CN108018227B - 大肠杆菌培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌培养基，有以下原料组成：鸡蛋液10‑15％、蛋白酶组合物A 0.7‑8％、蛋白组合物B 0.8‑1.5％、糖类组合物C 0.01‑0.03％、余量为去离子水。本发明培养基原料均属于日常生活中常见的成分，来源广，成本低廉，培养周期短，容易获得理想的高浓度大肠杆菌菌液。

Description

大肠杆菌培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物培养基领域，特别是涉及一种大肠杆菌培养基及其制备方法。

背景技术

大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希氏菌”，属于肠道杆菌大类中的一种，是寄生在人体大肠里一种普通的原核生物。由于结构简单，基因组已被测序，经常作为生物学上的实验材料，广泛应用于科学研究。

培养基是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，由于微生物、植物组织和动物组织的种类和研究目的不同，在培养基组成成分的配制上各有差异。

现有方案中，经常使用LB液体培养基用于培养细菌，LB培养基是一种培养基的名称，生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。可分为液体培养基和固体培养基。但是，这种培养基需要大量的蛋白胨和酵母粉，成本高，不宜大批量配制，目前只停留在实验室使用阶段。因此，寻找一种可替代LB培养基的廉价的、高效的培养基，是急需解决的问题。

发明内容

基于此，本发明提供一种廉价、高效的大肠杆菌培养基。

一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液10-15％；蛋白酶组合物A 0.7-8％；蛋白组合物B 0.8-1.5％；糖类组合物C0.01-0.03％；余量为去离子水。

在其中一个实施例中，所述大肠杆菌培养基由以下原料组成：

鸡蛋液12-15％；蛋白酶组合物A 1-8％；蛋白组合物B 1-1.5％；糖类组合物C0.015-0.025％；余量为去离子水。

在其中一个实施例中，所述大肠杆菌培养基由以下原料组成：

鸡蛋液15％；蛋白酶组合物A 8％；蛋白组合物B 1.2％；糖类组合物C 0.025％；余量为去离子水。

在其中一个实施例中，所述蛋白酶组合物A包括蛋白酶、木瓜皮的至少一种。蛋白酶组合物A的作用是将培养基中的蛋白质水解，为大肠杆菌提供充分的碳源和氮源，因此，蛋白酶组合物的种类不限，只要能将大肠杆菌培养基中的蛋白质水解即可。例如，蛋白酶组合物A为是蛋白酶、木瓜皮或其他含有蛋白酶的物质的一种或几种。

在其中一个实施例中，所述蛋白组合物B包括黄豆粉、绿豆、赤豆的至少一种。蛋白组合物B的作用是为大肠杆菌培养基提供蛋白质，也可以为大肠杆菌培养基提供碳水化合物。例如，蛋白组合物B为是黄豆、黄豆粉、绿豆、赤豆、黑豆或其他豆类、豆制品的一种或几种。

在其中一个实施例中，所述糖类组合物C包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的至少一种。糖类组合物C为大肠杆菌培养基提供碳源，可以是微生物可直接利用的葡萄糖，也可以是水解之后产生葡萄糖的多糖。例如，糖类组合物C为葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖或其他糖类的一种或几种。

本发明的大肠杆菌培养基，主要原料的作用如下：

鸡蛋：鸡蛋又名鸡卵、鸡子，是母鸡所产的卵。其外有一层硬壳，内则有气室、卵白及卵黄部分。富含胆固醇，营养丰富，一个鸡蛋重约50克，含蛋白质7克。鸡蛋蛋白质的氨基酸比例很适合人体生理需要、易为机体吸收，利用率高达98％以上，营养价值很高，是人类常食用的食物之一。每100克鸡蛋的营养成分：能量156千卡、蛋白质12.8克、脂肪11.1克、碳水化合物1.3克、叶酸113.3微克、胆固醇510毫克、维生素A194微克、硫胺素0.13毫克、核黄素0.32毫克、烟酸0.2毫克、维生素E2.29毫克、钙56毫克、磷130毫克、钾154毫克、钠131.5毫克、碘27.2微克、镁10毫克、铁2毫克、锌1.1毫克、硒14.34微克、铜0.15毫克、锰0.04毫克。

蛋白酶：蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。

木瓜皮：木瓜的表皮，含有丰富的木瓜蛋白酶，残留的果肉中还含有果糖。

黄豆：在豆类中营养价值最高。内含40％蛋白质，脂肪含量丰富高达25％。大豆含蛋白质比牛肉多，钙含量比牛奶高。卵磷脂含量比鸡蛋高，还含有丰富的矿物质、维生素。每100克黄豆含水分10.2克，蛋白质36.3克，脂肪18.4克，碳水化合物25.3克，粗纤维4.8毫克，钙367毫克，磷571毫克，铁11毫克，胡萝卜素0.4毫克，维生素B10.79毫克，维生素B20.25毫克，尼克酸2.1毫克，可供热量419千卡。

