CN107987171A - 基因编码钙探针GCaMP-X的设计与应用 - Google Patents

基因编码钙探针GCaMP-X的设计与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了优化改进版的基因编码钙探针GCaMP‑X及其基本应用，该探针的组成包括：GCaMP蛋白；第一氨基酸序列；以及第二氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列为能够减弱未结合钙离子的钙调蛋白与L型钙通道(LTCC)预结合能力的片段，所述第二氨基酸序列为定位序列(核内、核外等亚细胞区域)，所述第一氨基酸序列位于所述GCaMP蛋白的氮端，所述第二氨基酸序列位于所述GCaMP蛋白的碳端。优化版GCaMP‑X探针相对于现有的GCaMP各版本，消除了对神经元LTCC及其所介导的兴奋‑转录耦联的干扰作用，更客观准确地测量神经元的钙信号。

Description

基因编码钙探针GCaMP-X的设计与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及基因编码的钙离子浓度指示剂及其应用。
背景技术
基因编码的钙离子浓度指示剂(Genetically-Encoded Calcium Indicator，GECIs)是一类能够在特定的细胞位置检测Ca2+动力学的生物蛋白类指示剂。GECIs可被划分为三类：(1)基于水母等发光蛋白的生物荧光指示剂，这类指示剂与基于荧光蛋白的指示剂在本质上是不同的，需要分子内一系列的化学反应产生荧光；(2)基于单荧光蛋白的指示剂，这类指示剂包含响应Ca2+的成分，如CaM。CaM与荧光蛋白融合，CaM与Ca2+的结合情况可以调节荧光基团的质子化程度，从而影响荧光基团的光谱性质。这类指示剂包括Camgaroos，GCaMPs，Pericams等；(3)基于双荧光蛋白之间荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)的指示剂，这类指示剂也包含响应Ca2+的成分，如CaM或肌钙蛋白。它们被插入两个荧光蛋白之间，与Ca2+的结合可改变FRET的效率。这类指示剂包括Cameleons和TN-XXL等。
GECIs中应用最广泛的一类指示剂是GCaMP，相比于其它类型的GECIs，其在胞内钙离子信号检测方面体现出更多的优势，如荧光蛋白更稳定，耐光性更好，对Ca2+浓度变化的灵敏性更高，动力学更快等。
然而，目前的基因编码的钙离子浓度指示剂GCaMP仍有待优化。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种优化的GCaMP型基因编码的钙离子浓度指示剂。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
GCaMP是一种人工构建的重组蛋白，主要由钙调蛋白(Calmodulin，CaM)、来源于鸡平滑肌肌球蛋白轻链激酶(Myosin Light Chain Kinase，MLCK)的一段与Ca2+/CaM结合的序列M13和氮碳端位置互换的增强型绿色荧光蛋白(Circularly Permutated EnhancedGreen Fluorescent Protein，cpEGFP)融合而成。由于M13无法与apo-CaM结合，初始构象的cpEGFP使GCaMP呈现较暗的基础荧光；当Ca2+浓度增加，形成的Ca2+/CaM能够与M13紧密结合，进而改变了cpEGFP的构象，使其恢复到近似EGFP荧光基团的发光结构，因此可以检测到GCaMP的荧光强度发生明显的增强，并且荧光增强的幅度与Ca2+的浓度存在良好的相关性。为了改善GCaMP的性能，后续研究针对这一重组蛋白开展了突变筛选及优化，比如，引入点突变增强荧光蛋白的稳定性能和发光性能，防止荧光蛋白产生二聚体，在蛋白的氮端添加一段含有多个赖氨酸的序列RSET来维持GCaMP在室温的荧光强度。GCaMP3版本显著提升了基础荧光，动力学变化范围以及Ca2+亲和力等特性，因此加强了GCaMP在离体或活体水平的应用能力。继GCaMP3之后，更新的版本(如GCaMP5G、GCaMP6f、GCaMP6m、GCaMP6s等)通过引入新突变进一步提高了GCaMP的时间分辨率和反应强度，使其能够更好地应用于神经科学领域监测Ca2+浓度的动态变化。
然而，GCaMP包含的CaM在细胞中广泛存在且参与并调控重要的生理活动。以兴奋-转录偶联(Excitation-Transcription Coupling，E-T Coupling)为代表，首先，CaM可以在细胞膜通道附近的区域介导神经元相关的电学活动。研究表明，未结合Ca2+的CaM(apo-CaM)与L型电压门控钙通道(L-Type Calcium Channel，LTCC)预结合会影响通道的门控特性，表现为通道CDI程度以及开放概率的改变。其次，CaM能够从细胞质转移到细胞核，建立膜上电学活动与核内基因转录之间的联系。最后，CaM能够影响钙信号通路并且直接调控核内相关激酶以控制基因的转录。并且，发明人发现，GCaMP3的核聚集程度与神经元的形态负相关；GCaMP在细胞核内高度聚集的神经元，其生长受到抑制。以上的不利效应严重影响了GCaMP在离体或活体水平进行成像的时间范围，并且限制了GCaMP在细胞内的应用范围，很难反映核内真实的Ca2+浓度变化。
