CN107950399A

CN107950399A - 一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法

Info

Publication number: CN107950399A
Application number: CN201711459927.1A
Authority: CN
Inventors: 邹雪; 丁凡; 余金龙; 陈年伟; 余韩开宗; 刘丽芳
Original assignee: MIANYANG INSTITUTE OF AGRICULTURE SCIENCES
Current assignee: MIANYANG INSTITUTE OF AGRICULTURE SCIENCES
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-04-24
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN107950399B

Abstract

本发明属于马铃薯品种选育技术领域，公开了一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，利用组培方法将实生种子扩繁成多株试管苗，种植试管苗繁殖F1代薯块并筛选优良株系。主要过程包括实生种子消毒、培养基添加生长调节剂高效解除种子休眠、扩繁试管苗、株系间分行种植、分批收获薯块、催芽处理和秋季大田二次筛选。本发明可及时解除当年收获的实生种子的休眠期，获得高发芽率，使种子尽快得到有效利用；将单粒种子扩繁成10株苗分行播种，使早熟材料得到保护，高效富集优良早熟材料，避免资源丢失；将实生种子先繁试管苗再种植可以有效缩短生育期20‑40d不等，降低感病和遇不利于结薯天气的风险。

Description

一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法

技术领域

本发明属于马铃薯品种选育技术领域，尤其涉及一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法。

背景技术

马铃薯品种选育主要依靠杂交方式获得遗传重组的实生种子，由实生种子播种收获F1代，通过块茎无性繁殖获得无性一代FCY、二代SCY，再作行比、品比和区试等，从中筛选优良材料形成新品种，一般需要10年左右。收获杂交实生种子后，对实生种子的有效利用和早代筛选是加快优良材料选育进程的关键。传统育种方式是将实生种子催芽后直播或苗床育苗移栽于大棚基质中，主要存在以下问题：由于马铃薯实生种子有休眠期，需贮藏1-2年才能利用，当年采收的种子催芽后发芽率仅为50-60％，，这限制了实生种子的及时利用(孙慧生《马铃薯育种学》；蒋瑜,贮藏时间对马铃薯杂交实生籽发芽率的影响.长江蔬菜,2012(2):25-27)。由于马铃薯实生种子小，胚乳能提供给胚生长的营养物质有限，受环境影响大，采用传统方式基质育苗，一般实生种子出苗率低于75％，且幼苗长势弱，移栽过程中的死亡会导致材料损失。早熟材料在早期生长弱，传统的混种方式使其无法与健壮的晚熟材料竞争光照、养分、空间资源，易加剧其死亡，增加丢失重要材料的风险。

此外，马铃薯为长日照植物，即长日照利于开花，但不利于结薯，同时日平均温度超过29℃时，植株呼吸过盛，抑制结薯甚至原本应发育成块茎的匍匐茎伸出地面变为地上植株而不结薯。马铃薯实生苗的生育期长于块茎繁殖，早熟类型为150天，中、晚熟需170-180天。若在西南低海拔地区春季播实生种子，会因5-8月温度高且为长日照，而不利于材料结薯，特别对日照和温度敏感的材料，其匍匐茎不膨大形成块茎而是直接长成新植株，导致材料绝收。因此，在西南地区还需到高海拔地区播实生种子，即传统实生种子直播的方式有地域和季节限制。

综上所述，传统的马铃薯育苗方法因种子有休眠期，胚乳提供的营养少，使得实生种子出苗率低，幼苗长势弱，移栽容易死亡。且因实生苗生育期过长，如遇高温或长日照则不利于结薯，导致无法获得晚熟材料的薯块，所以传统的直接播种实生种子的方法有地域限制，必须在海拔较高的地区以避开生育期间的高温天气。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法。

本发明是这样实现的，一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，所述提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法先通过组织培养技术，将实生种子消毒后播种于营养丰富的MS培养基上，同时添加生长调节剂以高效解除种子休眠，保证种子萌芽并健壮生长。获得组培实生苗后，利用植株腋芽无性扩繁实生苗，使每粒种子达到10株试管苗。按株系分行在大棚基质中栽培试管苗，可缩短生育期20-40d不等，避开后期不利于结薯的天气。多数种子通过此方法均能在西南低海拔地区获得薯块，解除了传统方法中的地域限制，提高了实生种子的利用效率。利用西南地区一年多季生产的特点在秋季二次筛选以尽早锁定潜力株系，提高选择效率。