葡萄糖：葡萄糖(Glucose)(化学式C6H12O6)是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛，可作为微生物直接利用的碳源。

本发明另一个目的是提供一种大肠杆菌培养基的制备方法。包括以下步骤：

按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；

将鸡蛋液、蛋白酶组合物A、蛋白组合物B和去离子水混合，于50-60℃保温6-10h，得混合物；

将所述混合物煮沸，沉淀，过滤，得大肠杆菌培养基清液；

向所述大肠杆菌培养基清液加入糖类组合物C，用去离子水定容；

调节定容后的所述大肠杆菌培养基清液的pH值为6.8-7.2；

将调节pH值后的所述大肠杆菌清液蒸汽灭菌20-40min，即得大肠杆菌培养基。

本发明的另一个目的是提供一种大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌斜面，接种至上述大肠杆菌培养基中，在35-39℃、180-220rpm恒温摇床中培养10-14h，得种子培养液；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将所述种子培养液接种上述的大肠杆菌培养基中，在35-39℃、180-220rpm恒温摇床中培养10-14h，即得大肠杆菌菌液。

在其中一个实施例中，所述种子液扩大培养步骤中，接种量为所述大肠杆菌培养基体积总量的1.5-2％。

与现有方案相比，本发明具有以下有益效果：

本发明细菌培养基的主要成分是鸡蛋液，鸡蛋液与蛋白组合物B中，含有蛋白质、脂肪、铁、钙、钾、钠、DHA和卵磷脂、卵黄素等多种营养物质，经过蛋白酶组合物A水解后，可以为大肠杆菌提供充足的碳源和氮源，糖类组合物C为微生物提供碳源，这些原料为大肠杆菌提供了足够种类和数量的营养物质来代谢和繁殖。本发明培养基原料均属于日常生活中常见的成分，来源广，成本低廉，培养周期短，容易获得理想的高浓度大肠杆菌菌液。

本发明培养基能够满足大肠杆菌的生命代谢活动，在培养大肠杆菌能发挥更好的效果的同时，比LB培养基成本更低，从而能在一定程度上取代LB培养基。两者成本详见表1、表2：

表1 1L LB培养基的成本

蛋白胨10g	3元
		酵母粉5g	1.1元
氯化钠10g	0.116元
		共计	4.216元

表2 1L本发明培养基的成本

鸡蛋液100～150g	0.4～0.6元
		黄豆粉8～15g	0.104～0.195元
木瓜皮50～80g	0.001～0.0016元
		葡萄糖0.1～0.3g	0.00028-0.00084元
共计	0.50528～0.79744元

参考品牌：Oxoid胰蛋白胨LP0043B 500g、Oxoid酵母粉LP0021 500g、科密欧(广东)AR氯化钠分析纯500g，其他价格均参考市场价。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的大肠杆菌培养基作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液150g；木瓜皮80g；黄豆粉12g；葡萄糖0.25g；去离子水1000ml。

上述大肠杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料，磨碎混合；

(2)将磨碎后的所述各原料于55℃保温8h，得混合物；

(3)将所述混合物煮沸，沉淀，用300目纱布过滤，得到大肠杆菌培养基浊液，再用0.22μm纤维膜过滤，得到大肠杆菌培养基清液；

(4)定容，向所述大肠杆菌培养基清液加入葡萄糖，用去离子水定容至1000ml；

(5)使用NaOH/HCl溶液调节定容后的所述大肠杆菌培养基清液的pH值为7.0；

(6)分装、灭菌，将调节pH值后的所述大肠杆菌培养基清液分装至250ml锥形瓶，每瓶100ml，在0.11MPa，121℃条件下，高压蒸汽灭菌30min，即得大肠杆菌培养基，置于4℃条件下保存备用。

上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用接种环接种至含有5ml所述大肠杆菌培养基的试管中，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h即得种子培养液，将所述种子培养液置于4℃条件下保存备用；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将保存的所述种子培养液用移液枪接种到含有100ml所述大肠杆菌培养基的250ml锥形瓶中，所述接种量为所述大肠杆菌培养基体积总量的2.0％，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h。

按照上述实施例的方法，得到大肠杆菌菌液A1。

对比例1

配制LB培养基，由以下原料组成：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水975ml。

上述LB培养基的制备方法为：将各组分原料添加到容器内，摇动容器直至溶质溶解，用NaOH/HCl调节pH值至7.0。

上述LB培养基培养大肠杆菌的方法包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用接种环接种至含有5ml所述LB培养基的试管中，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h即得种子培养液，将所述种子培养液置于4℃条件下保存备用；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将保存的所述种子培养液用移液枪接种到含有100ml所述LB培养基的250ml锥形瓶中，所述接种量的体积为所述大肠杆菌培养基体积总量的2.0％，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h。

