CN107937386A - 一种亲油包水固定化微生物载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多孔材料的制备领域，具体涉及一种用于降解溢油的亲油包水固定化微生物载体及其制备方法。固定化微生物的载体选用石墨烯作为基质材料，对基质材料石墨烯进行分子设计使其表面带有羟基、羧基的亲水基团和双键疏水聚合基团，形成了双亲结构，使固定化微生物的载体具有既亲油又亲水的双亲特性，可漂浮于水面，有利于吸附悬浮于水面的溢油，并为微生物的生长提供了必要的阳光、空气和水；同时，双亲结构石墨烯交联亲酯性有机高分子，使载体具有弱极性亲和性，能够与油滴互相吸引定向移动，并快速将有滴吸附在载体表面，吸附力强，不易脱落。使用本发明制备的固定化微生物载体降解溢油，降解率大大提高，对溢油海域的环境修复作用效果好。

Description

一种亲油包水固定化微生物载体及其制备方法
技术领域
本发明属于多孔材料的制备领域，具体涉及一种用于降解溢油的亲油包水固定化微生物载体及其制备方法。
背景技术
海上石油开采、船舶运油，溢油事故越发频繁，溢油污染严重是世界性共同灾难，影响较大的国内有大连湾、蓬莱康菲油田和青岛黄岛溢油事故等，不但造成巨大的经济损失，而且给海洋环境带来难以修复的生态灾难。研究高效清除油污的方法，恢复受污染的生态环境，是各海洋国家、政府和科研部门极为关注的责任。目前使用的主流清理方法是物理法和化学法，二者可以快速清理大部分的溢油，但对于机械法无法清除的海面薄油膜、乳化油和沙滩的残油，以及消油剂被禁止使用的近海岸，生物法体现了无可替代的重要作用。为了减少应用现场与本土微生物产生拮抗作用，本发明研制一种能追踪亲和分散油污的固定化微生物的载体，这种载体能保护石油降解菌在油水界面上快速繁殖、高速高效降解残油。
固定化微生物技术自问世以来，显示出广阔的发展前景。固定化微生物技术是提高海洋溢油残留油降解效率的重要途径。投放到现场的微生物修复产品多为游离态微生物，用于残油处理尚存在一定缺陷，不能解决海水的稀释、风浪的作用而导致石油降解菌流失的问题。而固定化微生物到载体上之后抗干扰和耐受力明显增加。因此，石油降解菌固定化技术具有特殊的技术优势和应用前景。
选择适宜的固定化微生物载体是实现产业化的关键，而载体的好坏又取决于载体的机械强度、寿命和包埋微生物细胞的容量和活性。理想的载体材料具有可生物降解性，廉价、丰富的孔隙为微生物的生长和繁殖提供空间。载体材料也应具有吸油性和悬浮性，悬浮性的载体材料有利于微生物在油水界面繁殖，使微生物更容易与溢油接触。许多载体材料已报道用于修复溢油，然而，寻找既具有吸油性又具有漂浮性的材料并非易事。活性碳是应用最广泛的固定化载体，如公开号CN103923905A、CN103923904A、CN103923903A制备的稻草秸秆基、玉米芯基、花生壳基活性碳载体，制得的修复剂微生物不易泄漏、具有漂浮性，但对溢油的吸附量低；公开号CN104004745A使用海藻酸钙-贻贝壳固定化海洋细菌，具有成本低廉、无毒无害、活力高的等优点，但载体不具有漂浮性；聚乙烯醇作为包埋载体有机械强度高、抗分解能力强、价格低廉等优点，如公开号CN103194437A使用聚乙烯醇-硼酸二次交联完成细菌固定化用于污水处理，降低了固定化过程对细菌的伤害又有效减少粘连和水溶膨胀的问题，但聚乙烯醇不具有漂浮性，不能用于处理海面的油膜。聚氨酯泡沫塑料是一种常用的载体材料，如公开号CN103951039A发明的聚氨酯载体的硝化细菌固定化生物活性填料具有漂浮性，但不易降解、易造成二次污染。