现有技术通过控制GCaMP的表达虽然在很大程度上降低了GCaMP异常入核的比例，但是并没有从根本上消除GCaMP包含的CaM对神经元兴奋-转录偶联的干扰。只分布在细胞质的GCaMP仍然会影响神经元的电活动及形态，改变钙内流总量。
因而，发明人基于GCaMP对神经元的损伤机制，对GCaMP进行了优化设计，以便使获得的优化的GCaMP消除了对神经元兴奋-转录偶联的干扰作用，能够更客观准确地监测神经电活动。
具体地，发明人发现了apo-CaM与LTCC的DCT结构域竞争结合LTCC的IQV结构域，进而，基于apo-CaM与LTCC的DCT结构域之间的竞争关系，通过引入能减弱apo-CaM与通道预结合能力的片段(优选采用CaM Binding Motif，CBM)实现对GCaMP的优化。具体地，发明人将能减弱apo-CaM与通道预结合能力的片段直接与GCaMP的氮端相连，由此，在空间位置上有利于两者的结合，从而可削弱GCaMP与LTCC的预结合能力，避免其对LTCC的门控特性产生干扰。同时，发明人还利用特殊的定位序列：核输出信号(Nuclear Export Signal，NES)序列或核定位序列NLS，与GCaMP蛋白的碳端相连，以便使优化的GCaMP在NES或NLS的作用下能够准确分布在细胞质或细胞核，由此能够实现对细胞质或细胞核的钙离子浓度的客观准确监测。其中，NES能够与细胞内的出核受体结合，使相连的蛋白输出到细胞质，进一步确保优化的GCaMP只在细胞质中分布，防止以Ca2+-CaMKII-CREB信号通路为代表的基因转录过程受到损害。而利用NLS与GCaMP蛋白的碳端相连，获得的钙离子浓度指示剂，能够在神经元细胞核分布且不影响细胞正常功能的指示剂，由此有助于研究细胞核里钙离子的功能及核内重要生命活动过程的作用机制，意义重大。
因而，在本发明的一个方面，本发明提供了一种基因编码的钙离子浓度指示剂。根据本发明的实施例，该基因编码的钙离子浓度指示剂的组成包括：GCaMP蛋白；第一氨基酸序列；以及第二氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列为能够减弱未结合钙离子的钙调蛋白与LTCC通道预结合能力的片段，所述第二氨基酸序列为核输出序列或核定位序列，所述第一氨基酸序列位于所述GCaMP蛋白的氮端，所述第二氨基酸序列位于述所述GCaMP蛋白的碳端。发明人惊奇地发现，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂是优化的GCaMP，相对于现有的GCaMP，不影响对内源LTCC通道的门控，消除了对神经元兴奋-转录偶联的干扰作用，能够更客观准确地监测神经电活动。并且，优化的GCaMP在核输出序列或核定位序列的作用下能够准确分布在细胞质或细胞核，由此能够实现对细胞质或细胞核的钙离子浓度的客观准确监测。其中，核输出序列能够与细胞内的出核受体结合，使相连的蛋白输出到细胞质，以进一步确保优化的GCaMP只在细胞质中分布，防止以Ca2+-CaMKII-CREB信号通路为代表的基因转录过程受到损害。而利用核定位序列与GCaMP蛋白的碳端相连，获得的钙离子浓度指示剂，能够在神经元细胞核分布且不影响细胞正常功能的指示剂，由此有助于研究细胞核里钙离子的功能及核内重要生命活动过程的作用机制，意义重大。
其中，需要说明的是，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂的制备方法不受特别限制，具体地，只要能够有效在GCaMP蛋白的氮端连接第一氨基酸序列，而在GCaMP蛋白的碳端连接第二氨基酸序列，使获得的钙离子浓度指示剂能够有效行使其各部分的功能，达到预定效果即可。
根据本发明的实施例，所述GCaMP蛋白为所有基于CaM的基因编码的钙离子浓度指示剂。由此，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂用于检测时效果更好。
根据本发明的实施例，所述能够减弱未结合钙离子的钙调蛋白与LTCC通道预结合能力的片段为选自CBM、LTCC通道的IQV结构域、Calpacitin蛋白家族的神经颗粒素的IQ结构域、Calpacitin蛋白家族的神经调节素的IQ结构域的至少之一。由此，能够有效减弱本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂中包含的未结合钙离子的钙调蛋白(apo-CaM)对内源LTCC通道门控的影响，从而用于检测时，能够反映出真实客观的钙离子浓度变化情况。
根据本发明的一些优选实施例，所述能够减弱未结合钙离子的钙调蛋白与LTCC通道预结合能力的片段为CBM。由此，未结合钙离子的钙调蛋白(apo-CaM)对内源LTCC通道门控的影响更小，从而本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂用于检测时，检测结果更真实客观。
