CN108007584B - 基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，该方法利用单光子雪崩二极管作为探测器件，通过离散与混叠复用的探测窗口进行光子采样。通过蒙特卡罗仿真的原理，拟合出荧光衰减曲线，计算出荧光寿命。整个电路工作分为探测的准备阶段、探测阶段和读出阶段。在探测阶段，激光使待测样品荧光激发，利用控制SPAD的工作状态以及门控选通信号控制光子引起的雪崩脉冲的选通来实现离散与混叠混用的窗口探测，并将探测的数据记录下来。本发明利用离散与混叠复用的探测方法能够扩大时间探测窗口法的最佳探测范围，减少了探测误差。在每个像素单元集成了两个计数模块，使其在单次荧光激发后能够采样两组数据，能够有效的提高成像速度。
Description
技术领域
本发明属于光电技术领域，具体涉及一种基于单光子探测技术的荧光寿命快速成像方法。
背景技术
荧光寿命成像由于其具有高的灵敏度和分子特异性，以及其无损的测量方式，在对测试样品所处微环境中的诸多生物物理参数，如氧压、溶液、疏水性等及生物化学参数，如pH值离子浓度等进行定量测量有着重要应用。在荧光寿命成像的过程中，需要对荧光光子进行检测。单光子雪崩二极管(SPAD)探测器件具有高的灵敏度、高的时间精度分辨率，已被广泛应用于生物医学、军事和光通信等领域，在荧光寿命成像系统中非常适合作为光子探测器使用。传统的荧光寿命成像方法通常利用特定几个时间段开启一定时间的探测窗口，记录探测窗口内的光子数目，通过多次测量，将采样得到的光子数代入公式，计算出荧光寿命。而且传统的荧光寿命测量方法探测窗口多为连续的或者混叠的探测，采样范围多集中在荧光衰减的前段，采样得到的数据不具有代表性，这样会造成一定的计算误差，能够保证较小误差的最佳探测范围较小，不利于普遍的应用。此外，由于像素电路中只包含一个计数电路，在每次激光激发周期内，只能探测一组数据，这样会导致成像速度的较慢。
因此如何减少荧光寿命拟合计算的误差，以及提高像素阵列的成像速度就是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对荧光寿命拟合计算的高误差以及较慢的像素阵列的成像速度提出了一种基于SPAD的快速荧光寿命成像方法，采用离散的窗口采集荧光衰减时的光子信息，能够减少荧光寿命拟合计算过程中的计算误差，在一个像素中集成两个计数单元，增加单位时间内的信息采集量，还能够有效提高荧光寿命成像的成像速度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，包含以下步骤：
(1)探测准备阶段：在激光激发荧光物质发射激光前，首先将计数单元里面的数据清零，关断计数电路的清零信号，使计数电路处于待计数状态；
(2)探测阶段：经过一定时间延时后，开启荧光寿命成像芯片的探测窗口进行测量，通过三个特定时间的探测窗口对荧光衰减光强进行探测，其中前两个探测窗口位于衰减前期，且相互交叠50％，第三个时间窗口位于荧光衰减的末期，与前两个窗口呈离散分布；
(3)数据读出阶段：将上述测量数据读出利用Newton-Rhapson公式，计算出最终的荧光寿命。
进一步，上述探测阶段具体包括利用激发Ex信号控制激光源发射激光，当激光脉冲激发后，延时Tdel1时间后，SPAD控制信号Ve上升，使SPAD阳极与Vb信号导通，此时偏置电压Vb电压较低，A点电位被拉低，SPAD两端电压升高，从而使能进入盖革模式，与此同时门控选通信号Win被打开，若检测到光子脉冲，选通电路将会把信号传播到下一级电路，经过Tw的探测时间，门控选通信号Win拉低，信号传输通路被关断，与此同时SPAD控制信号Ve上升，SPAD与偏置电压Vb再次导通，此时偏置电压Vb电压较高，A点电位也将被拉高，SPAD阳极电压降低，退出盖革模式，经过门控电路后通过整形电路将光子脉冲整形为等宽方波，再将信号送入计数电路，Sw1与Sw2控制两个计数器的工作状态，将不同探测窗口探测到的光子记录在不同的计数器之中，延时Tdel2时间后开启Tw3的探测，Tw3测量方式与Tw1相同，探测窗口宽度不同，重复测量Tw1与Tw3窗口n/2次，然后开始针对Tw2与Tw3窗口的探测，测量方式与次数和Tw1与Tw1相同。
