CN107987134A - 一种蛋白质Dhw1及其编码基因dhw1和应用 - Google Patents

一种蛋白质Dhw1及其编码基因dhw1和应用 Download PDF

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    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles

Abstract

本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及一种蛋白质Dhw1及其编码基因dhw1和应用。所述蛋白质Dhw1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述基因dhw1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。通过人工合成基因dhw1并构建质粒载体后，转化入工程菌株中表达，将其表达产物蛋白质Dhw1应用于农业领域。蛋白质Dhw1能够提高农作物的免疫力，调节农作物的生长，提高其抗病、抗虫、抗旱和抗寒性能力，从而实现了农作物的增产。该方法简单成本低，且对土壤环境无污染，绿色环保。

Description

一种蛋白质Dhw1及其编码基因dhw1和应用
技术领域
本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及一种蛋白质Dhw1及其编码基因dhw1和应用。
背景技术
基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术，基因合成是用人工方法合成基因的技术，是基因获取的手段之一，相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制。
人类首条人工合成的基因出现在上世纪60年代，2008年，J.C.Venter小组合成了Mycoplasma genitalium生殖道支原体基因组，另外美国约翰霍普金斯医学院等处的研究人员也首次合成了一种真核生物基因。该方法可以获得自然界中不存在的基因，为人类改造生物开辟了一个全新的方向，在可预计的将来，基因合成将在生命科学领域发挥巨大作用，在新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物医药、农业技术等领域的作用已初步体现。
农业是国民经济的基础，大力发展农业，促进农作物增产增收是各国科学家致力攻克的问题。由于中国人口众多，农作物供应严重紧缺，而现有技术中存在的农作物促进生长剂存在效果不明显、不环保、很容易对生态造成污染等问题。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明第一个方面公开了一种蛋白质Dhw1，所述蛋白质Dhw1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，该蛋白质的分子量为38.26kDa。
本发明第二个方面公开了一种编码上述蛋白质Dhw1的基因dhw1，所述基因dhw1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该基因为人工设计基因，其序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)未能搜索出相关的序列，将其合成，并构建质粒载体后，转化入工程菌株中表达，将其表达产物蛋白质Dhw1应用在农业领域。
本发明第三个方面公开了上述蛋白质Dhw1在促进农作物生长中的应用，所述农作物为小麦、塔菜等。简单来讲，其喷施蛋白质Dhw1于农作物的叶面上时，该蛋白质与农作物表面细胞膜上的受体结合，引起农作物体内一系列相关酶活性的增强，以调节水杨酸含量为主要路径，释放抗性因子，激活农作物抗性系统，并产生具有抗病作用的几丁酶、葡聚糖酶、植保素及PR蛋白等因子，从而提高了农作物的免疫力，调节了农作物生长，提高其抗病、抗虫、抗旱和抗寒性能力，从而实现了农作物的增产。
本发明第四个方面公开了一种生产权利要求1所述的蛋白质Dhw1的方法，包括以下步骤：
S1、人工合成上述基因dhw1；
S2、得到转化有S1中基因dhw1的工程菌种；
S3、将S2中的工程菌种经培养后收集菌体发酵液；
S4、将S3中的菌体发酵液进行分离纯化得到蛋白质Dhw1。
优选的，所述S1包括以下步骤：
S11：分别进行基因dhw1的单链oligo的设计与合成；
S12：利用PCR方法将S11中的单链oligo拼接成双链DNA，即得到基因dhw1。
优选的，所述S2包括以下步骤：
S21：将基因dhw1克隆到pET28a载体得到dhw1-pET28a载体；
S22：将S21中得到的dhw1-pET28a载体转化至DH5a细胞，将转化后的DH5a细胞中的质粒提取后进行基因测序；
S23：将基因测序结果正确的质粒转化BL21感受态细胞，得到目的工程菌种。
优选的，所述S3中的工程菌种在LB液体培养基中培养。
优选的，所述S4中的分离纯化包括以下步骤：将菌种发酵液离心后，破壁，再用硫酸铵盐析，得到蛋白质Dhw1。
进一步的，采用超声波进行破壁处理。
与现有技术相比，本发明具有如下优点或者有益效果：
本发明公开了一种蛋白质Dhw1及其编码基因和应用，通过人工合成基因dhw1并构建质粒载体后，转化入工程菌株中表达，将其表达产物蛋白质Dhw1应用于农业领域。当往农作物的叶面上喷施蛋白质Dhw1后，该蛋白质与农作物表面细胞膜上的受体结合，引起农作物体内一系列相关酶活性的增强，以调节水杨酸含量为主要路径，释放抗性因子，激活农作物抗性系统，并产生具有抗病作用的几丁酶、葡聚糖酶、植保素及PR蛋白等因子，从而提高了农作物的免疫力，调节了农作物生长，提高其抗病、抗虫、抗旱和抗寒性能力，从而实现了农作物的增产。该方法简单成本低，且对土壤环境无污染，绿色环保。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明实施例中pET28a质粒的图谱；