展望高分子科学的发展，有机高分子和无机材料杂化复合技术日益引起人们的关注。运用这种方法所制备的材料兼有有机和无机材料的特性，可以满足实际应用中多种不同需要，其中具有特殊功能团的高分子材料如吸附性能复合高分子载体材料等是人们研究的热点。制备这种具有高吸附性能的载体可以对其表面进行化学修饰从而赋予其表面多种活性功能功能团(如—OH，—COOH，—CHO，—NH2，—SH等)。载体在生物医学、固定化微生物等许多领域显示出强大的生命力。如公开号CN104707577A发明了一种包埋粉末活性炭和碳纳米管的高分子凝胶球的制备工艺，可用于降解废水中的氮、磷、氰等；公开号CN105064005A涉及一种掺杂改性蜂巢石-氧化石墨烯的高效聚乳酸-聚丙烯生物膜复合纤维载体材料及其制备方法，制剂用于水质净化吸附性能好。生物分子或基团亲和配位原理合成的功能高分子载体，疏水性高分子微球由于比表面积大、固定化方式多等优势，可以成为固定化微生物降解溢油污染的理想载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以固定化微生物载体及其制备方法，使用该方法制得的载体的亲油包水属性既可保证其对石油的吸附性能，又可以为细菌的生长繁衍所需必要水分和营养。该载体具有可漂浮性、吸附石油作用力强、降解效率高。
为达到上述目的，本发明采用的技术解决方案是：
一种亲油包水固定化微生物载体，其特征在于，由包括中间体双亲石墨烯、亲酯性高分子溶液和无机硅藻土合成，其中：
中间体双亲石墨烯含有以下组分及各组分的重量配比如下：
亲酯性高分子溶液含有以下组分及各组分的重量配比如下：
亲油包水固定化微生物载体各组分的重量配比如下：
中间体双亲石墨烯 0.5～5份，
亲酯性高分子溶液 5～10份，
无机硅藻土 0.5～5份。
一种亲油包水固定化微生物载体的制备方法，它包括以下步骤：
(1)制备中间体双亲石墨烯
a.羧基化反应
称取1～5份石墨烯放入反应瓶中，加入1～10份浓硝酸浸泡1h进行酸化处理引发羧基基团；
b.酰化反应
酸化后的材料加入1～10份亚硫酰氯进行酰化反应，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，产物用去离子水洗涤至中性；
c.羟基化反应
向反应瓶中加入10～30份乙二醇作为羟基源，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到含羟基的石墨烯，在干燥箱内120℃烘干2h；
d.激发引发基团
继而向反应瓶中加入1～5份2-溴代异丁酰溴作为大分子引发剂用于激发引发基团，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到ATRP反应所需的基团，产物用去离子水反复洗涤至中性，在干燥箱内烘干2h；
e.水解反应
向反应瓶中加入0.5～5份溴化铜和5～15份丙烯酸正丁酯，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，发生水解反应，用去离子水洗涤至中性，在干燥箱内烘干1h；
f.疏水基团聚合反应
水解反应后，向反应瓶中加入5～20份二氯甲烷和0.1～2份三氟乙酸，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，促使含双键疏水性的单体发生聚合，产物使用滤纸过滤，100ml去离子水洗涤,固态物在干燥箱内烘干1h，得到既含有亲油基团又含有亲水基团的双亲石墨烯材料；
(2)制备亲酯性高分子溶液
取一个反应瓶，加入1～5份二乙烯基苯作为交联剂，加入1～10份四氢呋喃作为极性调节剂，再加入0.5～2份水作为致孔剂，最后向反应瓶中加入0.05～2份偶氮二异丁腈作为油溶性偶氮引发剂，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率混合10～30min，得到亲酯性有机高分子溶液；
(3)制备载体混合液
向合成釜中加入步骤(1)得到的含有亲油亲水基团的石墨烯0.5～5份，加入步骤(2)得到的亲酯性有机高分子溶液5～10份，取天然无机硅藻土0.5～5份，将合成釜放置于40℃恒温水浴摇床以120rpm的速度混合20min形成有机高分子和无机材料结合基质的载体混合液；
(4)合成固定化载体
将合成釜放置于真空干燥箱，在120℃条件下恒温干燥12h，得到亲油包水属性的固定化载体；
(5)检测固定化载体的理化性能
检测合成的固定化微生物的载体的比表面积、疏水性、饱和吸油率、缓释吸油率等理化性能。
进一步地，所述的固定化载体降解石油用固定的微生物为泊库岛食烷菌。
进一步地，所述的固定化菌体的方法，具体如下：
