CN107982530B - Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用及其药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用，同时公开了一种以Semaphorin7A抗体为有效成分治疗心肌炎疾病的药物。本发明在心肌炎发病小鼠模型中，给予发病小鼠Semaphorin7A抗体的治疗，能够缓解心肌细胞炎症和提高小鼠生存率；在治疗心肌炎症药物的研发及生产中，具有重要的应用前景和推广价值。

Description

Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应 用及其药物

技术领域

本发明属于制备药物用途领域，尤其涉及Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用及其药物。

背景技术

心肌炎是一种以心肌局限性或弥漫性的炎性病变为主要表现的疾病。Lieberman根据心肌活检的组织学改变与临床表现，将心肌炎分为暴发性心肌炎、急性心肌炎、慢性活动性心肌炎和慢性迁延性心肌炎。心肌炎的病理生理机制尚不清楚。大鼠肠道病毒心肌炎模型显示,病毒进入急性损伤的心肌细胞，通过复制导致心肌坏死，细胞内抗原暴露及宿主免疫系统激活。该期持续数周至数月，以病毒特异性T淋巴细胞激活为特征，造成靶器官损伤。细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素1和6、病毒抗体及心肌蛋白激活，加速心肌及其收缩功能损伤。多数心肌炎患者，通过免疫反应清除病毒而减轻心肌损害，左室功能完全恢复。也有部分患者，自身免疫过程不依赖心肌病毒存在，导致心肌重构形成扩张型心肌病，尸检结果显示，8.6％-12％的年轻猝死者合并心肌炎。对急性心肌炎患者的长期随访结果显示，3年后扩张型心肌病的患病率达21％。扩张型心肌病合并慢性心力衰竭是心肌炎晚期的主要结局。所以说心肌炎是潜在的严重危害生命的疾病。

心肌炎的病因包括感染性与非感染性两大类，感染性因素包括细菌、真菌、原虫、寄生虫、螺旋体、立克次体及病毒；非感染性因素有以下几个方面：(1)免疫介导性疾病(变应原、同种抗原、自身抗原)；(2)中毒性(药物、重金属、生物毒性物质、物理损伤等)。其中最常见的病因为病毒感染，随着聚合酶链式反应(PCR)及原位杂交等分子生物学技术应用，分离出与心肌炎相关性病毒包括肠道病毒、腺病毒、细小病毒B19及人类疱疹病毒6,其他因素少见。

目前心肌炎的治疗尚无特效药物，由于多数心肌炎由病毒感染导致，主要是通过抗病毒治疗和免疫治疗。动物研究结果显示，干扰素IFN能够有效抑制肠道病毒、减少炎症细胞浸润，减轻心肌炎心肌损伤、改善左室功能。多项有关免疫抑制、免疫调节、抗炎药及免疫吸附治疗心肌炎研究结果显示，免疫抑制治疗尚不能作为炎症性心肌病的标准治疗。强的松联用硫唑嘌呤或环孢霉素治疗1年，并未显著降低死亡率、改善心功能。免疫相关性心肌炎，如特发性巨细胞性心肌炎、心脏结节病、嗜酸粒细胞性心肌炎等，也可考虑免疫抑制剂治疗。因此，亟需找到一种合适的药物，能够有效的缓解心肌炎症状，延长患者存活时间。

发明内容

为了解决现有技术中心肌炎疾病缺少有效治疗药物的问题，本发明实施例提供了一种Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用及其药物。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例公开了一种Semaphorin7A抗体的新用途，具体为Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用。

具体地，所述心肌炎疾病包括病毒引起的心肌炎疾病和自身免疫性心肌炎疾病。

另一方面，本发明实施例进一步公开了一种用于治疗心肌炎疾病的药物，其活性成分包括Semaphorin7A抗体。

具体地，所述肌炎疾病包括病毒引起的心肌炎疾病和自身免疫性心肌炎疾病。

进一步地，所述用于治疗心肌炎疾病的药物还包括药物辅料和药用基质。

优选地，所述用于治疗心肌炎疾病的药物为注射制剂。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1、本发明实施例给予发病小鼠Semaphorin7A单抗的治疗，能够有效缓解心肌细胞炎症和提高小鼠生存率，在治疗心肌炎疾病具有明显的疗效；

2、本发明实施例公开了Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用；在治疗心肌炎症药物的研发及生产中，Semaphorin7A的新用途发明具有重要意义；

3、本发明实施例建立了健康Balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的心肌炎动物模型，该模型适合临床应用研究，对于心肌炎的药物研发具有重要的应用推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为CVB3感染小鼠体重变化图；

图2为CVB3感染小鼠血清血肌钙变化图；

图3为CVB3感染小鼠心脏组织切片免疫组化病理图；

图4为CVB3感染小鼠心脏小动物超声图；

图5为CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型生存率图；

图6为CVB3感染小鼠给予Sema7A抗体治疗血清中抗体含量检测结果图；

图7为CVB3感染小鼠给予Sema7A抗体治疗后血清血肌钙变化图；

图8为CVB3感染小鼠通过Sema7A抗体治疗后心脏组织切片免疫组化染色和病理评分图；

图9为CVB3感染小鼠通过Sema7A抗体治疗后心脏二维超声图；

图10为Sema7A抗体治疗后CVB3感染病毒性心肌炎小鼠的生存率图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例构建了CVB3诱导的病毒性心肌炎模型；所述模型的构建步骤具体包括：