进一步，所述提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法包括以下步骤：

步骤一，从果实中清洗的实生种子放于1.5mL EP管中，用移液器取75％乙醇处理10-20s，无菌水洗4遍，4％次氯酸钠处理20min，无菌水洗4-5遍，倒入无菌滤纸上吸干多余水份备用；

步骤二，基本培养基为MS，pH 5.9-6.0，121℃20min高温灭菌后在超净台上加入过滤灭菌的生长调节剂6-苄基腺嘌呤和赤霉素，倒平板25mL/皿，待平板凝固冷却后用镊子将种子播于平板上；

步骤三，7-10d实生种子在平板上萌发长出根系和幼苗，幼苗剪下播于瓶装MS培养基中，14d后长成试管苗，分单株扩繁，剪取带1-2个腋芽的试管苗茎段接入MS培养基，每株能扩繁出3-4株；14d后再按单个株系接入1瓶，每瓶10-15株的方式二次扩繁；

步骤四，提前半月将蛭石：椰糠按1:2比例加水混匀，同时加入复合肥50g/m²和腐熟有机肥150g/m²作为基质，畦底铺黑网膜与土壤隔开，上铺基质；

步骤五，待试管苗生长14-20d，移至室外揭盖炼苗1-2d，清洗去掉琼脂，放回带水的原瓶中恢复过夜；第2d栽种，每个株系1行，株距10cm，行距20cm；株系间用长100cm、高20cm塑料板深插入基质中隔开；

步骤六，试管苗移栽后60d可检查植株倒苗及结薯情况并适时收获薯块；

步骤七，将收获的薯块贮藏于3～4℃冷库，8月初配制催芽促结薯溶液：0.24mg/L24-表油菜素内酯+20mg/L赤霉素；每个株系各取大小在10g的薯块10粒，置于溶液中浸泡10min，室内散射光下放置催芽，剩余薯块继续贮藏于3～4℃冷库；薯块在8月底或9月初播种于大田。

进一步，所述步骤二中生长调节剂为MS+0.5mg/L6-BA+1mg/LGA₃+3％蔗糖+0.6％琼脂。

进一步，所述步骤三中培养条件：16h光/8h暗，光强60μmol m^-2s^-1，22±1℃；扩繁同时，各株系剪取1个带芽顶端接入保苗培养基中保存，保苗培养基：MS+2％蔗糖+3％山梨醇+0.7％琼脂，120d转接1次。

进一步，所述步骤四中复合肥维N：P₂O₅：K₂O＝16:9:20。

进一步，所述步骤五中还需盖膜保温保湿，待10-14d新根长出后揭膜。

进一步，所述步骤七中种植方式：1垄双行错窝播种，垄宽80cm，株距25cm，垄距100cm。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法筛选的马铃薯实生种子。

本发明改传统的实生种子直播或育苗移栽为先利用组培方法将实生种子扩繁成多株试管苗，再种植试管苗繁殖F1代薯块并筛选优良株系。主要包括实生种子消毒、培养基添加生长调节剂高效解除种子休眠、适当扩繁试管苗、株系间分行栽培、分批收获薯块、催芽处理和秋季大田二次筛选等多个环节。具有如下优点：

1、本发明可使当年实生种子获得高发芽率(不同组合60～100％，平均87.19％)缩短贮藏时间，使种子尽快得到有效利用。

2、本发明将单粒种子扩繁成10株苗分行播种，使早熟材料得到保护，高效富集优良早熟材料，避免资源丢失；同时还能更准确的评价各株系薯形、皮色、芽眼、熟期等性状。

3、本发明将实生种子先繁试管苗再种植可以有效缩短生育期20-40d不等，降低感病和遇不利于结薯天气的风险。

4、结合西南一年多季生产特点，利用秋季二次筛选，可以提前锁定优质材料，加快育种进程。

本发明在西南低海拔地区春季对实生种子的有效利用率高达95.61％，而传统直播方式最高仅有40％，除了上述优点，还解决了传统方法中存在的地域限制问题。此外，本发明将实生种子对应的试管苗保留，可省去传统育种方法中对选中材料的剥茎尖脱毒过程，加快新材料脱毒种薯的应用进程。