根据本发明的实施例，所述CBM的序列如下所示：GMDELYKGTAATKIQAAFRGHITRKKLKDEKKGA(SEQ ID NO：1)。由此，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂对内源LTCC通道门控的影响小，用于检测时，检测结果真实客观。
根据本发明的实施例，所述LTCC通道的IQV结构域的序列如下列所示的任意之一：
IKTEGNFEQANEELRAIIKKIWKRTSMKLLDQVIPPIGDDEVTVGKFYATFLIQEHFRKFMKRQEEYYG(SEQ ID NO：2)；
IKTEGNLEQANEELRAIIKKIWKRTSMKLLDQVVPPAGDDEVTVGKFYATFLIQEYFRKFKKRKEQGLVG(SEQ IDNO：3)；
IKTEGNLEQANEELRAVIKKIWKKTSMKLLDQVVPPAGDDEVTVGKFYATFLIQDYFRKFKKRKEQGLVG(SEQ IDNO：4)；
IKTEGNLEQANQELRIVIKKIWKRMKQKLLDEVIPPPDEEEVTVGKFYATFLIQDYFRKFRRRKEKGLLG(SEQ IDNO：5)。
根据本发明的实施例，所述Calpacitin蛋白家族的神经颗粒素的IQ结构域的序列如下所示：AATKIQAAFRGHITRKKLKDEKKG(SEQ ID NO：6)。
根据本发明的实施例，所述Calpacitin蛋白家族的神经调节素的IQ结构域的序列如下所示：NAAAAKIQASFRGHMARKKIKSGE(SEQ ID NO：7)。
根据本发明的实施例，所述核输出序列为NES。NES能够与细胞内的出核受体结合，使相连的蛋白输出到细胞质，以进一步确保本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂只在细胞质中分布，防止以Ca2+-CaMKII-CREB信号通路为代表的基因转录过程受到损害。
根据本发明的实施例，所述核定位序列为NLS。由此，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂，能够在神经元细胞核分布且不影响细胞正常功能的指示剂，有助于研究细胞核里钙离子的功能及核内重要生命活动过程的作用机制。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种检测细胞质内钙离子浓度的方法。根据本发明的实施例，该方法使用前面所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，且所述第二氨基酸序列为核输出序列。由此，能够有效防止钙调蛋白入核，防止以Ca2+-CaMKII-CREB信号通路为代表的基因转录过程受到损害，检测结果真实客观。
根据本发明的一些优选实施例，所述第二氨基酸序列为NES，其序列如SEQ ID NO:8所示。
LALKLAGLDIGS(SEQ ID NO:8)。
由此，防止钙调蛋白入核的效果好，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂定位于细胞质避免入核影响细胞的基因转录，检测结果更真实客观。
在本发明的再一方面，本发明提供了一种检测细胞核内钙离子浓度的方法。根据本发明的实施例，该方法使用前面所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，且所述第二氨基酸序列为核定位序列。由此，本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂，能够在神经元细胞核分布且不影响细胞正常功能的指示剂，有助于研究细胞核里钙离子的功能及核内重要生命活动过程的作用机制。
根据本发明的一些优选实施例，所述第二氨基酸序列为NLS,其序列如SEQ ID NO:9所示。
PKKKRKV(SEQ ID NO:9)。
由此，检测结果更客观真实。
此外，还需要说明的是，根据本发明实施例的基因编码的钙离子浓度指示剂具有下列优点之一的至少之一：
(1)发明人基于GCaMP对神经元的损伤机制进行优化得到的本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂，相对于现有的GCaMP，进一步拓展了GCaMP成像的时间范围，并从根本上消除了GCaMP对神经元正常生理功能的影响，特别是对兴奋-转录偶联的干扰作用。
(2)本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂携带核输出序列时，能够在细胞质中反映更真实的钙浓度变化情况
(3)本发明的基因编码的钙离子浓度指示剂携带核定位序列时，能够作为有效的核内指示剂，有助于研究细胞核钙离子的功能及核内重要生命活动过程的作用机制。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是实施例1的GCaMP3核聚集程度与神经元生长的关系研究实验结果；
图2是实施例2的GCaMP3对CaV1.3通道门控特性的影响研究实验的结果；
图3是实施例2的GCaMP6f对神经元CaV1.3通道门控特性的影响研究实验的结果；