图2为本发明实施例中Dhw1蛋白质的电泳检测图；其中，泳道1为Dhw1蛋白质，泳道2为未插入目的基因的空载菌株，泳道3为低分子量标准蛋白；
图3为本发明实施例中Dhw1蛋白质对塔菜的生长作用照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 基因dhw1的合成
1.1材料
pET28a、oligo DNA、DH5a感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞。
1.2步骤
本实施例为基因dhw1的合成，具体步骤如下：
(1)首先分别进行基因dhw1序列单链oligo的设计与合成；
(2)利用PCR的方法将单链oligo拼接成双链DNA；该PCR反应的体系如下：
扩增条件：94℃预变形2min 30sec，再按照94℃30sec，58℃30sec，68℃30sec，程序扩增共30个循环。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化得到基因dhw1。
其中，该PCR反应的体系中引物1(正向引物)的序列如SEQ ID No.3所示：引物2(反向引物)的序列如SEQ ID No.4所示。
实施例2 目的工程菌种的构建
将合成好的基因dhw1序列克隆到pET28a载体(图谱见图1)中，并转化至DH5a细胞。具体步骤如下：
(1)将基因dhw1和载体pET28a分别进行酶反应，体系如下:
在37℃温度下反应3h，琼脂糖电泳回收。
(2)将基因dhw1与载体pET28a连接，反应体系如下：
室温下连接1h。
(3)转化
取10μl连接液加入100μl DH5a，冰浴30min，42℃热激1min，立即放回冰上静置2min。加入300μl LB，37℃复苏30min，涂板。
(4)将转化后的DH5a细胞中的质粒提取后进行基因测序；采用Seqman软件测序验证重组克隆是否与目的序列一致。
(5)将测序验证正确的质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，得到工程菌种。
实施例3 目的基因表达产物Dhw1蛋白质的分离和纯化的方法。
本实施例公布了目的基因表达产物Dhw1蛋白质的分离和纯化的方法，具体步骤如下。
(1)将实施例2中得到的工程菌种(E.coli JM109(DE3)-pET28a-dhw1)接种于LB液体培养基中，在37℃、210rpm的条件下振荡培养8h，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导4小时后终止培养；
(2)10000rpm转速下离心10min，收集菌体，加入PBS缓冲液超声波破碎，再次离心去细胞碎片，上清液为含有Dhw1蛋白质的提取液；
(3)在步骤(2)中得到的含有Dhw1蛋白质的提取液中直接加硫酸铵至终浓度为60％，将混合溶液放在磁力搅拌器上搅拌6h，使其充分沉淀；
(4)将沉淀重新用缓冲液溶解，放入透析袋中透析24-48h，每隔5h更换透析液除去硫酸铵；
(5)收集透析液，冷冻干燥后得到Dhw1蛋白质样品，通过12％浓度聚丙烯酰胺电泳检测，经考马斯亮蓝染色后可见其表达产物Dhw1蛋白质，并将E.coli JM109(DE3)-pET28a空载菌株作为对照，结果见图2，从图中可以看出分离纯化得到的蛋白质样品中Dhw1蛋白质的纯度非常高。
实施例4 Dhw1蛋白质对塔菜的生长作用实验
本实施例公开了Dhw1蛋白质对塔菜的生长作用实验，具体步骤如下：
将Dhw1蛋白质样品配成20μg/ml浓度的水溶液，在塔菜幼苗有2～3片时，将其喷施叶面，每20天一次，清水作为对照，经3次喷洒后处理组长势良好，叶片肥嫩，增产35％，塔菜的整个生长季节均可进行喷施。结果表明Dhw1蛋白质对塔菜的生长有促进作用，结果见图3。
实施例5 Dhw1蛋白质对小麦的生长作用实验
本试验小麦品种为济麦22，Dhw1蛋白质样品浓度为20μg/ml，土壤类型为潮土，表层质地为中壤，中高肥力水平，地力均匀，小区面积为30平米，试验重复三次，随机排列，设保护行，试验共设三个实验组，实验组1为常规施肥加Dhw1蛋白质溶液，实验组2为常规施肥加清水，实验组3为常规施肥，对照组为清水，共喷施4次。经试验后，实验组1和实验组3与对照组差异达到极其显著水平，实验组2与对照组差异不明显，喷施Dhw1蛋白质溶液的小麦产量比对照组增产9.2％，通过效益情况分析，与对照组相比，投入产出比为1：2.2，施用Dhw1蛋白质溶液增收效果明显。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海国礼生物科技有限公司
<120> 一种蛋白质Dhw1及其编码基因dhw1和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Ala Cys His Ala Cys Pro Thr Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ser Met
1 5 10 15
Leu Ala Pro Val Ile Pro Ser Thr His Pro Ala Ala Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Ala Ser Thr Gly Thr Thr Thr Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ser Gly Leu
35 40 45
Pro Thr Gly Thr Ser Ala Ala Ala Ser Thr Thr Ala Cys His Pro Thr
50 55 60
Val Gly Ile Val Gly Ala Pro Ile Leu His Pro Pro Thr Leu Gly Pro
65 70 75 80
Thr Ala Ile Val Pro Ala Val Gly Val Gly Cys His Val Gly Thr Pro
85 90 95