附图说明

图1是本发明实施例提供的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法包括以下步骤：

S101：实生种子消毒处理：将从果实中清洗的实生种子放于1.5mL EP管中(单管不超100粒)，用移液器取75％乙醇处理10-20s，无菌水洗4遍，4％次氯酸钠(NaClO)处理20min，无菌水洗4-5遍，倒入无菌滤纸上吸干多余水份备用；

S102：种子催芽壮苗培养基制备：基本培养基为MS，pH 5.9-6.0，121℃20min高温灭菌后在超净台上加入过滤灭菌的生长调节剂6-苄基腺嘌呤(6-BA)和赤霉素(GA₃)，配方为MS+0.5mg/L6-BA+1mg/L GA₃+3％蔗糖+0.6％琼脂，倒平板约25mL/皿，待平板凝固冷却后用镊子将种子播于平板上；

S103：实生苗扩繁和保存：约7-10d实生种子在平板上萌发长出根系和幼苗，将幼苗剪下播于瓶装MS培养基中，14d后长成试管苗，分单株扩繁，即剪取带1-2个腋芽的试管苗茎段接入MS培养基，每株能扩繁出3-4株；约14d后再按单个株系接入1瓶，每瓶10-15株的方式二次扩繁。培养条件：16h光/8h暗，光强60μmol m^-2s^-1，22±1℃。在扩繁的同时，各株系剪取1个带芽顶端接入保苗培养基中保存，保苗培养基：MS+2％蔗糖+3％山梨醇+0.7％琼脂，120d转接1次；

S104：大棚中的基质准备：提前半月将蛭石：椰糠按1:2比例加水混匀，同时加入复合肥(N：P₂O₅：K₂O＝16:9:20)50g/m²和腐熟有机肥150g/m²作为基质，畦底铺黑网膜与土壤隔开，上铺基质；

S105：试管苗移栽：待试管苗生长14-20d左右，移至室外揭盖炼苗1-2d，清洗去掉琼脂，放回带水的原瓶中恢复过夜。第2d栽种，每个株系1行，株距10cm，行距20cm。株系间用长100cm、高20cm塑料板深插入基质中隔开，防止株系间地下块茎的交错；移栽后还需盖膜保温保湿，待10-14d长出新根后揭膜；

S106：F1代薯块分批收获：试管苗移栽后约60d可开始检查，若有株系的1行植株均开始发黄倒苗，则可以收获该株系的薯块；不同株系间因生育期不同，收薯可从试管苗移栽后60d起持续到130d；

S107：薯块贮藏、催芽秋播作二次筛选：将收获的薯块贮藏于3～4℃冷库，8月初配制催芽促结薯溶液：0.24mg/L 24-表油菜素内酯+20mg/L赤霉素。每个株系各取大小在10g左右的薯块10粒，置于溶液中浸泡10min，于室内散射光下放置催芽，剩余薯块继续贮藏于3～4℃冷库；薯块统一在8月底或9月初播种于大田，种植方式按常规：1垄双行错窝播种，垄宽80cm，株距25cm，垄距100cm；观察植株生长情况，收获无性一代薯块并统计产量、薯形、芽眼和皮色等指标。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：

实生种子消毒处理，消毒处理是整个体系非常关键的环节，若此时出现污染，则实生种子直接废掉。依靠长期的组培经验，对清毒技术的熟练，成功总结出一套实生种子消毒方法：实生种子放于1.5mLEP管中(单管不超100粒)，用移液器取75％乙醇处理10-20s，无菌水洗4遍，4％次氯酸钠(NaClO)处理20min，无菌水洗4-5遍，倒入无菌滤纸上吸干多余水份备用。采用该方法没有出现任何污染，包括第一批处理的14个组合的765粒种子和第二批处理的13个组合488粒种子。