图4是实施例2的GCaMP3核聚集程度与神经元pCREB水平的关系研究实验结果；
图5是实施例2的各组神经元的pCREB水平的检测结果；
图6是实施例3的优化的GCaMP3对CaV1.3通道的门控特性影响的研究实验结果；
图7是实施例3的GCaMP6m-XC对神经元CaV1.3通道的门控特性影响的研究实验结果；
图8是实施例3的优化的GCaMP3的核聚集程度检测结果；
图9是实施例3的优化的GCaMP3对pCREB水平影响的研究实验结果；
图10是实施例3的优化的GCaMP3对神经元生长影响的研究实验结果；
图11是实施例3的HEK细胞中GCaMP6m-XC监测Ca2+浓度的变化的实验结果；
图12是实施例3的GCaMP6m-XC对神经元域下钙振荡的影响的研究实验结果；
图13是实施例4的核内钙离子浓度指示剂GCaMP-XN的结构示意图及神经元pCREB水平检测结果；
图14是实施例4的核内钙离子浓度指示剂GCaMP-XN的性能验证实验结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：GCaMP3的核聚集程度和相应神经元的形态的关系研究
目前，很多研究都发现并报道，使用病毒感染或电穿孔法使GCaMP在神经元中长期或过量表达时，GCaMP的荧光分布有向细胞核聚集的趋势，并且这些神经元的细胞形态、生理功能以及GCaMP监测Ca2+的性能会发生改变。
由此，发明人将荧光蛋白YFP和GCaMP3质粒分别转染分离培养的皮层神经元，质粒表达2天后，对GCaMP3的核聚集程度(GCaMP3荧光的核质比率N/C ratio)和相应神经元的形态(总突起长度)进行了定量分析。结果见图1。
如图1所示，(a)荧光蛋白YFP对照组，GCaMP3未入核组和GCaMP3核聚集组的代表神经元的突起跟踪图。(b)GCaMP3荧光的核质比率用于衡量其核聚集程度，比率越大表示聚集程度越高，比率大于1的神经元GCaMP3高度聚集在细胞核内，比率小于0.6的神经元可认为GCaMP3只分布于细胞质。神经元的突起总长度用于衡量其生长情况，总长度越长表示神经元生长状态越好。
由图1可知，GCaMP3荧光核质比率较高的神经元的总突起长度通常较短，说明GCaMP3的核聚集程度与神经元的形态负相关。也即GCaMP3在细胞核内高度聚集的神经元的生长受到抑制。
实施例2 GCaMP对神经元的损伤作用的机制研究
基于CaM能够参与并调控神经元的兴奋-转录偶联，因此发明人推测GCaMP对神经元的损伤作用主要源于自身包含的CaM，GCaMP可改变LTCC的门控-信号并影响CREB相关的基因转录过程。
首先，为了验证GCaMP会对LTCC门控特性产生影响，发明人使用细胞系表达系统进行实验，将GCaMP3与碳端完整的CaV1.3通道(α1DL)或短碳端的CaV1.3通道(α1DS)共表达在HEK293T细胞中，使用参数SCa(如S50Ca＝1-I50Ca/IpeakCa，其中I50Ca为电压激活50ms时的钙电流，IpeakCa为电压持续激活300ms内的尖峰钙电流)衡量通道的CDI强度。实验结果见图2。
如图2所示，(a)GCaMP3的示意图。(b)GCaMP3对长碳端CaV1.3通道门控特性的影响。细胞被钳制在-70mV，记录-70mV至+50mV电压下的钡电流和钙电流，步阶为10mV，每个激活电压记录时间持续300ms，每两个电压间间隔30s。电流图例是在-10mV电压下得到，图中灰色代表钡电流，黑色代表钙电流，通常情况下，钡电流幅值为钙电流幅值的1.5-3倍，为了便于观察，将钡电流缩放至与钙电流尖峰值重合，标尺只表示钙电流大小。使用参数SCa衡量通道的钙依赖失活程度，使用参数JCa,peak(钙电流与电容的比值)衡量通道的钙电流密度。(c)GCaMP3对短碳端CaV1.3通道门控特性的影响。电流图例在-10mV电压下获得，使用参数SCa衡量通道的钙依赖失活程度，使用参数JCa,peak衡量通道的钙电流密度。
由图2可知，GCaMP3与α1DL通道共表达时，α1DL通道的CDI程度增强并且电流密度有增大趋势，说明GCaMP3会影响α1DL通道的门控特性，并且GCaMP3对通道IQV结构域的竞争能力强于通道自身碳端；α1DS通道因不含碳端调节结构域显现出很强的CDI和很大的电流密度，与GCaMP3共表达时，α1DS通道的CDI程度减弱并且电流密度有减小趋势，说明GCaMP3也会影响α1DS通道的门控特性，而且能够与内源CaM竞争通道的IQV结构域。
与此同时，发明人使用GCaMP6f病毒感染皮层神经元以检测GCaMP对神经元内源LTCC门控特性的影响。神经元预先用含其它通道阻断剂(1μMnimodipine,1μMω-conotoxinGVIA,1μMω-conotoxin MVIIC)的溶液孵育使LTCC(主要是CaV1.3通道)得以分离。实验结果见图3。
如图3所示，GCaMP6f表达在皮层神经元中，使用其它通道阻断剂分离出神经元内源CaV1.3通道。电流图例在-10mV电压下获得，使用参数SCa衡量通道的钙依赖失活程度，使用参数JCa,peak衡量通道的钙电流密度。图3的结果显示，GCaMP6f显著增强了LTCC的CDI程度并增大了LTCC的钙电流密度。
综合图2和图3的结果，证实GCaMP能够影响LTCC的门控特性。