Ile Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala Leu Gly Ala Ala Thr Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Ala Leu Gly Ser Ala Gly Gly Gly Leu Ala Leu Gly Ala
115 120 125
Ile Ala Ile Ala Ala Ser Ala Gly Thr Val Ala Ala Val Cys Ala Pro
130 135 140
His Pro Gly Leu Gly Pro Leu Ile Val Thr Pro Ala Ile Leu Leu Pro
145 150 155 160
Ser Thr Cys Ala His Ala Leu Leu Ala Ala Val Thr Ala Gly Cys Ala
165 170 175
His Gly Ile Leu Cys Val Gly Cys Ser Gly Thr Gly Leu Gly Gly Val
180 185 190
Ser Thr Leu Val Gly Ser Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Ser Thr His Ala His Ala Ala Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala
210 215 220
Pro Pro Gly Pro Leu Ser Thr Leu Thr Ala Cys Ser Ala Ala Val Val
225 230 235 240
His Leu Leu His Ala Ala Leu Ser Val Leu Ala Ile Ala Ile Leu His
245 250 255
Ala Cys Ala Thr His Ser Thr Thr Pro Gly Ser Ser Gly Thr Ala Ser
260 265 270
Ala Leu Ala Ala Ser Pro Pro Ala Pro Gly Thr Ala Ser Ala Leu Leu
275 280 285
Ala Pro Cys Ala Pro Leu Pro Leu Ala Thr Pro Ser Leu Leu Ile Pro
290 295 300
Ser Pro Pro Gly Leu Ala Ser Leu Ser Thr Leu Gly Pro Ser Ala Gly
305 310 315 320
Ala Ala Gly Pro Ser Pro Pro Ser Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Gly
325 330 335
Thr Pro
<210> 2
<211> 1034
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taccgatgcc acgcctgccc caccgcgctt ttgtgacgga atttgtccat gctggcgccg 60
gtcataccgt catggcattt tcgggcgttg cgcactcagc gcagcactca gtggtggtgg 120
tggcagctac catggtattc cggtttacca actggttggt cagcgcggag gtcaacttat 180
cgatgtcacc cgtacgtggg tatcgtccag cgctttatta aacatttccc aacattacag 240
ccataccgta tcgtacccgc ggttcaggtt ggatgtcatg ttggctattt tatcgccgac 300
cgacgtgaaa ccgcgcaggc cctgcaagcc gcctatgcca ggccctacgc gctcggatcc 360
agagaaggct gagagaagcg ccttggacgc atcgatatcc gccgatctcg cgagaccgtt 420
gccgccgttt gtcgtccaca tcccggactc cagccactca tcgtgtggcc ggcgattttg 480
ttaccgtcgt attgccggca ctgacgtttg ttagcagcgg tctggaatgg atgccgtcat 540
cagatcttgt gctaagttgg ttgctctggt tatcagcttg gtcaggtgtc aactctcgtt 600
gaatcatacc catcgccgcg cccagcccct gcgccagccg acagtaccca tcgccacgca 660
aattctgccc catttaggaa ccgccctttc gggcctttat ctacaaagtg gcggtgctca 720
cgccgcgttg ttcataaact gcatgccgat ctttcggtgc tcagaatccg gatactacac 780
cgctgccgaa cgcattcata ttaccctggg tcatctggct ggcgttcagc attgaacgca 840
tcgccgccgg atttcggtac ggatagcagg ttgctcgcac cctgcgcgcc attgccgaaa 900
gactggccca gttgattgct catccccagc cccttcgagc tggcgagttt atccacgctg 960
gaacccagcg atgaagccgc ggaattcagt cctttcagtc cctgaacact cagccccaga 1020
ccggaaacgc caaa 1034
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgcccatg ggctaccgat gccacgcctg ccccac 36
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgcctcga gtttggcgtt tccggtctgg ggctg 35