实施例2

当年收种子在催芽壮苗培养基上萌芽生长，马铃薯实生种子有休眠期，当年发芽率仅为50-60％。已知植物生长调节剂赤霉素(GA₃)具有催芽作用，但浓度过高会造成植株徒长；低浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)能促进试管苗生长，而浓度过高会使切口处膨大，抑制根系形成。本发明经过不同浓度配比试验，找到了一种适合当年收马铃薯种子萌芽壮苗的配比，可使种子达到较高萌发率，且促进植株生长。方法包括：配制这两种生长调节剂的母液：6-BA 0.5g/L和GA₃ 1g/L(均扩大1000倍)，在超净台上通过0.22μm孔径的滤膜过滤灭菌后保存于-20℃备用。基本培养基为MS，调节pH 5.9-6.0，121℃20min高温灭菌后在超净台上加入过滤灭菌的6-BA和GA₃，配方为MS+0.5mg/L6-BA+1mg/L GA₃+3％蔗糖+0.6％琼脂，倒平板约25mL/皿，待培养基凝固冷却后用镊子将消毒后的种子播于平板上。培养条件：16h光/8h暗，光强60μmol m^-2s^-1，22±1℃

不同组合间因双亲遗传物质组合差异，会使后代群体的发芽率不同，如表1所示，培养14d后统计发芽率，第一批处理的14个组合中，有3个的发芽率低于70％，其余高于87％，平均高达87.19％；第二批处理的13个组合中，仅1个低于70％，平均发芽率为86.72％。上述实例说明该培养基利于马铃薯种子萌发生长，与常规方法需将种子放置1-2年后使用相比，新方法可缩短贮藏时间，使种子尽快得到有效利用。

表1种子在催芽培养基中的发芽率比较

实施例3

实生苗扩繁，约7-10d实生种子在平板上萌发长出根系和幼苗，将单粒种子的试管苗扩繁到10株：将幼苗剪下播于培养盒(瓶)装MS培养基中，14d后长成试管苗，分单株扩繁，即剪取带1-2个腋芽的试管苗茎段接入MS培养基，每株能扩繁出3-4株。约14d后再按单个株系接入1瓶作二次扩繁。培养条件：16h光/8h暗，光强60μmol m^-2s^-1，22±1℃。

挑选了181粒实生种子长成的实生苗，通过上述方式扩繁，均得到了健壮的试管苗，每个株系10-15株，个别株系超过20株。

实施例4

试管苗移栽和收获F1代薯块，待试管苗生长14-20d左右，移至室外揭盖炼苗1-2d，清洗去掉琼脂，放回带水的原瓶中恢复过夜。第2d栽种，每个株系1行，株距10cm，行距20cm。株系间用长100cm、高20cm塑料板深插入基质中隔开，防止株系间地下块茎的交错。移栽后还需盖膜保温保湿，待10-14d长出新根后揭膜。试管苗移栽后约60d可开始检查，若有株系的1行植株均开始发黄倒苗，则可以收获该株系的薯块。不同株系间因生育期不同，收薯可从试管苗移栽后60d起持续到130d。

种植了14个组合的181个株系的试管苗，同期采用传统方式将发芽后的实生种子播种于基质，播种14个组合的840粒发芽种子，以作比较。50d后，采用本发明移栽试管苗的方式植株生长更快，此时早熟材料已能收获薯块，而直播的种子才出苗。试管苗生长快使得生育期相对传统直播方式缩短20-40d不等，匍匐茎形成时成功避开了5～8月的高温和长日照两大不利于匍匐茎发育成块茎的因素，不同组合的实生种子通过本发明多能收获薯块，有效利用率平均高达95.61％(表2)。传统方式生育期太长，多数中、晚熟材料的匍匐茎形成时遇高温和长日照，导致敏感材料的匍匐茎直接发育成植株而不结薯，此外，早熟材料在早期的长势较弱，与健壮高大的晚熟材料在传统的混种方式下竞争资源，容易使早熟材料死亡而得不到薯块，这些因素使得传统直播方式对种子的有效利用率低，如表2所示没有1个组合的发芽种子最后能100％获得薯块，最高有效利用率仅40.00％，平均仅有26.76％，远低于本发明中的方法。

采用本发明将单粒种子扩繁成10株苗分行播种的方法，使早熟材料得到保护，高效富集优良早熟材料，避免资源丢失；同时中、晚熟材料匍匐茎形成时避开了不利于结薯的气候，也收获大量株系的薯块。

