CN108034002A - 一种生物活性多肽peviesppeintv及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV及其制备方法和应用，生物活性多肽PEVIESPPEINTV其氨基酸序列为Pro‑Glu‑Val‑Ile‑Glu‑Ser‑Pro‑Pro‑Glu‑Ile‑Asn‑Thr‑Val。经过体外抗炎活性实验、体内抗衰老实验，验证了多肽PEVIESPPEINTV具有较好的抗炎活性和抗衰老活性，一方面，本发明的生物活性多肽PEVIESPPEINTV能够促进巨噬细胞分泌细胞因子，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率；另一方面，能够提高体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性刺激的功能，从而降低机体老化、衰老和生病的机率，对开发具有抗炎功能、抗衰老功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV及其制备方法和应用。
背景技术
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性肽”。
在天然食物来源中寻找安全的生物活性肽尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的生物活性，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有生物活性的多肽是由2～20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。
免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的乳源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。
研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的释放、促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。
衰老是一个自然现象，且过程常伴有抗氧化水平、器官组织、免疫因子的变化，其中细胞因子发生着复杂的变化，如促炎细胞因子IL-6、IL-4、TNF-α等呈现增长的趋势，IL-6与TNF-a均被认为在老年性疾病的发生过程中扮演重要角色。随着遗传学和分子生物学的发展，生物衰老机理的研究取得了可喜的进展。研究人员通过利用一些模式生物，如小鼠、果蝇和秀丽线虫等的单一基因突变实验，发现有些基因能够显著增加这些生物体的寿命达6倍之多。
抗衰老肽作为一种新兴的抗衰老剂，在生理功能方面具有氨基酸所不能比拟的优势，其能对生物体内的酶产生促进或抑制作用，改善对矿物质及其他营养元素的吸收和利用，清除体内自由基，增强机体自身的抗氧化力，以延缓衰老。因此，生物活性肽的营养保健作用已成为国内外学者课题研究的重点。邱隽等人经实验研究发现，乳源性生物活性小肽能有效延长果蝇寿命，延缓其衰老，并且还具有较好的抗氧化作用，推测可能是其中富含琉基肽类。周之辉等发现牛初乳提取物能显著性提高老年人体内血清中SOD活力，减少其脂质过氧化物和增强机体抗氧化力，具有一定的抗衰老功能。
目前关于生物活性多肽的研究有很多，比如中国专利CN105254738A公布了一种来源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽DELQDKIH，中国专利CN105254739A公布了一种来源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽GTQYTD，中国专利CN105254740A公布了一种来源于αs2-酪蛋白的乳源性生物活性多肽NQFYQKF。
专利US8106152B2公布了氨基酸序列为Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu的多肽，也公布了氨基酸序列为Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys ThrGlu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser(P)Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr IleGlu Ala Val Glu Ser Thr Val Ala Thr Leu Glu Ala Ser(P)Pro Glu Val Ile Glu SerPro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val的多肽，该专利公开的是一个大分子物质，其可消化吸收性较差，同时该专利公开的大分子生物活性具有抗菌性能，并没有公开其是否有其他性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV，其氨基酸序列为Pro-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val，如SEQ ID NO：1所示。
较优的，所述生物活性多肽为乳源性。具体来源于κ-酪蛋白，并且为κ-酪蛋白变体A第171～183位的氨基酸残基。κ-酪蛋白变体A第171～183位的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
κ-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术，编码κ-酪蛋白变体A第171～183位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽PEVIESPPEINTV。
较优的，所述生物活性多肽具有抗炎功能和抗衰老功能。
本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的核苷酸片段，其序列为：5’-cca gaa gtt att gag agc cca cct gag atc aac aca gtc-3’，如SEQ ID NO：2所示。
本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
本发明第六方面，提供了所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV在制备同时具有抗炎功能和抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
具体而言，本发明的生物活性多肽PEVIESPPEINTV可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗炎和/或抗衰老的药物；并且由于本发明的生物活性多肽PEVIESPPEINTV通过胃肠道降解后的产物仍旧具有生物活性，因此还可以用于制备酸奶等食品、调节免疫力的保健品，以及口服的用于制备具有抗炎和/或抗衰老的药物。