Claims (10)

1.一种蛋白质Dhw1，所述蛋白质Dhw1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述蛋白质Dhw1的基因dhw1，其特征在于，所述基因dhw1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的蛋白质Dhw1在促进农作物生长中的应用。
4.根据权利要求3所述的蛋白质Dhw1在促进小麦和塔菜生长中的应用。
5.一种生产权利要求1所述的蛋白质Dhw1的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、人工合成权利要求2所述基因dhw1；
S2、得到转化有S1中基因dhw1的工程菌种；
S3、将S2中的工程菌种经培养后收集菌体发酵液；
S4、将S3中的菌体发酵液进行分离纯化得到蛋白质Dhw1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：
S11：分别进行基因dhw1的单链oligo的设计与合成；
S12：利用PCR方法将S11中的单链oligo拼接成双链DNA，即得到基因dhw1。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S2包括以下步骤：
S21：将基因dhw1克隆到pET28a载体得到dhw1-pET28a载体；
S22：将S21中得到的dhw1-pET28a载体转化至DH5a细胞，将转化后的DH5a细胞中的质粒提取后进行基因测序；
S23：将基因测序结果正确的质粒转化BL21感受态细胞，得到目的工程菌种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S3中的工程菌种在LB液体培养基中培养。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S4中的分离纯化包括以下步骤：将菌种发酵液离心后，破壁，再用硫酸铵盐析，得到蛋白质Dhw1。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用超声波进行破壁处理。
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