表2实生种子通过两种方式繁F1代薯块对比

实施例5

薯块贮藏、催芽秋播和二次筛选，结合西南一年多季生产特点，在单粒实生种子收获数量可观的薯块后，利用秋季种植部分薯块作二次筛选，提前锁定优良材料，在第二年春季有针对性的扩繁相应种薯，加快育种进程。

将收获的薯块贮藏于3～4℃冷库。因结薯能力不同，各株系收获的薯块数量各有差异，在8月初每个株系各取大小在10g左右的薯块10粒，放于室内(25～30℃)，剩余薯块继续贮藏于冷库。配制催芽促结薯溶液：0.24mg/L 24-表油菜素内酯+20mg/L赤霉素，将各株系选出的薯块置于溶液中浸泡10min，于室内散射光下放置，30d后所有株系的薯块均萌芽，由于各株系块茎休眠期不同，此时不同株系间的芽长不一，从2mm到30mm不等。统一在8月底或9月初播种于大田中。种植方式按常规：1垄双行错窝播种，垄宽80cm，株距25cm，垄距100cm。观察植株生长情况，收获无性一代薯块并统计产量、薯形、芽眼和皮色等指标。

本发明改传统实生种子直播，一年田间一季筛选方式为先培育种子的试管苗并适量扩繁后种植以富集薯块，并一年两季筛选，可有效提高实生种子的利用率和筛选的准确性，加快育种进程。从实生种子消毒、培养基添加生长调节剂解除种子休眠、适当扩繁试管苗、株系间分行栽培、分批收获薯块、催芽处理和秋季大田二次筛选等多个环节，研究开发出一套提高实生种子利用及筛选效率的方法。

本发明避免传统方法易造成早熟材料因前期长势弱而丢失情况，利于获得优质早熟材料；采用试管苗繁薯块可使结薯提前20-40天，降低感病和遇不利天气风险；一年两季筛选以加快获得优质材料；每个株系都能获得足量薯块，不易出现材料丢失情况，并能更为准确的评价该资源薯形、皮色、芽眼、熟期等性状，且由于薯块基数大，易于短时间内通过无性繁殖富集优良材料；通过有性生殖获得的实生种子一般不带病毒，其对应试管苗的保留可省去选中材料剥茎尖脱毒过程，加快新材料脱毒种薯的应用进程。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法利用组培方法将实生种子扩繁成多株试管苗，种植试管苗繁殖F1代薯块并筛选优良株系；包括实生种子消毒、培养基添加生长调节剂高效解除种子休眠、扩繁试管苗、株系间分行栽培、分批收获薯块、催芽处理和秋季大田二次筛选。

2.如权利要求1所述的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法包括以下步骤：

步骤四，提前半月将蛭石：椰糠按1:2比例加水混匀，同时加入复合肥50g/m²和腐熟有机肥150g/m²，畦底铺黑网膜与土壤隔开，上铺基质；

步骤六，试管苗移栽后60d可开始陆续收薯；

步骤七，将收获的薯块贮藏于3～4℃冷库，8月初配制催芽促结薯溶液：0.24mg/L 24-表油菜素内酯+20mg/L赤霉素；每个株系各取大小在10g的薯块10粒，置于溶液中浸泡10min，室内散射光下放置催芽，剩余薯块继续贮藏于3～4℃冷库；薯块在8月底或9月初播种于大田。

3.如权利要求2所述的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述步骤二中生长调节剂为MS+0.5mg/L6-BA+1mg/L GA₃+3％蔗糖+0.6％琼脂。

4.如权利要求2所述的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述步骤三中培养条件：16h光/8h暗，光强60μmol m^-2s^-1，22±1℃；扩繁同时，各株系剪取1个带芽顶端接入保苗培养基中保存，保苗培养基：MS+2％蔗糖+3％山梨醇+0.7％琼脂，120d转接1次。

5.如权利要求2所述的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述步骤四中复合肥为N：P₂O₅：K₂O＝16:9:20。

6.如权利要求2所述的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述步骤五中移栽后还需盖膜保温保湿，待10-14d新根长出后揭膜。

7.如权利要求2所述的提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法，其特征在于，所述步骤七中种植方式：1垄双行错窝播种，垄宽80cm，株距25cm，垄距100cm。

8.一种利用权利要求1～7任意一项所述提高马铃薯实生种子利用及筛选效率的方法筛选的马铃薯实生种子。