CN107998147A - 一种抑制或治疗copd的雾化吸入制剂及其应用 - Google Patents

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卢文菊
王健
李德富
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Abstract

本发明公开了一种抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂，所述雾化吸入制剂为NaHS雾化吸入剂。该雾化吸入制剂具有抑制或治疗COPD功效。本发明还公开了上述雾化吸入制剂在制备具有抑制/或治疗COPD功效的药物中的应用。

Description

一种抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂及其应用
技术领域
本发明属于慢性阻塞性肺疾病技术领域，具体涉及一种抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂及其在制备具有抑制或治疗COPD功效的药物中的应用。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以不可逆性气流受限为特征的慢性炎症性疾病，在我国的发病率高达8.2％(男性12.4％，女性5.1％)。COPD的死亡率上升，全球每年造成300多万人死亡。由长期香烟烟雾(cigarettesmoke，CS)暴露诱导的肺部粘液分泌过多和炎症反应是导致COPD发生发展主要原因之一。香烟烟雾暴露通过诱导肺部急性和慢性炎症反应的发生导致肺泡破坏，从而导致肺功能下降。目前对于慢阻肺的治疗主要是使用支气管扩张剂，支气管扩张剂虽能改善患者的症状，但并不能阻止肺功能下降的趋势，不能改善患者的预后。吸入激素虽然在短期内可以改善患者的肺功能，但有增加肺部感染的风险，增加急性加重的频率。在慢阻肺预防方面目前主要强调戒烟和改善环境污染，但研究表明慢阻肺一旦形成，戒烟后气道的炎症反应仍然持续存在。因此，临床上对于慢阻肺的防治手段有限，效果不理想，迫切需要寻找一种新的、有效的防治方法。
炎症反应、蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化应激被证实是慢阻肺发病的三大主要原因。气道、肺实质及肺血管的慢性炎症是慢阻肺的特征性改变。炎症机制是慢阻肺发生、发展的中心环节。慢阻肺患者体内的氧化负担加重，其呼出气体、血液以及尿液中氧化产物均明显升高。氧化应激一方面可直接损伤气道上皮，加重炎症反应，另一方面还可使抗蛋白水解酶失活，促进细胞凋亡，从而促进慢阻肺的发生发展。慢阻肺气道炎症使氧化负荷增加，氧化负荷增大导致气道炎症反应加重，形成恶性循环。因此，探索一种针对病因的抗炎、抗氧化治疗可能能从根本上阻止慢阻肺的发生、发展。
作为氯离子(Cl-)转运蛋白，囊性纤维化跨膜传导调节因子cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR)是肺上皮的主要顶膜离子通道，被认为是COPD的多种候选风险基因之一。CFTR突变基因引起的CFTR功能异常，往往引起遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)，临床症状表现为呼吸道粘液粘稠、粘膜纤毛清除功能降低、咳痰困难和气道慢性炎症。典型的CF样呼吸道症状也出现在COPD病人中，包括慢性支气管炎、气道粘液增多和肺功能进行性丧失。有报道显示COPD病人肺CFTR表达功能下调，显示CFTR变化可作为COPD早期标志。进一步通过对比健康非吸烟人群，吸烟人群、吸烟的COPD人群和有吸烟史的COPD人群的CFTR功能，发现吸烟即可引起CFTR功能减弱。这种减少在COPD患者的下呼吸道中尤为明显。除了防止气道表面液脱水之外，CFTR还可以通过控制气道上皮细胞和巨噬细胞中的炎症反应来缓解肺部炎症。因此，旨在增强CFTR表达和/或功能的药理学方法可能通过解决粘液高分泌，过度炎症反应和氧化应激而对COPD潜在有益。
目前还没有研究报道硫氢化钠尤其是雾化吸入剂型的硫氢化钠具有抑制或治疗COPD功效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂，该雾化吸入制剂具有抑制或治疗COPD功效。
本发明的目的还在于提供上述抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂的应用。
本发明的上述第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂，所述雾化吸入制剂为NaHS雾化吸入剂。
本发明将NaHS雾化给药的方式，能达到治疗COPD的目的，具有极为广阔的临床应用前景。