本发明第七方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV或所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品；所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物，是指在生物活性多肽PEVIESPPEINTV的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第八方面，提供了一种抗衰老产品，包括所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV或所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物；所述的抗衰老产品包括抗衰老食品、抗衰老保健品或抗衰老药物；所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物，是指在生物活性多肽PEVIESPPEINTV的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第九方面，提供了一种同时具有抗炎功能和抗衰老功能的产品，包括所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV或所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物；具有抗炎功能和抗衰老功能的产品包括食品、保健品或药物；所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物，是指在生物活性多肽PEVIESPPEINTV的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明生物活性多肽PEVIESPPEINTV的有益效果为：本发明的乳源性生物活性多肽PEVIESPPEINTV具有较好的抗炎活性和抗衰老活性；一方面，本发明的生物活性多肽PEVIESPPEINTV能够促进巨噬细胞分泌细胞因子，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率；另一方面，能够提高体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性刺激的功能，从而降低机体老化、衰老和生病的机率，对开发具有抗炎功能、抗衰老功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
本申请多肽在结构和功能上与现有技术(氨基酸序列为Met Ala Ile Pro ProLys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser(P)Gly GluPro Thr Ser Thr Pro Thr Ile Glu Ala Val Glu Ser Thr Val Ala Thr Leu Glu AlaSer(P)Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser ThrAla Val的多肽)有着本质的区别：本发明生物活性多肽PEVIESPPEINTV是一种小分子生物活性片段，属于核心片段；本发明生物活性多肽PEVIESPPEINTV更具有可消化吸收性。同时本发明生物活性多肽PEVIESPPEINTV具有抗炎功能和抗衰老功能，在功能活性上与现有技术中公开的多肽具有显著的差异。
附图说明
图1：质量色谱提取图(m/z＝712.3719)；
图2：质荷比为712.3719的片段的二级质谱图；
图3：质荷比为712.3719的多肽az、by断裂情况；
图4：不同浓度生物活性多肽PEVIESPPEINTV对果蝇寿命的影响；
图5：过氧化氢(H2O2)急性实验。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽PEVIESPPEINTV的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Pro适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Glu、Val、Ile、Glu、Ser、Pro、Pro、Glu、Ile、Asn、Thr和Val。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽PEVIESPPEINTV。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100-1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽PEVIESPPEINTV进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱提取图如图1所示，提取此峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2和3所示，可得此峰的多肽质荷比为712.3719Da，保留时间是76.3min。
3)结果
由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比712.3719Da的片段序列为Pro-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val(PEVIESPPEINTV)，记为SEQ ID NO：1。该片段与κ-酪蛋白变体A第182～195位的残基序列相对应，κ-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30433.1，序列见SEQ ID NO：3。
实施例2生物活性肽的抗炎活性实验
一、生物活性多肽PEVIESPPEINTV的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽PEVIESPPEINTV；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α、IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素-过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽PEVIESPPEINTV对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
从表1中可知，在TNF-α、IL-1β和IL-6这三种细胞因子的实验结果中，TNF-α、IL-1β在0.2mg/ml及以上出现了显著性差异(P＜0.01)，IL-6在0.5mg/ml出现了显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的PEVIESPPEINTV可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放TNF-α、IL-1β、IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的底值，从而调节机体的免疫力。
二、生物活性多肽PEVIESPPEINTV的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的乳源性生物活性多肽PEVIESPPEINTV；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表2生物活性多肽PEVIESPPEINTV促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定
实验分组 正常组 炎症组
细胞空白 0.0592±0.00525 0.3241±0.0381
PEVIESPPEINTV 1mg/ml 0.1374±0.0432** 0.4794±0.0653**
PEVIESPPEINTV 0.5mg/ml 0.1246±0.0674** 0.3853±0.0467**