(1)取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，每组8只，分别以腹腔注射的方式给每只小鼠103TCID50剂量的CVB3病毒，PBS组为对照；

(2)在病毒感染后7天，观测小鼠的体重变化并对心肌炎指标与对照组进行分析比对。

如图1所示的CVB3感染小鼠心肌体重变化检测结果图，CVB3小鼠的体重与普通小鼠比较，体重随着感染时间明显减轻；

如图2所示的CVB3感染小鼠心肌损伤血清血肌钙cTnI酶活检测结果图，CVB3感染小鼠的心肌炎指标和对照组相比，血清血肌钙cTnI活性从第三天明显增加,在感染后第七天达到9.75ng/ml；

在病毒感染的0、3、5、7天取感染小鼠心脏组织，用苏木素(Hematoxylin)-伊红(Eosin)染色浸润炎性细胞，如图3所示的心肌组织切片免疫组化，可见第3天小鼠心肌组织开始出现少量的炎性细胞浸润，并且在第5天和第7天逐渐加重；

在病毒感染的0、3、5、7天使用二维超声M-mode心动图检测心脏功能，如图4所示，检测结果表明，从CVB3感染第1天开始，小鼠的心脏功能就开始改变，并持续到第7天；在感染病毒的7天内，小鼠心脏的舒张和收缩力逐渐减弱，心功能紊乱。

最后统计了小鼠的生存情况，如图5所示，相对于正常组，发病组小鼠从第四天开始死亡，到第七天生存率为50％(4/8)，表明小鼠的CVB3诱导的病毒性心肌炎模型建立成功，为后续治疗效果验证提供了有力的模型支持。

本发明实施例公开了Sema7A抗体用于CVB3诱导的病毒性心肌炎的治疗作用；具体治疗方案包括如下步骤：

(1)取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，分2组，每组8只，以腹腔注射的方式给每只小鼠103TCID50剂量的CVB3病毒，诱导病毒性心肌炎。

在病毒感染的第一天和第三天分别以腹腔注射的方式给予小鼠Sema7A mAb30ug/只，注射isotype的IgG为对照组。

在感染病毒的1至7天中，利用Western blot技术检测各个时间点收集的血清中Sema7A抗体的含量，如图6所示。实验结果表明，和对照组相比，注射了Sema7A mAb的小鼠，其血清中Sema7A抗体的含量在注射后12小时即可检测到，在36小时后在血清中达到高峰，然后随着时间推移逐渐减少，在注射后72小时仍能够检测到。

本步骤实验说明本发明以腹腔注射的方式给予小鼠Sema7A抗体，能够在小鼠血清中检测到Sema7A抗体，并至少延续到注射后72小时。

(2)取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，分2组，每组8只，以腹腔注射的方式给每只老鼠103TCID50剂量的CVB3病毒，诱导病毒性心肌炎。

在病毒感染的第一天和第三天分别以腹腔注射的方式给予小鼠Sema7A mAb30ug/只，注射Isotype的IgG为对照组。

在感染的第7天，观测小鼠心肌炎指标和对照组相比，给予小鼠Sema7A抗体治疗之后，血清血肌钙指标cTnI含量为4.9ng/ml,而对照组Isotype的cTnI含量为9.8ng/ml，如图7所示。

在感染后第7天取感染小鼠心脏组织，用苏木素(Hematoxylin)-伊红(Eosin)染色浸润的炎性细胞(参见图8A)，根据图8A所示的实验结果，计算免疫组化切片的病理评分，如图8B所示，Sdudents T test,**P<0.01；小鼠心脏病理切片同样表明，Sema7A mAb治疗组小鼠心脏在第7天未见明显炎症，而对照组小鼠心脏炎症加重，有大量淋巴细胞浸润，心脏呈弥漫性坏死，同样小鼠心脏心肌坏死评分与心脏病理切片一致。

在感染第7天使用二维超声M-mode心动图检测感染小鼠和对照组小鼠的心脏功能，检测结果如图9A所示；根据此结果计算左心室射血分数(Ejection Fraction)和收缩分数(Fractional shortening)，详见图9B。

对各组小鼠做小动物心脏超声实验的检测结果表明，给予Sema7A抗体治疗组，小鼠心脏舒张收缩正常，M modle下，心脏泵血正常，并且没有看到心脏体积膨大，而Isotype对照组小鼠，心脏收缩舒张能力减弱，心脏造影明显，心律不齐，并且心脏体积有膨大趋势，心脏左心室射血分数和短轴缩短率变低和心超生理功能吻合。

观察各组小鼠每天的生存情况，参见图10结果显示，Sema7A抗体组能有效提高小鼠的生存率达到87.5％，而对照组小鼠的生存率只有50％。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1、本发明实施例给予发病小鼠Semaphorin7A单抗的治疗，能够有效缓解心肌细胞炎症和提高小鼠生存率，在治疗心肌炎疾病具有明显的疗效；