NaHS雾化吸入剂采用常规方法制备获得，如直接将NaHS固体溶于生理盐水，配制成所需浓度，再通过PARI雾化器雾化吸入。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述雾化吸入制剂在制备具有抑制或治疗COPD功效的药物中的应用。
在本发明中，申请人将小鼠暴露于NaHS雾化吸入以避免其全身毒性，并评估CS诱导的COPD模型肺部生理和病理变化。在机制上，这些保护作用与NaHS抑制CS诱导CFTR表达及功能下降有关。这是第一次报道，NaHS吸入方法是一种有希望，易于实施的COPD的治疗方法。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂能抑制CS诱导的小鼠肺功能下降及红细胞压积的增加；
(2)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂能抑制CS诱导的小鼠肺泡壁断裂、肺部气道及血管炎症；
(3)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂能抑制CS诱导的小鼠气道杯状细胞以及粘液高分泌；
(4)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂能抑制小鼠肺和16HBE细胞中CS诱导的炎症和氧化应激；
(5)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂能改善CS诱导的体重减轻，以及小鼠肝脏指数和脾脏指数的增加；
(6)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂能保护小鼠肺和16HBE细胞中CS诱导的CFTR表达及功能降低；
(7)本发明中的NaHS尤其是NaHS雾化吸入剂抑制CFTR功能消除了NaHS对CSE诱导的16HBE细胞中IL-6和IL-8释放的保护作用。
附图说明
图1是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂抑制CS诱导的小鼠肺功能下降及红细胞压积的增加；
图2是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂抑制CS诱导的小鼠肺泡壁断裂、肺部气道及血管炎症；
图3是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂能抑制CS诱导的小鼠气道杯状细胞以及粘蛋白Muc5ac和Muc5b高分泌；
图4是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂抑制小鼠肺组织和16HBE细胞中CS诱导的炎症和氧化应激；
图5是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂改善CS诱导的体重减轻，以及小鼠肝脏指数和脾脏指数的增加；
图6是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂保护小鼠肺和16HBE细胞中CS诱导的CFTR表达及功能降低；
图7是具体实施方式中NaHS雾化吸入剂抑制CFTR功能消除了NaHS对CSE诱导的16HBE细胞中IL-6和IL-8释放的保护作用。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步的详细阐述吸入NaHS抑制CS诱发的小鼠COPD的发生发展，且这种抑制作用与调节CFTR表达及功能有关。但是以下实施方式仅用于说明本发明的目的，并不限制本发明的保护范围。
一、主要材料
1、实验主要试剂及耗材
人气道上皮细胞16HBE，中国科学院上海细胞库；
硫氢化钠(NaHS)，美国Sigma公司；
红玫牌香烟，广东中烟工业有限公司；
戊巴比妥钠，广州化学二厂；
生理盐水，东莞市普济药业有限公司；
PBS(磷酸盐)，吉诺生物医药有限公司；
PAS试剂盒，上海太阳生物科技有限公司；
GSH/GSSG试剂盒，美国BioVision公司；
苏木素伊红染色液，中国贝素生物技术有限公司；
多聚甲醛溶液，晶欣生物公司；
氯化铵，广州化学试剂厂；
RIPA裂解液，美国sigma公司；
PIC，美国sigma公司；
AEBSF，美国AMRESCO公司；
Glycerol，美国Bio-Rad公司；
LPS，美国Sigma公司；
Tris Base，台湾生工有限公司；
中性树胶，国药集团化学试剂有限公司；
2、蛋白免疫印迹相关试剂及耗材
Tris Base，台湾生工有限公司；
甘氨酸，美国Bio-Rad公司；
30％Acrylamide/Bis Solution，美国Bio-Rad公司；
十二烷基硫酸钠(SDS)，美国USB公司；
过硫酸胺(AP)，广东佰路生物科技有限公司；