其次，为了验证基因转录过程也受到影响，发明人在分离培养的小鼠皮层神经元中表达GCaMP3，通过检测不同神经元Ca2+-CaMKII-CREB通路中转录因子的信号情况，即核内的CREB磷酸化(pCREB)水平(pCREB水平的检测方法是采用pCREB特异性抗体进行免疫荧光染色)，对GCaMP3的核聚集程度与转录因子的信号变化关系进行了定量统计。结果见图4。
如图4所示，GCaMP3荧光的核质比率用于衡量其核聚集程度，比率越大表示聚集程度越高，比率大于1的神经元GCaMP3高度聚集在细胞核，比率小于0.6的神经元可认为GCaMP3只分布于细胞质。免疫标记的荧光强度用于衡量pCREB水平。图4的结果显示GCaMP3荧光核质比率较高的神经元的pCREB水平通常较低，即GCaMP3的核聚集程度与神经元的pCREB水平呈现负相关关系。
接下来，以表达荧光蛋白YFP的神经元作为对照(control)，发明人统计了GCaMP3在细胞核内高度聚集的神经元(即N/C ratio>1)和GCaMP3只分布于细胞质的神经元的pCREB水平。实验结果见图5。
如图5所示，(a)荧光蛋白YFP对照组，GCaMP3未入核组，GCaMP3核聚集组，GCaMP3核定位组神经元核内pCREB水平的图例。上图亮光区域表示各蛋白分布的位置，下图亮光标记的荧光强度衡量pCREB的水平。(b)上述四组神经元核内pCREB水平的统计结果。括号中的数字表示统计的神经元个数。从图5的结果可以看出GCaMP3在细胞核中高度聚集之后，神经元对应的pCREB水平降低。然而，GCaMP3只分布在细胞质时，神经元对应的pCREB水平升高。类似地，将携带NLS的GCaMP3表达在皮层神经元，同样检测神经元核内pCREB水平，图5的结果显示GCaMP3定位在细胞核后，对应的pCREB水平降低，证实了GCaMP3入核后会对神经元造成损伤。
实施例3 GCaMP-X和GCaMP3-XC的制备和效果检测
实施例1-2的结果表明需要对现有的GCaMP进行优化。基于apo-CaM与LTCC的DCT结构域之间的竞争关系，GCaMP3的优化可以通过引入能减弱apo-CaM与通道预结合能力的片段(CaM Binding Motif，CBM)得以实现。将CBM直接与GCaMP3相连，在空间位置上有利于两者的结合，可削弱GCaMP3与LTCC的预结合能力，避免其对LTCC的门控特性产生干扰。
同时，发明人还利用了一段特殊的定位序列，即核输出信号(Nuclear ExportSignal，NES)序列(有时也称为“核输出序列”)，这段序列能够与细胞内的出核受体结合，使相连的蛋白输出到细胞质，进一步确保优化的GCaMP3只在细胞质中分布，防止以Ca2+-CaMKII-CREB信号通路为代表的基因转录过程受到损害。
通过对CBM展开进一步地筛选，发明人最终选取了BsCaMIQ蛋白中结合apo-CaM的片段，使其与GCaMP3的氮端融合，获得的蛋白命名为GCaMP3-X在此基础上，继续在碳端融合定位序列NES，得到的蛋白命名为GCaMP3-XC。GCaMP3-X/GCaMP3-XC合成方法是采用PCR合成扩增已知核酸序列的CBM，GCaMP3或NES/NLS片段；连接酶重组DNA，将CBM融合在GCaMP3的氮端，或将NES融合在GCaMP3的碳端；基因克隆，以pN1质粒为载体，将重组的GCaMP3-X/GCaMP3-XC目的序列通过多克隆位点插入质粒载体中，再通过酶切鉴定和基因测序的方法鉴定合成的目的基因；后续所使用的其他优化版本的GCaMP的制备方法雷同。
检测优化的GCaMP3对CaV1.3通道的门控特性的影响。结果见图6。如图6所示，(a)GCaMP3-X的组成示意图。(b)长碳端CaV1.3通道分别与GCaMP3-X和GCaMP3-XC共表达在HEK293T细胞中。电流图例在-10mV电压下得到，使用参数SCa衡量通道的钙依赖失活程度。(c)短碳端CaV1.3通道分别与GCaMP3-X和GCaMP3-XC共表达在HEK293T细胞中。电流图例在-10mV电压下得到，使用参数SCa衡量通道的钙依赖失活程度。
由图6可知，GCaMP3-X和GCaMP3-XC分别与α1DL通道或α1DS通道在HEK293细胞共表达时，通道的CDI程度均未发生改变，此结果一方面检验了GCaMP优化原则的可靠性，一方面证实了新版GCaMP-X已消除对CaV1.3通道门控特性的直接干扰。
与此同时，发明人制备了GCaMP6m-XC的腺相关病毒，其方法是构建病毒载体AAV-Syn-GCaMP6m-XC,并包被，收集，浓缩，纯化该病毒。发明人使用GCaMP6m-XC病毒感染皮层神经元以验证GCaMP-X不会对神经元内源LTCC门控特性产生影响。实验结果见图7。如图7所示，GCaMP6m-XC表达在皮层神经元中，使用其它通道阻断剂分离出神经元内源CaV1.3通道。电流图例在-10mV电压下获得，使用参数SCa衡量通道的钙依赖失活程度，使用参数JCa,peak衡量通道的钙电流密度。由图7可知，GCaMP6m-XC未改变内源LTCC的门控特性，表现在钙依赖失活程度和钙电流密度未发生显著变化。