2、本发明实施例公开了Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用；在治疗心肌炎症药物的研发及生产中，Semaphorin7A的新用途发明具有重要意义；

3、本发明实施例建立了健康Balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的心肌炎动物模型，该模型适合临床应用研究，对于心肌炎的药物研发具有重要的应用推广价值。

实施例2

本发明实施例构建了心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂乳化的制剂诱导的自身免疫性心肌炎模型；所述模型的构建步骤具体包括：

(1)取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，每组8只，分别以皮下注射的方式给每只小鼠心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂乳化的制剂，注射Isotype的IgG为对照组；

(2)在皮下注射制剂后21天，观测小鼠的体重变化并对心肌炎指标与对照组进行分析比对，统计小鼠的生存情况，相对于正常组，诱导组小鼠从第10天开始死亡，到第21天生存率为50％(4/8)，表明小鼠的心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂乳化的制剂诱导的自身免疫性心肌炎模型建立成功，为后续治疗效果验证提供了有力的模型支持。

本发明实施例公开了Sema7A抗体用于心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂乳化的制剂诱导的自身免疫性心肌炎模型的治疗作用；具体治疗方案包括如下步骤：

取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，分2组，每组8只，直接给小鼠皮下注射心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂乳化的制剂，诱导自身免疫性心肌炎。

在病毒感染的第1天和第10天分别以腹腔注射的方式给予小鼠Sema7A抗体30ug/只，注射Isotype的IgG为对照组。

观察各组小鼠每天的生存情况，结果显示，第21天，Sema7A抗体治疗组能有效提高小鼠的生存率达到100％，而对照组小鼠的生存率只有37.5％。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1、本发明实施例给予发病小鼠Semaphorin7A单抗的治疗，能够有效缓解心肌细胞炎症和提高小鼠生存率，在治疗心肌炎疾病具有明显的疗效；

2、本发明实施例公开了Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用；在治疗心肌炎症药物的研发及生产中，Semaphorin7A的新用途发明具有重要意义；

3、本发明实施例建立了健康Balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的心肌炎动物模型，该模型适合临床应用研究，对于心肌炎的药物研发具有重要的应用推广价值。

实施例3

本发明进一步公开了一种用于治疗心肌炎疾病的药物，其活性成分包括Semaphorin7A抗体。Semaphorin7A抗体为单克隆抗体。其中，Semaphorin7A抗体含量为75-120mg。

该治疗心肌炎疾病的药物还包括药物辅料和药用基质。

具体地，所述药物辅料包括免疫佐剂、稳定剂、防腐剂。

其中稳定剂可选用1％的人白蛋白；在具体实施中，也常选用麦芽糖、葡萄糖、山梨醇等糖类生物制剂稳定剂。

免疫佐剂选用植物油佐剂，具体可选为甘油；

防腐剂为浓度为0.5％的氯仿。

另外，药物制剂还可含有其它通常的辅料物质或添加剂。

本发明实施例中还可以加入抗氧化剂例如谷胱甘肽或者抗坏血酸等物质。

具体地，本发明实施例中包括Semaphorin7A抗体作为活性组分制备药物的基质优选为含有氯化钠的缓冲的抗体溶液。该抗体溶液与含有添加剂糖、氨基酸和表面活性剂的水溶液混合，同时用酸或碱调节pH至5-8。加入适量磷酸或磷酸盐和氯化钠，以使溶液达到先前确定的浓度。然后，过滤除菌，冷冻干燥以这种方式制备的溶液。

10本发明实施例在药用基质中还添加了含有对冷冻敏感抗体的不稳定水溶液通过冷冻干燥的方式转变成稳定的制剂，并且该稳定制剂在高温下亦不变质而保持稳定。在具体实施中，也常选用麦芽糖、葡萄糖、山梨醇等糖类生物制剂稳定剂。

11根据本发明，该冷冻干燥物的另一个优点在于：除了冷冻期间避免抗体损伤之外，即使在50℃下长期储存，该冷冻干燥物的抗体含量不减少，并且没有聚集物形成或不发生絮凝。因此，抗体的含量和纯度，是稳定的。用注射用水再生冷冻干燥物之后，低浊度值显示颗粒物的形成被避免。

优选地，上述治疗心肌炎疾病的药物为注射制剂。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1、本发明实施例给予发病小鼠Semaphorin7A单抗的治疗，能够有效缓解心肌细胞炎症和提高小鼠生存率，在治疗心肌炎疾病具有明显的疗效；

2、本发明实施例公开了Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用；在治疗心肌炎症药物的研发及生产中，Semaphorin7A的新用途发明具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用；所述心肌炎疾病为自身免疫性心肌炎疾病。

2.根据权利要求1所述的Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物除了包括Semaphorin7A抗体，还包括药物辅料和药用基质。

3.根据权利要求1所述的Semaphorin7A抗体在制备用于治疗心肌炎疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物为注射制剂。