每次10min；⑤将污泥样品用100％的乙醇脱水处理3次，每次10min，而后进行冷冻干燥；⑥冷冻干燥后的污泥，用离子溅射仪(IONSPUTTER,JFC-1100)喷金镀膜，采用环境样品扫描电镜(QuantaTM 250FEG，美国FEI公司)观察。
(2)污泥粒径分析
从EGSB反应器1中取出典型污泥样品至50mL离心管中，置于激光粒度仪(Mastersizer 3000，英国马尔文仪器有限公司)检测。样品充分混匀后，以水为分散剂进行分析测试，并使用机器配置的软件进行记录，使用一次性塑料滴灌吸取搅拌均匀的样品，污泥样加至遮光度在10％～15％时进行测试。单一样品重复测定三次，以降低误差。
(3)能谱分析
能谱仪(energy dispersive spectrometer，EDS)是用来对微区成分元素种类与含量分析，配合环境样品扫描电镜(QuantaTM 250FEG，美国FEI公司)使用，分析污泥样品微生物元素组成，前处理步骤见(1)。
一种微型厌氧膨胀床反应试验装置，EGSB反应器1为小试规模的厌氧膨胀床反应器(expanded granular sludge bed,EGSB)，试验效果好，结构简单，成本低，试验装置由EGSB反应器1、进水箱2、出水箱3、进水恒流泵4、循环水泵5和恒温循环水槽6组成，EGSB反应器1能使微生物有效持留，并使污泥流态化，促进基质传递及产气释放。此外，维持污泥膨胀所进行的出水回流，可削弱基质自抑制效应，非常适于厌氧氨氧化工艺的启动及运行。试验装置设有4个完全一致的ESGB反应器1。EGSB反应器1筒壁外设有夹套层11，EGSB反应器1由有机玻璃制成，其高径比为6，有效容积为0.8L，EGSB反应器1外裹锡纸，有效防止光的负面影响。EGSB反应器1设有四个取样点，取样点17、取样点28、取样点39和取样点410从上到下依次设在EGSB反应器1筒壁上，可以方便采集反应器各个位置的采样。进水恒流泵4一端与进水箱2通过管道连接，另一端与EGSB反应器1底部的入水口12通过管道连接，循环水泵5一端与EGSB反应器1的溢流堰通过管道连接，另一端与EGSB反应器1底部的入水口12通过管道连接，出水箱3与EGSB反应器1的溢流堰13通过管道连接，恒温循环水槽4与夹套层11通过管道连接。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分组：所述试验采用四个EGSB反应器，编号R1、R2、R3、R4，其中R1为对照组，R2、R3、R4为试验组；
S2、反应操作过程：所述R2、R3和R4进水添加铁离子，模拟废水由进水恒流泵(4)泵入EGSB反应器(1)，在升流运动中完成氮素转化，气体由顶部的气室(14)排出，出水由溢流堰(13)排放，排入出水箱(3)和通过循环水泵(5)循环使用，EGSB反应器(1)出水回流比为8，液面上升速度为0.1m/h，模拟废水pH调节在6.7-6.8，曝高纯氮气至溶解氧低于0.5mg/L后，进入密封进水箱(2)，EGSB反应器(1)连续进水，温度通过夹套层(11)控制在35±1℃；
S3、进行以下指标检测：
A、常规指标测定与分析：对出水水样采集后，经0.45μm玻璃纤维膜过滤后，保存于4℃冰箱供后续分析，所测定的水质指标有NH4 +-N、NO2 --N、NO3 --N、COD、总溶解性铁、DO、pH；
B、比厌氧氨氧活性测定：从EGSB反应器(1)中取一定量污泥加入100mL血清瓶中，使血清瓶内VSS为2.0g/L，加入NH4 +-N及NO2--N浓度分别为70和92mg/L的模拟废水80mL，用高纯氮置换血清瓶中空气15min，保证其无氧环境。血清瓶用丁基橡胶塞塞紧，并用铝盖加固，置于恒温振荡器中，温度设定为35℃，转速为180rpm，用注射器间隔取样，测定血清瓶中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N浓度，由基质降解曲线计算污泥比厌氧氨氧化活性，所有样品做三个平行；
C、氮素转化功能基因及功能菌丰度测定：1、DNA提取；2、PCR扩增及质粒制备；3、实时荧光定量PCR扩增；
D、微生物群落结构分析：微生物群落结构分析基于Illumina Miseq测序平台的16SrRNA高通量测序技术，具体步骤包括DNA样品提取、PCR扩增、扩增产物验证与纯化、测序及后续数据处理；
E、污泥形貌粒径及能谱分析：1、环境样品扫描电镜(E-SEM)观察；2、污泥粒径分析；3、能谱分析。
2.根据权利要求1所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法，其特征在于，所述R2、R3和R4进水添加铁离子浓度分别为0.04、0.08、0.14mmol/L，以氯化铁形式提供。
3.根据权利要求1所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法，其特征在于，试验方法中使用的接种污泥为反硝化污泥。
4.根据权利要求1所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验方法，其特征在于，所述R2、R3和R4进水添加的铁离子是以氯化铁形式提供。
5.一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验装置，其特征在于，所述试验装置由EGSB反应器(1)、进水箱(2)、出水箱(3)、进水恒流泵(4)、循环水泵(5)和恒温循环水槽(6)组成，所述EGSB反应器(1)筒壁外设有夹套层(11)，所述EGSB反应器(1)由有机玻璃制成，其高径比为6，有效容积为0.8L，所述进水恒流泵(4)一端与所述进水箱(2)通过管道连接，另一端与所述EGSB反应器(1)底部的入水口(12)通过管道连接，所述循环水泵(5)一端与所述EGSB反应器的溢流堰(13)通过管道连接，另一端与所述EGSB反应器(1)底部的入水口(12)通过管道连接，所述出水箱(3)与所述EGSB反应器(1)的溢流堰(13)通过管道连接，所述恒温循环水槽(6)与所述夹套层(11)通过管道连接。
6.根据权利要求1所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验装置，其特征在于，所述EGSB反应器(1)为小试规模的厌氧膨胀床反应器。
7.根据权利要求1和2所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验装置，其特征在于，所述试验装置设有4个完全一致的ESGB反应器(1)。
8.根据权利要求1和2所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验装置，其特征在于，所述EGSB反应器(1)外裹锡纸。
9.根据权利要求1和2所述的一种研究铁离子对厌氧氨氧化能效影响的试验装置，其特征在于，所述EGSB反应器(1)设有四个取样点，所述取样点1(7)、取样点2(8)、取样点3(9)和取样点4(10)从上到下依次设在EGSB反应器筒壁上。
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