接下来的研究分别将GCaMP3-X和GCaMP3-XC表达在皮层神经元中，这两种优化的GCaMP3荧光都只分布在细胞质内，表现出较低的核聚集程度(图8)。如图8所示，荧光的核质比率用于衡量其核聚集程度，比率大小可表示聚集程度的高低。GCaMP3-X组和GCaMP3-XC组神经元整体的核聚集程度降低。
检测不同组神经元的pCREB信号水平，结果见图9。如图9所示，(a)荧光蛋白YFP对照组，GCaMP3-X组，GCaMP3-XC组神经元pCREB水平的图例。上图亮光区域表示蛋白分布的位置，下图亮光标记的荧光强度衡量pCREB的水平。(b)上述三组神经元核内pCREB水平的统计结果。括号中的数字表示统计的神经元个数。图9的结果显示，与对照组相比，表达GCaMP3-X和GCaMP3-XC的神经元pCREB信号水平都无明显变化，说明优化的GCaMP3同时消除了对神经元基因转录过程的干扰。
此外，定量统计神经元的突起数目和总突起长度，结果见图10。如图10所示，(a)荧光蛋白YFP对照组，GCaMP3-X组和GCaMP3-XC组神经元突起跟踪图。(b)上述三组神经元突起数目及突起总长度的统计分析结果。括号中的数字表示统计的神经元个数。由图10可知，优化的GCaMP3也不影响神经元的生长。
为了验证优化的GCaMP还可作为钙离子浓度指示剂，发明人以GCaMP6m作为参照，使用10μM的乙酰胆碱(Acetylcholine)增加HEK293T细胞内的Ca2+浓度。检测结果见图11。
如图11所示，在HEK293T细胞中分别表达GCaMP6m和GCaMP6m-XC。使用含10μM乙酰胆碱的生理溶液提高胞内Ca2+浓度，与此同时测量GCaMP6m和GCaMP6m-XC的荧光值。每一次记录获得的荧光值与初始荧光值的差值为荧光变化值，用荧光变化值与初始荧光值的比值来衡量GCaMP6m和GCaMP6m-XC荧光强度的变化程度，比值越大表示变化程度越大。图11的结果显示GCaMP6m-XC与GCaMP6m一样能够响应HEK293T细胞内Ca2+浓度的变化并且荧光强度变化程度无明显差异，说明GCaMP优化版本维持着监测Ca2+浓度变化的能力。
另外，发明人还利用20mM[K+]溶液使膜电位变化至-40mV附近，增强神经元域下钙振荡以提高胞内Ca2+的浓度以比较GCaMP6m与GCaMP6m-XC的性能。比较结果见图12。如图12所示，在皮层神经元中分别表达GCaMP6m和GCaMP6m-XC。使用20mM[K+]溶液提高胞内Ca2+浓度，与此同时测量GCaMP6m和GCaMP6m-XC的荧光值。每一次记录获得的荧光值与初始荧光值的差值为荧光变化值，用荧光变化值与初始荧光值的比值来衡量GCaMP6m和GCaMP6m-XC荧光强度的变化程度，比值越大表示变化程度越大。由图12可知，由于GCaMP能够改变神经元内源LTCC的门控特性，使通道的钙电流密度增加，因此GCaMP组显示出异常增大的荧光响应，而GCaMP-X不影响内源通道的门控，能够反映出更真实的钙浓度变化情况。
实施例4 GCaMP3-XN的制备和效果检测
正常情况下，包含CaM的基因编码钙离子浓度指示剂表达于神经元中，指示剂相应的荧光都分布在细胞核之外，因此很难利用这类常用的指示剂检测神经元核内钙离子浓度的变化。发明人研究发现，利用特殊定位序列NLS将这类指示剂固定在细胞核中，则会异常损害神经元，此时指示剂荧光强度的改变已不能反映正常生理情况下钙离子浓度的变化。因此，需要开发在神经元细胞核分布且不影响细胞正常功能的指示剂，这样有助于研究细胞核里钙离子的功能及核内重要生命活动过程的作用机制。
根据本发明的GCaMP优化原理，参照实施例3的方法，通过使用apo-CaM的结合片段CBM以及核定位序列NLS，可在GCaMP的基础上得到应用于核内的指示剂GCaMP-XN。GCaMP-XN的组成示意图和神经元pCREB水平检测结果见图13。
如图13所示，(a)GCaMP-XN的组成示意图。(b)对照组YFP，GCaMP3核定位组，GCaMP3-XN组神经元pCREB水平的图例及统计结果。上图亮光区域表示蛋白分布的位置，下图亮光标记的荧光强度衡量pCREB的水平。由图13可知，GCaMP3-XN只分布在细胞核中，而且表达该指示剂的神经元Ca2+-CaMKII-CREB信号通路并没有明显的变化，说明GCaMP3-XN可以作为核内指示剂的候选者。
接下来，发明人利用40mM[K+]溶液改变神经元的膜电位，诱发神经元发放动作电位以提高核内Ca2+的浓度。实验结果见图14。
如图14所示，在皮层神经元中分别表达核定位的GCaMP3和GCaMP3-XN。使用40mM[K+]o溶液提高核内Ca2+浓度，与此同时测量GCaMP3和GCaMP3-XN的荧光值。每一次记录获得的荧光值与初始荧光值的差值为荧光变化值，用荧光变化值与初始荧光值的比值来衡量GCaMP3和GCaMP3-XN荧光强度的变化程度，比值越大表示变化程度越大。由图14可知，与核定位的GCaMP3相比，GCaMP3-XN能够快速灵敏地监测核内钙浓度变化，显现出更明显的荧光强度变化，此结果很好地反映出GCaMP-XN的功能实用性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 基因编码钙探针GCaMP-X的设计与应用
<130> PIDC3172862