PEVIESPPEINTV 0.1mg/ml 0.2635±0.0473**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表2，由表2可知，在实验组中添加生物活性多肽PEVIESPPEINTV，浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用。与细胞空白组相比，具有显著性差异(P<0.05)。当生物活性多肽PEVIESPPEINTV的添加浓度为0.1mg/mL，在LPS造炎症情况下相比，也能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，并具有显著性差异(P<0.05)。但是与正常情况下生长的细胞空白组相比，没有显著性差异。说明生物活性多肽PEVIESPPEINTV在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。
实施例3生物活性肽的抗衰老活性实验
一、生物活性多肽PEVIESPPEINTV提高果蝇生存能力的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：Oregon K野生型黑腹果蝇，上海交通大学农学院遗传学实验室；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽PEVIESPPEINTV。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；BJ-CD SERIES生物培养箱，上海博讯实业公司；GRX-9073型热空气消毒箱，上海一恒科技有限公司。
2.实验方法：
以果蝇为实验模型：收集8小时内新羽化的果蝇成虫，麻醉后分雌雄随机转移到各实验组中，每组每个性别100只，每组设置3个平行，对照组给予普通玉米粉培养基，实验组分别为含有0.05mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的PEVIESPPEINTV生物活性肽-玉米培养基。每2天更换新鲜培养基一次，每天观察并记录不同性别果蝇的死亡数，直到果蝇全部死亡为止。绘制果蝇生存曲线，并计算出不同性别果蝇的平均寿命和最高寿命(取最后死亡的5只果蝇进行统计)。
3.实验结果及分析：
本实验对喂食不同浓度生物活性肽的果蝇寿命的研究结果如下：从图4(A)中可以发现，相对于空白对照组雄性果蝇而言，喂食浓度为0.05mg/ml的PEVIESPPEINTV并没有显著改变雄性果蝇的存活率，而当肽浓度达到0.5mg/ml和1mg/ml时，相同时间点，雄性果蝇的存活率有了明显提高。从图4(B)看，相对于空白对照组雌性果蝇，喂食浓度为0.5mg/ml和1mg/ml时，在相同时间点，雌性果蝇的存活率有所提高，但结果差异不明显。
表3-1PEVIESPPEINTV对雄性果蝇寿命的影响情况
注：*标示与空白对照组比较，有显著性差异(P<0.05)；下同。
表3-2PEVIESPPEINTV对雌性果蝇寿命的影响情况
从表3-1中可知，相对于空白对照组，低剂量组雄性果蝇平均寿命没有明显变化，但中剂量组和高级量组雄性果蝇平均寿命均有提高，分别为16.91％和9.71％，但仅中剂量组产生了显著性差异(p<0.05)，说明中剂量组雄性果蝇的平均寿命显著性提高。同时，中剂量组和高剂量组果蝇的半数死亡时间得到了提高，但最长寿命方面均未有明显差异。由表3-2可知，雌性果蝇低剂量组、中剂量组和高剂量组在平均寿命方面均有所提高，但均未产生显著性差异。但中剂量组和高剂量组的最长寿命均有所提高，较空白对照组分别延长7天和6天，并产生了显著性差异(P<0.05)。
本实验结果说明，生物活性多肽PEVIESPPEINTV在一定浓度下可以提高果蝇的平均寿命和最长寿命，但与浓度和性别有关。这种与受试物浓度、品系相关的现象可能是因为PEVIESPPEINTV参与果蝇的部分生物代谢，或者是通过改善果蝇组织的抗氧化体系来达到延长果蝇寿命的效果。由于不同品系果蝇的代谢会有区别，从而造成结果的差异。而性别的差异，可能是由于雌性果蝇本身就具有一定的保守性和对外界环境的抵抗力，所以PEVIESPPEINTV对雌性果蝇寿命延长并不明显。
二、生物活性多肽PEVIESPPEINTV过氧化氢急性氧化性实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：Oregon K野生型黑腹果蝇，上海交通大学农学院遗传学实验室；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢，上海凌峰化学试剂有限公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽PEVIESPPEINTV。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法：
收集8小时内新羽化的果蝇成虫，麻醉后分雌雄随机转移到各实验组中，取寿命实验中结果较好的肽浓度培养基，设置空白对照组和实验组，对照组给予普通玉米粉培养基。每组雌雄性别果蝇均为50只，对果蝇培养三周。然后每次取5只雄性和5只雌性果蝇转移到一个新的容器中，新的容器内含有一个纸质圆盘，圆盘含有300μL浓度为5％的蔗糖溶液以及浓度为30％过氧化氢1ml，空白组和实验组均暴露在这种过氧化氢产生的毒性过氧化物环境中，每组设置10个平行样，观察其抗氧化能力。每4小时记录果蝇死亡数量和性别，直到果蝇全部死亡。
3.实验结果及分析：
从图5(A)中可以看出，对于雄性果蝇，经过PEVIESPPEINTV喂食后，在各个时间点，雄性果蝇的存活率均高于未经PEVIESPPEINTV喂食的果蝇，且存活时间较空白对照组有所提高，说明喂食PEVIESPPEINTV后，雄性果蝇抗氧化能力有所提高。图5(B)中，喂食PEVIESPPEINTV的雌性果蝇，在高浓度的过氧化氢环境中15h内存活率明显高与对照组，说明这段时间雌性果蝇抗氧化能力有所提高。但后期实验组和对照组存活曲线基本重合，说明喂食PEVIESPPEINTV的雌性果蝇的抗氧化能力逐渐减弱，经过一定时间后与对照组没有差异。此实验结果表明，PEVIESPPEINTV可以提高果蝇的抗氧化能力。根据H2O2急性毒性实验结果，可以推测PEVIESPPEINTV可能通过调节过氧化氢酶CAT活性来提高果蝇对H2O2损伤的抵抗能力。
三、生物活性多肽PEVIESPPEINTV对果蝇SOD和MAD含量影响的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：Oregon K野生型黑腹果蝇，上海交通大学农学院遗传学实验室；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；MDA脂质过氧化物试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；SOD超氧化物歧化酶试剂盒，南京建成生物科技有限公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽PEVIESPPEINTV。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；组织匀浆器，上海元象生物科技有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；BJ-CD SERIES生物培养箱，上海博讯实业公司；GRX-9073型热空气消毒箱，上海一恒科技有限公司；Infinite型酶标仪，奥地利帝肯有限公司。
2.实验方法：
收集8小时内新羽化的果蝇成虫，麻醉后分雌雄随机转移到各实验组中，每组每个性别100只，每组设置3个平行，对照组给予普通玉米粉培养基，实验组分别为含有0.05mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的PEVIESPPEINTV生物活性肽-玉米培养基。每2天更换新鲜培养基一次，饲养30天后，每组称取果蝇40mg，加0.5ml生理盐水，在冰浴中研磨匀浆，间歇10s秒，反复进行3次，制成匀浆，按照试剂盒说明测定每组果蝇SOD活性及MDA浓度含量。利用MDA检测试剂盒检测果蝇体内的脂质过氧化产物MDA的浓度含量，分光光度计的波长为532nm。