又进一步，上述Tdel1与Tdel2时间均由外部信号控制。
作为优选，上述n的取值范围是200到600。
作为优选，上述Tw1与Tw2通常在3ns～7ns。
进一步，上述数据读出阶段具体包括将Tw1与Tw3的测量数据与Tw2与Tw3的测量数据分两次读出，Twi,窗口探测的光子数为Ni，N的取值范围为1,2,3，其中：
由Tw1和Tw2得到的荧光寿命为：
τ＝-TW[ln(N2/N1)2]
针对探测窗口3，由Newton-Rhapson公式，计算出
其中s＝Tw/τ，利用测得数带入上式可以得到两组荧光寿命值，将计算出的荧光寿命值取平均最终得到最终的荧光寿命。
与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
(1)本发明测量方式新颖，采用全新的离散探测窗口计算荧光寿命，与传统的连续探测窗口相比，在探测时间固定的条件下扩大窗口在衰减过程中的探测范围。该计算方式使其对于不同寿命长短的探测物质都能保持较小的误差。
(2)本发明在一个像素模块中集成了两个计数单元。在测量过程中，对于一次激光激发出的衰减荧光，单个像素可以开启两个探测窗口，将两次采样结果都保存在像素单元内。后通过多次激发，一并读出。增加了单位时间的数据采集量，减少了激光激发次数，从而提高了成像速度。
(3)本发明通过外部信号控制SPAD的工作状态，SPAD只有在探测窗口开启期间才处于盖革模式，能够探测光子，其余时间都为非盖革模式的休眠状态。退出盖革模式的SPAD不会有后脉冲以及暗计数等噪声的影响，对光子探测的准确性有了很大的提高，从而提高了成像质量。而且，SPAD的休眠能够降低功耗，以及能够延长SPAD的使用寿命。
附图说明
图1为荧光寿命测量结构图。
图2为探测窗口荧光衰减曲线。
图3为探测窗口荧光衰减流程图。
图4为探测窗口采样的示意图。
图5为是本发明适用的像素单元框图。
图6为是像素控制信号时序图。
具体实施方式
现结合附图对本发明做进一步详细的说明。
本发明利用单光子雪崩二极管对荧光光子进行探测并记录相关信息，从而计算出物质的荧光寿命。该方法利用离散与混叠复用的探测窗口对荧光衰减进行特定的采样，然后将物质的荧光衰减曲线(如图2所示)拟合出来，从而计算出物质的荧光寿命，荧光寿命测量结构如图1所示。探测窗口荧光衰减的流程如图3所示。
像素单元模块如图5所示，该模块包含SPAD以及其控制其工作状态的控制电路以及将SPAD雪崩大电流淬灭的淬灭电路，雪崩脉冲选通电路，雪崩脉冲整形电路，模拟计数电路以及输出选通电路。根据基于时间探测窗口法的荧光寿命成像的要求，SPAD只有在探测窗口开启器件处于盖革模式，其他时间为了减少暗计数对光子记录的影响，SPAD的偏置电压被拉低，SPAD退出盖革模式，呈关断状态，对入射的光子不产生任何响应。盖革模式下SPAD检测到的光子产生的雪崩脉冲通过门控信号控制传播到下一级电路，若门控信号在探测过程中呈闭合状态时，雪崩脉冲无法传送到下一级电路，这样能够有效降低后脉冲以及暗计数对计数准确性的影响。为了有效降低像素电路的版图面积，本发明采用模拟计数的方式。为了保证每次模拟计数过程中输出的步进电压值恒定，要对雪崩脉冲进行整形得到输出较为稳定的方波波形。计数电路包含两个计数模块，以及激光激发为一个探测周期，在一个探测周期内，有两个探测窗口。两个探测窗口纪录的光子信息分别存储在两个计数模块中。提高了单位时间的信息采集量，从而提高了成像速度。