四甲基二乙胺(TEMED)，美国USB公司；
Tween20(吐温20)，美国AMRESCO公司；
5×凝胶加样缓冲液(loading buffer)，广东威佳公司；
甲醇，广州化学试剂厂；
脱脂奶粉，广东威佳公司；
蛋白标准品，美国Bio-Rad公司；
ECL化学发光液，美国Bio-Rad公司；
聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，美国Bio-Rad公司；
羊抗小鼠β-actin抗体(A1978)，美国Sigma公司；
CFTR(1:1000,#2269)，美国CST公司；
Erk1/2抗体(#4695)，Cell Signaling Technology；
pErk1/2抗体(ab76299)，Abcam；
NF-κB/p65(#6956S)，Abcam；
Histone H3抗体(#9715)，Cell Signaling Technology；
NE-PER Nuclear(NER)and Cytoplasmic Extraction Reagents(CRE)，Thermoscientific
HRP标记的山羊抗兔IgG，美国KPL公司；
HRP标记的山羊抗小鼠IgG，美国KPL公司；
CFTR小鼠单克隆抗体(ACL006AN0602)，Alomone Labs,Jerusalem,Israel；
12.5cm定性滤纸，Whatman公司；
X-Film，Kodak公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒，丹麦Thermo公司；
TBS粉剂，武汉博士德公司；
蛋白质预染marker，美国Bio-Rad公司；
2、Elisa方法检测试剂
human IL-8(88-8086)，美国eBioscience公司；
human IL-6(88-7066)，美国eBioscience公司；
mouse IL-6(88-7064)，美国eBioscience公司；
MCP-1试剂盒(88-7391)，美国eBioscience公司；
KC capture抗体(MAB453)，R&D公司；
KC detection抗体(BAF453)，R&D公司；
KC标准品(OW0213081)，R&D公司；
Muc5ac抗体(sc-21701)，-美国Santa Cruz公司；
Muc5b抗体(sc-135508)，美国Santa Cruz公司；
PBS，武汉博士德生物工程有限公司；
TritonX-100，-广州威佳科技有限公司；
BSA，广州威佳科技有限公司；
Na2CO3，广州化学试剂厂；
NaHCO3，广州化学试剂厂；
吐温-80，-天津市光复精细化工研究所；
NaN3，广州化学试剂厂；
硫柳汞，广州市齐云生物技术有限公司；
4、主要仪器
PARI雾化器，德国PARI公司；
肺功能仪，-美国Buxco公司；
小鼠固定架，自制；
电子天平，梅特勒-托利多公司；
外科器械，---上海医疗器械有限公司手术器械厂；
低温离心机，-北京力康生物医疗科技公司；
BM-Ⅱ水浴式生物组织包埋机，深圳新安毅达电子厂；
Citadel 1000组织脱水机，英国Shandon公司；
光学显微镜，日本Olympus公司数码摄影；
Sonics Vibra-Cell超声波破碎仪，美国SONICS公司；
医用3-0缝线，上海双鸽实业有限公司；
静脉留置针，上海双鸽实业有限公司；
微型离心机，德国Effendorf公司；
机械匀浆器，德国IKA公司；
超纯水制备机，MILLIPORE公司；
恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；
超低温冰箱，SANYO公司；
蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司；
转膜仪，美国Bio-Rad公司；
细胞培养皿，美国Corning公司；
大包氏管(10mL)，盐城鑫宝科技有限公司；
倒置相差显微镜，德国Leica公司；
超净工作台，美国ESCO公司；
二氧化碳培养箱，丹麦Thermo公司；
50mL离心管，美国Corning公司；
0.22μm滤器，MILLPORE公司；
Parafilm膜，美国Parafilm公司；
恒温水浴槽SC－15，宁波天恒仪器厂；
1mL注射器，上海双鸽实业有限公司；
二、实验方法
(一)NaHS干预的COPD动物模型的制备
1、实验分组及饲养
SPF级雄性C57B6J小鼠：6-8周龄，体重22-27g，购于南京医科大学南京生物医药研究院。小鼠随机分为4组，每组10只，分别为对照组(CTL)，香烟烟雾暴露联合LPS组(CS)，香烟烟雾暴露联合LPS+NaHS干预组(NaHS/CS)以及单纯NaHS干预组(NaHS)。动物饲养于广州呼吸疾病研究所国家重点实验室动物房内，清洁级。动物房内人工照明，室温20±2℃，湿度60～70％，通风良好，小鼠自由进食、水。小鼠饲料购自广州省医学实验动物中心。