以降解石油效果较好的泊库岛食烷菌作为模式菌株，使用2216E培养基用于海生细菌的增菌培养，24℃里恒温培养1～3d，称取10g合成的固定化载体，放入2％的H2O2溶液中浸泡30min，用去离子水洗涤至中性，得到液体培养基；将固定化微生物的载体加入上述已培养1～3d的液体培养基中，继续培养1～3d，滤去培养液，得固定化的泊库岛食烷菌；检测固定化微生物的降解效果。
与现有技术比较，本发明所具有的有益效果是：
本发明固定化微生物的载体基质材料选用石墨烯，对基质材料石墨烯进行分子设计使其表面带有羟基、羧基的亲水基团和双键疏水聚合基团，形成了双亲结构，使固定化微生物的载体具有既亲油又亲水的双亲特性，可漂浮于水面，一方面有利于吸附悬浮于水面的溢油，另一方面为微生物的生长提供了必要的阳光、空气和水；
同时，本发明的固定化微生物载体具有良好的生物相容性，对微生物活细胞没有毒害作用，确保固定化微生物的活性稳定性好；
另外，本发明固定化微生物载体含有双键疏水基团，且交联亲酯性有机高分子，使载体具有弱极性亲和性，能够与油滴互相吸引定向移动，并快速将有滴吸附在载体表面，吸附力强，不易脱落。
本发明的固定化微生物的载体性能良好，其滚动接触角θ接近150°，表现为良好的疏水性，适合作为固定化微生物载体；其比表面达到1132.43m2/g，对弱极性的石油吸附性强，饱和吸油率达到27.31g/g、缓释吸油率大于91.82％。
使用本发明制备的固定化微生物载体降解溢油，石油的降解率得到了很大的提高，游离态微生物12h对原油的降解率为17.87％，固定化微生物12h对原油的降解率为38.01％，本发明的载体有利于发挥微生物对溢油海域的环境修复作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明制备方法的流程图；
图2是本发明实施例1中的水滴在固定化微生物载体表面的滚动接触角照片；
图3是本发明实施例1中固定化微生物载体与溢油相互吸引吸附的效应测试效果图；
图4是本发明实施例1中的固定化泊库岛食烷菌的电镜扫描效果图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的技术方案作进一步具体说明。
实施例1
如图1所示，本实施例中亲油包水固定化微生物载体的制备方法，它包括以下步骤：
(1)制备中间体双亲石墨烯
a.羧基化反应
称取2.0g石墨烯放入到100ml具塞三角瓶中，加入5.0ml浓硝酸浸泡1h进行酸化处理引发羧基基团；
b.酰化反应
酸化后的材料加入8.0g亚硫酰氯进行酰化反应，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，产物用去离子水洗涤至中性；
c.羟基化反应
往三角瓶中加入25ml乙二醇作为羟基源，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到含羟基的石墨烯，在干燥箱内120℃烘干2h；
d.激发引发基团
继而向三角瓶中加入1ml 2-溴代异丁酰溴作为大分子引发剂用于激发引发基团，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到ATRP反应所需的基团，产物用去离子水反复洗涤至中性，在干燥箱内120℃烘干2h；
e.水解反应
向三角瓶中加入0.6g溴化铜和10ml丙烯酸正丁酯，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，发生水解反应，用去离子水洗涤至中性，在干燥箱内120℃烘干1h；
f.疏水基团聚合反应
水解反应后，向反应瓶中加入10ml二氯甲烷和0.5ml三氟乙酸，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，促使含双键疏水性的单体发生聚合，产物使用滤纸过滤，100ml去离子水洗涤,固态物在干燥箱内120℃烘干1h，得到既含有亲油基团又含有亲水基团的双亲石墨烯材料；
(2)制备亲酯性高分子溶液
取一个50ml具塞三角瓶，加入1.5ml二乙烯基苯作为交联剂，加入5.0ml四氢呋喃作为极性调节剂，再加入0.5ml的水作为致孔剂，最后向三角瓶中加入0.06g偶氮二异丁腈作为油溶性偶氮引发剂，将三角瓶放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率混合20min，得到亲酯性有机高分子溶液；