具体探测计数方式图4所示，以每次激光激发作为为一个探测周期。每个探测周期SPAD的探测窗口开启两次。在激光激发后延时数纳秒后开启第一个探测窗口的测量，延时时间Tdel1，第一个探测窗口开启Tw1后关闭。延时Tdel3时间后每个探测周期的第二个探测窗口开启，探测时间为Tw3。第一个探测窗口检测到的光子记录在计数器1上，第二个探测窗口检测的光子记录在计数器2上。光子只有在探测窗口开启时才能被检测，其余时间的光子打入不会有数据被记录。若在探测窗口开启期间有一个以上的光子打入SPAD，计数器都每个探测窗口只记录将加1，若没有检测到光子，计数器保持不变。荧光寿命成像系统按照如上成像方式探测n次，读出计数器1记录光子数N1，计数器2记录光子数N3.1。然后探测窗口Tw2与Tw3的光子数，探测方式与探测Tw1，Tw3的探测方式相同，窗口探测时间也相同。Tw2窗口开启时间相对于Tw1多延时1/2Tw时间。经过n次测量，得到计数器1的测量光子数为N2，计数器2探测的光子数为N3.2。
整个电路的工作状态分为如下几个部分。
(1)在探测准备阶段，在激光激发荧光物质发射激光前，首先将计数单元里面的数据清零。将计数单元数据清除后，关断计数电路的清零信号，使计数电路处于待计数状态。
(2)在探测阶段中，电路时序如图6所示，利用激发Ex信号控制激光源发射激光，当激光脉冲激发后，延时Tdel1时间后(Tdel1与Tdel2时间均由外部信号控制)，SPAD控制信号Ve上升，使SPAD阳极与偏置电压Vb导通，此时偏置电压Vb电压为低电平，A点电位被拉低，SPAD两端电压升高，从而使能进入盖革模式。与此同时门控选通信号Win被打开，若检测到光子脉冲，选通电路将会把信号传播到下一级电路。经过Tw的探测时间，门控选通信号Win拉低，信号传输通路被关断。与此同时SPAD控制信号Ve上升，SPAD与偏置电压Vb再次导通，此时偏置电压Vb电压较高，A点电位也将被拉高，SPAD阳极电压降低，退出盖革模式。经过门控电路后通过整形电路将光子脉冲整形为等宽方波，再将信号送入计数电路。Sw1与Sw2控制两个计数器的工作状态，将不同探测窗口探测到的光子记录在不同的计数器之中。延时Tdel2时间后开启Tw3的探测，Tw3测量方式与Tw1相同，探测窗口宽度不同，重复测量Tw1与Tw3窗口n/2次。然后开始针对Tw2与Tw3窗口的探测，测量方式与次数和Tw1与Tw3相同。
(3)在数据读出阶段，将Tw1与Tw3的测量数据与Tw2与Tw3的测量数据分两次读出，Twi(N＝1，2，3)窗口探测的光子数为Ni，其中：
由Tw1和Tw2得到的荧光寿命为：
τ＝-TW[ln(N2/N1)2]
针对探测窗口3，由Newton-Rhapson公式，计算出
其中s＝Tw/τ，利用测得数带入上式可以得到两组荧光寿命值，将计算出的荧光寿命值取平均得到最终的荧光寿命。
本发明通过提出离散与混叠复用的探测方法能够扩大时间探测窗口法的最佳探测范围，减少了探测误差。在每个像素单元集成了两个计数模块，使其在单次荧光激发后能够采样两组数据，能够有效的提高成像速度，而且利用控制信号控制SPAD的工作状态，使其只在探测窗口开启时处于盖革模式，从而减少暗计数，后脉冲等噪声影响。
Claims (6)
1.基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)探测准备阶段：在激光激发荧光物质发射激光前，首先将计数单元里面的数据清零，关断计数电路的清零信号，使计数电路处于待计数状态；
(2)探测阶段：经过一定时间延时后，开启荧光寿命成像芯片的探测窗口进行测量，通过三个特定时间的探测窗口对荧光衰减光强进行探测，其中前两个探测窗口位于衰减前期，且相互交叠50％，第三个时间窗口位于荧光衰减的末期，与前两个窗口呈离散分布；
(3)数据读出阶段：将上述测量数据读出利用Newton-Rhapson公式，计算出最终的荧光寿命。