2、COPD模型小鼠制备具体方法
1)小鼠在开始实验前先在动物房饲养一周左右，使其熟悉新的饲养环境；
2)第二周，模型组小鼠在第1天和第14天使用细菌脂多糖(LPS，7.5μg/只)进行鼻内滴注，对照组滴入等量的生理盐水，自制熏烟箱(90cm×50cm×60cm)内，箱上端两边各有一个1.5cm×1.5cm小孔与外界相通，防止动物缺氧，同时采用计算机PAB-S200被动吸烟动物染毒系统监测熏烟箱内温度、湿度和气体(氧气、一氧化碳)。上、下午各熏烟一次，每次两小时，熏烟开始一小时后换气15分钟(即9支烟1小时，换气15分钟，再换9支烟，继续熏烟1小时)。两次熏烟之间间隔4小时(将小鼠从熏烟箱中取出)。每周熏烟6天，共熏烟8周。熏烟过程中监测烟雾中颗粒物浓度，每次5分钟。持续监测烟雾中O2、CO、CO2浓度。对于NaHS治疗，在暴露于CS之前，通过气道吸入NaHS(2mg/mL，每次30分钟，每天两次，NaHS生理盐水溶液，通过PARI雾化器形成气溶胶，吸入的方式是全身暴露，此处为本次试验的推荐剂量，实际使用时根据需要配制合适的浓度，此处不进行限制)或生理盐水。在全部熏烟处理结束后次日，检测小鼠肺功能并处死小鼠取材进行进一步分析。
3、细胞实验方法
1)香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)：在两个串联的大包氏管内各加入5mL不含血清的基础DMEM高糖培养基，然后在串联管的一端连接去掉滤嘴的香烟，另一端连接一个50mL的注射器。点燃香烟后，使用注射器以50mL/10s的速度抽吸，使烟雾溶于培养基形成气溶胶，每次2支香烟，每支香烟用注射器抽吸10次。收集培养基，调节其pH值为7.4，经0.22μm滤膜过滤后得到浓度为100％的CSE原液。实验时按需要用基础DMEM高糖培养基稀释成不同浓度CSE。要求CSE制备好后半小时内加入细胞中。同时通过CCK8试剂盒，测定不同CSE刺激细胞48小时后细胞活力。
2)人气道上皮细胞16HBE置于10％FBS-DMEM培养基，37℃，5％CO2的环境中培养传代。待细胞生长进入对数增殖期时，收获细胞，以每孔2×105个接种于六孔细胞培养板中，24小时后显微镜下观察细胞形态，细胞贴壁、生长良好，达到约70％接触，弃去旧培养基，更换为1％FBS-DMEM高糖培养基，饥饿培养24小时后开始药物处理。用于细胞干预的药物及浓度：CSE 2％；NaHS，0.4mM；CFTR(inh)-172，10μM。
4、结果
1)雾化吸入NaHS抑制CS诱导的小鼠肺功能下降及红细胞压积的增加
在全部熏烟处理结束后次日，检测小鼠肺功能。心脏采血检查红细胞压积。
实验结果：为了缩短建立COPD小鼠模型的时间，采用LPS鼻内吸入联合CS暴露(图1中A图)。如图1所示，CS加LPS暴露的小鼠表现出典型的COPD临床表现，包括肺功能下降(图1中B-F图)，表现为较高的功能残气量(FRC)，总肺量(TLC)，肺顺应性值(Cchord)和气道阻力(RI)，与正常小鼠相比，FEV50(50ms时呼气量)/FVC值降低。暴露于CS加LPS的小鼠的血红细胞压积增加(图1中G图)。在接受NaHS吸入的小鼠(2mg/mL，每次30分钟，每天两次)，上述指标都有明显改善。
结论：这些结果表明，雾化吸入NaHS可抑制CS暴露导致的小鼠肺功能下降和慢性缺氧导致的红细胞压积增加。
2)雾化吸入NaHS可抑制COPD小鼠模型中的肺组织学病理学改变。
小鼠肺组织切片经H&E染色，观察肺组织病理学改变
实验结果：对比正常对照、CS组，NaHS/CS组和NaHS组小鼠的肺组织切片(经H&E)，显示出吸入NaHS可以有效抑制CS引起的肺泡壁断裂(图2中A图),气道炎症(图2中B图)和血管炎症(图2中C图)。
结论：这些结果提示雾化吸入NaHS可抑制COPD小鼠模型中的肺气肿及肺部炎症。
3)雾化吸入NaHS抑制CS诱导的小鼠肺泡灌洗液中粘液高分泌。
小鼠肺组织切片经PAS染色，观察气道杯状细胞增生情况。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺泡灌洗液中Muc5ac和Muc5b的水平。
实验结果：对比正常对照、CS组，NaHS/CS组和NaHS组小鼠的肺组织切片(经PAS染色)，显示出吸入NaHS可以有效抑制CS引起的气道表面的杯状细胞增生(图3中A图)。同时，雾化吸入NaHS减少CS诱导的肺泡灌洗液中Muc5ac和Muc5b蛋白水平的增加(图3中B-C图)。
结论：雾化NaHS吸入可防止COPD小鼠模型中的粘液高分泌。
4)NaHS抑制小鼠肺组织和16HBE细胞中CS诱导的炎症反应以及氧化应激