3.实验结果及分析：
表4PEVIESPPEINTV对果蝇SOD、MDA的影响
从表4中可知，相对于空白对照组，多肽处理组雌雄果蝇体内的SOD含量均有提高，且对于雄性果蝇组而言，在肽浓度达到1mg/ml时，果蝇体内的SOD含量出现显著性差异，而雌性果蝇组则在肽浓度为0.5mg/ml和1mg/ml时出现显著差异。说明通过摄入一定的多肽，可以提高体内的SOD含量，并帮助机体保护自身防止氧化损伤。从表4中MDA含量可以看到，实验组雄性果蝇和雌性果蝇体内的MDA含量均有降低。相对于雄性空白对照组MDA含量1.37±0.21μmol/L，浓度为0.5mg/ml和1mg/ml果蝇组的MDA含量出现显著性的降低，而雌性果蝇组中，在1mg/ml肽处理时，果蝇体内的MDA含量出现显著性的降低。由于MDA是体内脂质过氧化而生成的，其含量的降低间接地说明果蝇的抗氧化酶系活力得到了提高，从而保护机体组织器官不会产生大量脂质过氧化物。
从实验结果可以看出，SOD和MDA的实验结果相互佐证，可以说明生物活性多肽PEVIESPPEINTV有助于提高机体体内的抗氧化酶系的活力，从而能有效提高机体的抗氧化能力，减少机体受不良因子的刺激，从而降低机体老化、衰老和生病机率，总体来看，对于雄性果蝇的作用要好于雌性果蝇。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司；上海铂辉生物科技有限公司
<120> 一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val
1 5 10
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagaagtta ttgagagccc acctgagatc aacacagtc 39
<210> 3
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr Ile Leu Ala Leu Thr Leu
1 5 10 15
Pro Phe Leu Gly Ala Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ile Arg Cys
20 25 30
Glu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys Ile Ala Lys Tyr Ile Pro
35 40 45
Ile Gln Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Val Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Tyr Pro
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Gln
85 90 95
Trp Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys Ser Cys Gln Ala Gln
100 105 110
Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro His Pro His Leu Ser Phe Met Ala
115 120 125
Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn
130 135 140
Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val
145 150 155 160
Glu Ser Thr Val Ala Thr Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser
165 170 175
Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val
180 185 190

Claims (10)

1.一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV，其特征在于，其氨基酸序列为Pro-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val。
2.根据权利要求1所述的一种生物活性多肽PEVIESPPEINTV，其特征在于，所述生物活性多肽为乳源性。
3.编码权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，或从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。
5.如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的应用，其特征在于，所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
6.如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的应用，其特征在于，所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
7.如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的应用，其特征在于，所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV在制备具有抗炎功能和抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
8.一种抗炎产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV或所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品；所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物，是指在生物活性多肽PEVIESPPEINTV的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物。
9.一种抗衰老产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV或所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物；所述的抗衰老产品包括抗衰老食品、抗衰老保健品或抗衰老药物；所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物，是指在生物活性多肽PEVIESPPEINTV的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物。
10.一种具有抗炎功能和抗衰老功能的产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV或所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物；具有抗炎功能和抗衰老功能的产品包括食品、保健品或药物；所述生物活性多肽PEVIESPPEINTV的衍生物，是指在生物活性多肽PEVIESPPEINTV的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物。
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