按照上述对比例的方法，得到大肠杆菌菌液A2。

菌液OD600的测定：使用UV-1100型紫外可见分光光度计测量菌液在600nm波长的OD值。

(1)开启仪器自检结束后，仪器进入预热状态，预热时间为20分钟。

(2)在系统主界面下，设定波长为600nm。

(3)各取空白培养基为对照品，在当前工作波长下进行调100.0％T。

(4)吸取适量菌液测定OD600，所得结果如表3：

表3实施例1与对比例1测定结果

实施例2

本实施例提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液120g；木瓜皮60g；黄豆粉10g；葡萄糖0.15g；去离子水1000ml。

上述大肠杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料，磨碎混合；

(2)将磨碎后的所述各原料于55℃保温8h，得混合物；

(3)将所述混合物煮沸，沉淀，用200目纱布过滤，得到大肠杆菌培养基浊液，再用0.45μm纤维膜过滤，得到大肠杆菌培养基清液；

(4)定容，向所述大肠杆菌培养基清液加入葡萄糖，用去离子水定容至1000ml；

(5)使用NaOH/HCl溶液调节定容后的所述大肠杆菌培养基清液的pH值为7.0；

(6)分装、灭菌，将调节pH值后的所述大肠杆菌培养基清液分装至250ml锥形瓶，每瓶100ml，在0.11MPa，121℃条件下，高压蒸汽灭菌30min，即得大肠杆菌培养基，置于4℃条件下保存备用。

上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用接种环接种至含有5ml所述大肠杆菌培养基的试管中，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h即得种子培养液，将所述种子培养液置于4℃条件下保存备用；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将保存的所述种子培养液用移液枪接种到含有100ml所述大肠杆菌培养基的250ml锥形瓶中，所述接种量的体积为所述大肠杆菌培养基体积总量的1.5％，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h。

按照上述实施例的方法，得到大肠杆菌菌液B1。

对比例2

配制LB培养基，由以下原料组成：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水975ml。

上述LB培养基的制备方法为：将各组分原料添加到容器内，摇动容器直至溶质溶解，用NaOH/HCl调节pH值至7.0。

上述LB培养基培养大肠杆菌的方法包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用接种环接种至含有5ml所述LB培养基的试管中，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h即得种子培养液，将所述种子培养液置于4℃条件下保存备用；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将保存的所述种子培养液用移液枪接种到含有100ml所述LB培养基的250ml锥形瓶中，所述接种量的体积为所述大肠杆菌培养基体积总量的1.5％，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h。

按照上述对比例的方法，得到大肠杆菌菌液B2。

菌液OD600的测定：使用UV-1100型紫外可见分光光度计测量菌液在600nm波长的OD值。

(1)开启仪器自检结束后，仪器进入预热状态，预热时间为20分钟。

(2)在系统主界面下，设定波长为600nm。

(3)各取空白培养基为对照品，在当前工作波长下进行调100.0％T。

(4)吸取适量菌液测定OD600，所得结果如表4：

表4实施例2与对比例2测定结果

实施例3

本实施例提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液100g；木瓜皮55g；黄豆粉8g；葡萄糖0.3g；去离子水1000ml。

上述大肠杆菌培养基的制备方法与实施例1相同。

上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用接种环接种至含有5ml所述大肠杆菌培养基的试管中，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h即得种子培养液，将所述种子培养液置于4℃条件下保存备用；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将保存的所述种子培养液用移液枪接种到含有100ml所述大肠杆菌培养基的250ml锥形瓶中，所述接种量的体积为所述大肠杆菌培养基体积总量的1.5％，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h。

按照上述实施例的方法，得到大肠杆菌菌液C1。

对比例3

配制LB培养基，由以下原料组成：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水975ml。

上述LB培养基的制备方法为：将各组分原料添加到容器内，摇动容器直至溶质溶解，用NaOH/HCl调节pH值至7.0。

上述LB培养基培养大肠杆菌的方法包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌斜面，用接种环接种至含有5ml所述LB培养基的试管中，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h即得种子培养液，将所述种子培养液置于4℃条件下保存备用；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将保存的所述种子培养液用移液枪接种到含有100ml所述LB培养基的250ml锥形瓶中，所述接种量的体积为所述大肠杆菌培养基体积总量的1.5％，接种后，在37℃、200rpm恒温摇床中培养12h。

按照上述对比例的方法，得到大肠杆菌菌液C2。

菌液OD600的测定：使用UV-1100型紫外可见分光光度计测量菌液在600nm波长的OD值。

(1)开启仪器自检结束后，仪器进入预热状态，预热时间为20分钟。

(2)在系统主界面下，设定波长为600nm。

(3)各取空白培养基为对照品，在当前工作波长下进行调100.0％T。

(4)吸取适量菌液测定OD600，所得结果如表5：

表5实施例3与对比例3测定结果

实施例4

本实施例提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液120g；蛋白酶10g；绿豆粉15g；蔗糖0.1g；去离子水1000ml。