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CBM的序列
<400> 1
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Thr Ala Ala Thr Lys Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ala Phe Arg Gly His Ile Thr Arg Lys Lys Leu Lys Asp Glu Lys Lys
20 25 30
Gly Ala
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LTCC通道的IQV结构域的序列
<400> 2
Ile Lys Thr Glu Gly Asn Phe Glu Gln Ala Asn Glu Glu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Ile Ile Lys Lys Ile Trp Lys Arg Thr Ser Met Lys Leu Leu Asp Gln
20 25 30
Val Ile Pro Pro Ile Gly Asp Asp Glu Val Thr Val Gly Lys Phe Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Ile Gln Glu His Phe Arg Lys Phe Met Lys Arg Gln
50 55 60
Glu Glu Tyr Tyr Gly
65
<210> 3
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LTCC通道的IQV结构域的序列
<400> 3
Ile Lys Thr Glu Gly Asn Leu Glu Gln Ala Asn Glu Glu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Ile Ile Lys Lys Ile Trp Lys Arg Thr Ser Met Lys Leu Leu Asp Gln
20 25 30
Val Val Pro Pro Ala Gly Asp Asp Glu Val Thr Val Gly Lys Phe Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Ile Gln Glu Tyr Phe Arg Lys Phe Lys Lys Arg Lys
50 55 60
Glu Gln Gly Leu Val Gly
65 70
<210> 4
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LTCC通道的IQV结构域的序列
<400> 4
Ile Lys Thr Glu Gly Asn Leu Glu Gln Ala Asn Glu Glu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Val Ile Lys Lys Ile Trp Lys Lys Thr Ser Met Lys Leu Leu Asp Gln
20 25 30
Val Val Pro Pro Ala Gly Asp Asp Glu Val Thr Val Gly Lys Phe Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Ile Gln Asp Tyr Phe Arg Lys Phe Lys Lys Arg Lys
50 55 60
Glu Gln Gly Leu Val Gly
65 70
<210> 5
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LTCC通道的IQV结构域的序列
<400> 5
Ile Lys Thr Glu Gly Asn Leu Glu Gln Ala Asn Gln Glu Leu Arg Ile
1 5 10 15
Val Ile Lys Lys Ile Trp Lys Arg Met Lys Gln Lys Leu Leu Asp Glu
20 25 30
Val Ile Pro Pro Pro Asp Glu Glu Glu Val Thr Val Gly Lys Phe Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Ile Gln Asp Tyr Phe Arg Lys Phe Arg Arg Arg Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Leu Leu Gly
65 70
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Calpacitin蛋白家族的神经颗粒素的IQ结构域的序列
<400> 6
Ala Ala Thr Lys Ile Gln Ala Ala Phe Arg Gly His Ile Thr Arg Lys
1 5 10 15