(3)制备载体混合液
取一支50ml合成釜,加入步骤(1)得到的含有亲油包水基团的羟基化石墨烯0.8g，加入步骤(2)得到的7.0ml亲酯性有机高分子溶液，取0.5g天然无机硅藻土，将合成釜放置于40℃恒温水浴摇床以120rpm的速度混合20min形成有机高分子和无机材料结合基质的载体混合液；
(4)合成固定化载体
将合成釜放置于真空干燥箱，在120℃条件下恒温干燥12h，得到亲油包水属性的固定化载体；
(5)检测固定化载体的理化性能
检测合成的固定化微生物的载体的比表面积、疏水性、饱和吸油率、缓释吸油率等理化性能，检测结果数据见表1。
表1固定化载体的理化性能测试表
滚动接触角θ 比表面积 饱和吸油率 缓释吸油率
133.4° 1132.43m2/g 27.31g/g 94.86％
如图2所示，测试亲油包水载体材料的滚动接触角θ为133.4°，表现为高疏水性；如图3所示，载体的比表面积为1132.43m2/g，载体对弱极性的石油吸附性强，饱和吸油率为27.31g/g，缓释吸油率94.86％，载体与溢油通过范德华力相互作用；
(6)固定化菌体
以降解石油效果较好的泊库岛食烷菌作为模式菌株，使用2216E培养基用于海生细菌的增菌培养，24℃里恒温培养2d，称取10g步骤(4)合成的固定化微生物载体，放入2％的H2O2溶液中浸泡30min，用去离子水洗涤至中性，得到液体培养基；
将步骤(4)合成的固定化微生物载体加入上述已培养2d的液体培养基中，继续培养1d，滤去培养液，得固定化的泊库岛食烷菌；
(7)检测固定化微生物的降解效果。
载体加载细菌电镜扫描效果如图4所示，菌株生长旺盛，检测固定化微生物对原油的降解效果表明，游离态微生物12h对原油的降解率为17.87％，固定化微生物12h对原油的降解率为38.01％。
实施例2
参考图1，本实施例中亲油包水固定化微生物载体的制备方法，它包括以下步骤：
(1)制备中间体双亲石墨烯
a.羧基化反应
称取2.0g石墨烯放入到100ml具塞三角瓶中，加入8.0ml浓硝酸浸泡1h进行酸化处理引发羧基基团；
b.酰化反应
酸化后的材料加入2.0g亚硫酰氯进行酰化反应，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，产物用去离子水洗涤至中性；
c.羟基化反应
往三角瓶中加入25ml乙二醇作为羟基源，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到含羟基的石墨烯，在干燥箱内120℃烘干2h；
d.激发引发基团
继而向三角瓶中加入1ml 2-溴代异丁酰溴作为大分子引发剂用于激发引发基团，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到ATRP反应所需的基团，产物用去离子水反复洗涤至中性，在干燥箱内120℃烘干2h；
e.水解反应
向三角瓶中加入0.5g溴化铜和8ml丙烯酸正丁酯，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，发生水解反应，用去离子水洗涤至中性，在干燥箱内120℃烘干1h；
f.疏水基团聚合反应
水解反应后，向反应瓶中加入8ml二氯甲烷和0.2ml三氟乙酸，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，促使含双键疏水性的单体发生聚合，产物使用滤纸过滤，100ml去离子水洗涤,固态物在干燥箱内120℃烘干1h，得到既含有亲油基团又含有亲水基团的双亲石墨烯材料；
(2)制备亲酯性高分子溶液
取一个50ml具塞三角瓶，加入1.0ml二乙烯基苯作为交联剂，加入4.0ml四氢呋喃作为极性调节剂，再加入0.5ml的水作为致孔剂，最后向三角瓶中加入0.03g偶氮二异丁腈作为油溶性偶氮引发剂，将三角瓶放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率混合20min，得到亲酯性有机高分子溶液；