2.根据权利要求1所述的基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，其特征在于所述探测阶段具体包括利用激发Ex信号控制激光源发射激光，当激光脉冲激发后，延时Tdel1时间后，单光子雪崩二极管探测器控制信号Ve上升，使单光子雪崩二极管探测器阳极与偏置电压Vb导通，此时偏置电压Vb电压较低，单光子雪崩二极管探测器阳极A点电位被拉低，单光子雪崩二极管探测器两端电压升高，从而使能进入盖革模式，与此同时门控选通信号Win被打开，若检测到光子脉冲，选通电路将会把信号传播到下一级电路，经过Tw的探测时间，门控选通信号Win拉低，信号传输通路被关断，与此同时单光子雪崩二极管探测器控制信号Ve上升，单光子雪崩二极管探测器与偏置电压Vb再次导通，此时偏置电压Vb电压较高，单光子雪崩二极管探测器阳极A点电位也将被拉高，单光子雪崩二极管探测器阳极电压降低，退出盖革模式，经过门控电路后通过整形电路将光子脉冲整形为等宽方波，再将信号送入计数电路，控制信号Sw1与Sw2控制两个计数器的工作状态，将不同探测窗口探测到的光子记录在不同的计数器之中，延时Tdel2时间后开启探测窗口三Tw3的探测，探测窗口三Tw3测量方式与探测窗口一Tw1相同，探测窗口宽度不同，重复测量探测窗口一Tw1与探测窗口三Tw3窗口n/2次，然后开始针对探测窗口二Tw2与探测窗口三Tw3窗口的探测，测量方式与次数和探测窗口一Tw1与探测窗口三Tw3相同。
3.根据权利要求2所述的基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，其特征在于所述Tdel1与Tdel2时间均由外部信号控制。
4.根据权利要求2所述的基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，其特征在于所述n的取值范围是200到600。
5.根据权利要求2所述的基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，其特征在于所述探测窗口一Tw1与探测窗口二Tw2通常在3ns～7ns。
6.根据权利要求1所述的基于单光子雪崩二极管探测器的快速荧光寿命成像方法，其特征在于所述数据读出阶段具体包括将探测窗口一Tw1与探测窗口三Tw3的测量数据与探测窗口二Tw2与探测窗口三Tw3的测量数据分两次读出，Twi,窗口探测的光子数为Ni，i的取值范围为1,2,3，其中：
由探测窗口一Tw1和探测窗口二Tw2得到的荧光寿命为
τ＝-TW[ln(N2/N1)2]
针对探测窗口三(Tw3)，由Newton-Rhapson公式，计算出
其中s＝Tw/τ，参数x和y是两个与探测窗口时间相关的参数，利用测得数带入上式可以得到两组荧光寿命值，将计算出的荧光寿命值取平均最终得到最终的荧光寿命。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Application publication date: 20180508 Assignee: NANJING UNIVERSITY OF POSTS AND TELECOMMUNICATIONS INSTITUTE AT NANTONG Co.,Ltd. Assignor: NANJING University OF POSTS AND TELECOMMUNICATIONS Contract record no.: X2020980006914 Denomination of invention: Fast fluorescence lifetime imaging method based on single photon avalanche diode detector Granted publication date: 20191011 License type: Common License Record date: 20201021 |
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