Lys Leu Lys Asp Glu Lys Lys Gly
20
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Calpacitin蛋白家族的神经调节素的IQ结构域的序列
<400> 7
Asn Ala Ala Ala Ala Lys Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly His Met Ala
1 5 10 15
Arg Lys Lys Ile Lys Ser Gly Glu
20
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第二氨基酸序列NES的序列
<400> 8
Leu Ala Leu Lys Leu Ala Gly Leu Asp Ile Gly Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第二氨基酸序列NLS的序列
<400> 9
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5

Claims (10)

1.一种基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，其组成包括：
GCaMP蛋白；
第一氨基酸序列；以及
第二氨基酸序列，
其中，所述第一氨基酸序列为能够减弱未结合钙离子的钙调蛋白与LTCC通道预结合能力的片段，所述第二氨基酸序列为核输出序列或核定位序列，
所述第一氨基酸序列位于所述GCaMP蛋白的氮端，所述第二氨基酸序列位于所述GCaMP蛋白的碳端。
2.根据权利要求1所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述GCaMP蛋白为所有基于CaM的基因编码的钙离子浓度指示剂，
任选地，所述GCaMP蛋白为GCaMP3,GCaMP5G,GCaMP6m，GCaMP6f或GCaMP6s。
3.根据权利要求1所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述能够减弱未结合钙离子的钙调蛋白与LTCC通道预结合能力的片段为选自CBM、LTCC通道的IQV结构域、Calpacitin蛋白家族的神经颗粒素的IQ结构域、Calpacitin蛋白家族的神经调节素的IQ结构域的至少之一，优选CBM。
4.根据权利要求3所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述CBM的序列如下所示：GMDELYKGTAATKIQAAFRGHITRKKLKDEKKGA(SEQ ID NO：1)。
5.根据权利要求3所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述LTCC通道的IQV结构域的序列如下列所示的任意之一：
IKTEGNFEQANEELRAIIKKIWKRTSMKLLDQVIPPIGDDEVTVGKFYATFLIQEHFRKFMKRQEEYYG(SEQID NO：2)；
IKTEGNLEQANEELRAIIKKIWKRTSMKLLDQVVPPAGDDEVTVGKFYATFLIQEYFRKFKKRKEQGLVG(SEQ ID NO：3)；
IKTEGNLEQANEELRAVIKKIWKKTSMKLLDQVVPPAGDDEVTVGKFYATFLIQDYFRKFKKRKEQGLVG(SEQ ID NO：4)；
IKTEGNLEQANQELRIVIKKIWKRMKQKLLDEVIPPPDEEEVTVGKFYATFLIQDYFRKFRRRKEKGLLG(SEQ ID NO：5)。
6.根据权利要求3所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述Calpacitin蛋白家族的神经颗粒素的IQ结构域的序列如下所示：AATKIQAAFRGHITRKKLKDEKKG(SEQ IDNO：6)。
7.根据权利要求3所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述Calpacitin蛋白家族的神经调节素的IQ结构域的序列如下所示：NAAAAKIQASFRGHMARKKIKSGE(SEQ IDNO：7)。
8.根据权利要求1所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，其特征在于，所述核输出序列为NES，
任选地，所述核定位序列为NLS。
9.一种检测细胞质内钙离子浓度的方法，其特征在于，使用权利要求1-8任一项所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，且所述第二氨基酸序列为核输出序列，优选NES。
10.一种检测细胞核内钙离子浓度的方法，其特征在于，使用权利要求1-8任一项所述的基因编码的钙离子浓度指示剂，且所述第二氨基酸序列为核定位序列，优选NLS。
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