上述大肠杆菌的培养基的制备方法与实施例1相同。

上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法与实施例1相同。

按上述实施例的方法，得到大肠杆菌菌液D。

实施例5

本实施例提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液100g；蛋白酶7g；赤豆14g；麦芽糖0.2g；去离子水1000ml。

上述大肠杆菌的培养基的制备方法与实施例1相同。

上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法与实施例1相同。

按上述实施例的方法，得到大肠杆菌菌液E。

对比例4

本对比例提供一种大肠杆菌培养基，由以下原料组成：

鸡蛋液140g；黄豆粉12g；葡萄糖0.25g；去离子水1000ml。

上述大肠杆菌的培养基的制备方法与实施例1相同。

上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法与实施例1相同。

按上述实施例的方法，得到大肠杆菌菌液F。

菌液OD600的测定：使用UV-1100型紫外可见分光光度计测量菌液在600nm波长的OD值。

(1)开启仪器自检结束后，仪器进入预热状态，预热时间为20分钟。

(2)在系统主界面下，设定波长为600nm。

(3)各取空白培养基为对照品，在当前工作波长下进行调100.0％T。

(4)吸取适量菌液测定OD600，所得结果如表6：

表6大肠杆菌菌液的OD600测试结果

通过上表，可知，本发明的培养基，在符合上述原料配比的条件下，各原料可以进行任意组合，并且皆能够满足大肠杆菌的生命代谢活动；未经蛋白酶处理的大肠杆菌培养基，大肠杆菌较难利用，生长缓慢。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种大肠杆菌培养基，其特征在于，由以下重量百分比的原料制备而成：

鸡蛋液10-15%；蛋白酶组合物A 0.7-8%；蛋白组合物B 0.8-1.5%；糖类组合物C 0.01-0.03%；余量为去离子水；

所述蛋白组合物B包括黄豆粉、绿豆粉、赤豆的至少一种；

所述蛋白酶组合物A包括蛋白酶、木瓜皮的至少一种；

所述糖类组合物C包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的至少一种；

所述大肠杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

按所述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；

将所述鸡蛋液、蛋白酶组合物A、蛋白组合物B和去离子水混合，于50-60℃保温6-10h，得混合物；

将所述混合物煮沸，沉淀，过滤，得大肠杆菌培养基清液；

向所述大肠杆菌培养基清液加入糖类组合物C，用去离子水定容；

调节定容后的所述大肠杆菌培养基清液的pH值为6.8-7.2；

将调节pH值后的所述大肠杆菌清液蒸汽灭菌20-40min，即得所述大肠杆菌培养基。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌培养基，其特征在于，由以下原料组成：

鸡蛋液12-15%；蛋白酶组合物A 1-8%；蛋白组合物B 1-1.5%；糖类组合物C 0.01-0.025%；余量为去离子水。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌培养基，其特征在于，由以下原料组成：

鸡蛋液15%；蛋白酶组合物A 8%；蛋白组合物B 1.2%；糖类组合物C 0.025%；余量为去离子水。

4.根据权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌培养基，其特征在于，所述蛋白酶组合物A为蛋白酶。

5.根据权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌培养基，其特征在于，所述蛋白组合物B为黄豆粉。

6.根据权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌培养基，其特征在于，所述糖类组合物C为葡萄糖。

7.一种大肠杆菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

按权利要求1-3任一项所述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；

将鸡蛋液、蛋白酶组合物A、蛋白组合物B和去离子水混合，于50-60℃保温6-10h，得混合物；

将所述混合物煮沸，沉淀，过滤，得大肠杆菌培养基清液；

向所述大肠杆菌培养基清液加入糖类组合物C，用去离子水定容；

调节定容后的所述大肠杆菌培养基清液的pH值为6.8-7.2；

将调节pH值后的所述大肠杆菌清液蒸汽灭菌20-40min，即得大肠杆菌培养基。

8.一种大肠杆菌的培养方法，其特征在，包括以下步骤：

种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌斜面，接种至权利要求1所述的大肠杆菌培养基中，在37℃、180-220rpm恒温摇床中培养10-14h，得种子培养液；

种子液的扩大培养：在无菌条件下，将所述种子培养液接种至权利要求1所述的大肠杆菌培养基中，在37℃、180-220rpm恒温摇床中培养10-14h，即得大肠杆菌菌液。

9.根据权利要求8所述的大肠杆菌培养方法，其特征在于，所述种子液扩大培养步骤中，接种量为所述大肠杆菌培养基体积总量的1.5-2%。