进行有创气管插管，用生理盐水灌洗肺脏，0.6mL/次，共6次，留取肺泡灌洗液(BALF)。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺泡灌洗液中炎症因子(MCP-1，IL-6和KC)水平。收集BALF中炎症细胞进行计数，同时行giemsa染色进行分类计数。测量肺组织中GSH/GSSG的摩尔比来评价氧化应激水平。
实验结果：雾化吸入NaSH降低了CS小鼠肺泡灌洗液中促炎症因子白介素-6(IL-6)，角化细胞趋化因子(KC)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平和炎症细胞数，对于其中主要炎症细胞，巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的增加，都有明显的抑制效果(图4中A-D图)。通过测量肺组织中GSH/GSSG的摩尔比来评价氧化应激水平，NaHS减轻CS暴露导致小鼠肺组织中GSH/GSSG比例的下降(图4中E图)。这些结果提示雾化吸入NaHS抑制CS诱导的小鼠肺部炎症及氧化应激水平的增加。接下来，使用人支气管上皮细胞(16HBE)来确定NaHS是否也降低了16HBE细胞中CSE诱导的炎症反应。在16HBE细胞中，NaHS(>0.4mM)和CSE(2％)干预细胞48小时，显着细胞活力明显降低(图4中F-G图)。因此，使用0.4mM的NaHS以及2％CSE进行以下实验。发现NaHS(0.4mM)显着降低了16HBE细胞中CSE(2％)诱导的IL-6和IL-8释放(图4中H-I图)。
所有这些结果表明NaHS在小鼠肺和人支气管上皮细胞中减少CS诱导的炎症反应。
结论：NaHS抑制小鼠肺和16HBE细胞中CS诱导的炎症和氧化应激。
5)雾化吸入NaHS改善CS导致的体重降低，以及小鼠肝脏指数和脾脏指数的增加
熏烟期间，每星期称量一次体重并记录。熏烟结束时，计算肝脏、肾脏及脾脏与体重的比值。
实验结果：雾化吸入NaHS改善CS暴露导致的小鼠体重减轻(图5中A图)。与正常小鼠相比，CS暴露小鼠肝脏和脾脏指数明显升高，NaHS处理后明显改善(图5中B-C图)。单纯给予NaHS处理，对小鼠肝脏和脾脏指数没有明显改变。CS和NaHS对肾脏指数无明显改变(图5中D图)。
结论：NaHS对CS诱导的体重减轻有益，但不会引起可检测的毒性作用。
6)NaHS保护小鼠肺和16HBE细胞中CS诱导的CFTR表达及功能降低。
Western Blotting检测各组小鼠肺组织和16HBE细胞中CFTR蛋白水平。通过使用荧光氯离子染料N-[乙氧基羰基甲基]-6-甲氧基-喹啉溴化物(MQAE)测量16HBE细胞的氯离子流出，其通过淬灭机理测量Cl-浓度的增加。
实验结果：如图6中A图所示，吸入NaHS部分抑制CS暴露导致小鼠肺组织中CFTR的水平降低。接下来，测量了香烟烟雾提取物(CSE)是否影响16HBE细胞中的CFTR表达及功能。NaHS(0.4mM)预处理部分地抑制CSE(2％)导致的16HBE细胞中CFTR表达的下降(图6中B图)。MQAE是一种敏感的Cl-荧光指示剂染料，用于表示毛喉素引发的CFTR活化后的流出。增加的MQAE荧光强度表明细胞质Cl-浓度降低。如图6中C图所示，CSE处理的16HBE细胞在CFTR活化后表现出较少的MQAE荧光增量，这意味着由CSE导致CFTR功能障碍引起的细胞中的Cl-流出不足。NaHS干预后可部分抑制CSE导致CFTR功能障碍。
结论：NaHS可能通过维持CFTR功能和表达来阻止CS诱导的COPD疾病的发生发展。
7)抑制CFTR功能消除了NaHS对CSE诱导的16HBE细胞中IL-6和IL-8释放的保护作用。
为了进一步确定CFTR介导NaHS在CS诱导的炎症反应中的保护作用，用特异的CFTR抑制剂inh172处理细胞。ELISA检测细胞培养基中IL-6和IL-8的水平。
实验结果：如图7中A图所示，在16HBE细胞中，CFTR(inh)-172(>10μM)显着降低细胞活力。因此，使用10μM的CFTR-Inh172进行以下实验。如图7中B-C图所示，在16HBE中细胞，CFTR-Inh172处理显着增加了CSE(2％)诱导的IL-6和IL-8释放。通过CFTR(inh)-172处理，NaHS对炎症反应(即IL-6和IL-8水平)的抑制作用被消除。
结论：NaHS通过恢复肺上皮细胞CFTR表达及功能来减轻CSE诱导的炎症反应。
综上，NaHS可以在制备具有抑制或治疗COPD功效的药物中应用，尤其是其雾化吸入剂型。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

Claims (2)

1.一种抑制或治疗COPD的雾化吸入制剂，其特征是：所述的雾化吸入制剂为NaHS雾化吸入剂。
2.权利要求1所述的雾化吸入制剂在制备具有抑制或治疗COPD功效的药物中的应用。
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