(3)制备载体混合液
取一支50ml合成釜,加入步骤(1)得到的含有亲油包水基团的羟基化石墨烯1.0g，加入步骤(2)得到的亲酯性有机高分子溶液6.0ml，取0.8g天然无机硅藻土，将合成釜放置于40℃恒温水浴摇床以120rpm的速度混合20min形成有机高分子和无机材料结合基质的载体混合液；
(4)合成固定化载体
将合成釜放置于真空干燥箱，在120℃条件下恒温干燥12h，得到亲油包水属性的固定化载体；
(5)检测固定化载体的理化性能
检测合成的固定化微生物的载体的比表面积、疏水性、饱和吸油率、缓释吸油率等理化性能，检测结果数据见表2。
表2固定化载体的理化性能测试表
滚动接触角θ 比表面积 饱和吸油率 缓释吸油率
141.7° 954.36m2/g 21.53g/g 91.67％
(6)固定化菌体
以降解石油效果较好的泊库岛食烷菌作为模式菌株，使用2216E培养基用于海生细菌的增菌培养，24℃里恒温培养2d，称取10g步骤(4)合成的固定化微生物载体，放入2％的H2O2溶液中浸泡30min，用去离子水洗涤至中性，得到液体培养基；
将步骤(4)合成的固定化微生物载体加入上述已培养2d的液体培养基中，继续培养1d，滤去培养液，得固定化的泊库岛食烷菌；
(7)检测固定化微生物的降解效果。
菌株生长旺盛，检测固定化微生物对原油的降解效果表明，游离态微生物6h对原油的降解率为13.87％，固定化微生物6h对原油的降解率为34.25％。
实施例3
参照附图1，本实施例中亲油包水固定化微生物载体的制备方法，它包括以下步骤：
(1)制备中间体双亲石墨烯
a.羧基化反应
称取2.0g石墨烯放入到100ml具塞三角瓶中，加入,10.0ml浓硝酸浸泡1h进行酸化处理引发羧基基团；
b.酰化反应
酸化后的材料加入10.0g亚硫酰氯进行酰化反应，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，产物用去离子水洗涤至中性；
c.羟基化反应
往三角瓶中加入30ml乙二醇作为羟基源，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到含羟基的石墨烯，在干燥箱内120℃烘干2h；
d.激发引发基团
继而向三角瓶中加入1.5ml 2-溴代异丁酰溴作为大分子引发剂用于激发引发基团，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到ATRP反应所需的基团，产物用去离子水反复洗涤至中性，在干燥箱内120℃烘干2h；
e.水解反应
向三角瓶中加入1.0g溴化铜和15ml丙烯酸正丁酯，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，发生水解反应，用去离子水洗涤至中性，在干燥箱内120℃烘干1h；
f.疏水基团聚合反应
水解反应后，向反应瓶中加入15ml二氯甲烷和1.5ml三氟乙酸，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，促使含双键疏水性的单体发生聚合，产物使用滤纸过滤，100ml去离子水洗涤,固态物在干燥箱内120℃烘干1h，得到既含有亲油基团又含有亲水基团的双亲石墨烯材料；
(2)制备亲酯性高分子溶液
取一个50ml具塞三角瓶，加入1.0ml二乙烯基苯作为交联剂，加入6.0ml四氢呋喃作为极性调节剂，再加入1.0ml的水作为致孔剂，最后向三角瓶中加入0.02g偶氮二异丁腈作为油溶性偶氮引发剂，将三角瓶放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率混合20min，得到亲酯性有机高分子溶液；
(3)制备载体混合液
取一支50ml合成釜,加入步骤(1)得到的含有亲油包水基团的羟基化石墨烯1.0g，加入步骤(2)得到的亲酯性有机高分子溶液10.0ml，取1.0g天然无机硅藻土，将合成釜放置于40℃恒温水浴摇床以120rpm的速度混合20min形成有机高分子和无机材料结合基质的载体混合液；
(4)合成固定化载体
将合成釜放置于真空干燥箱，在120℃条件下恒温干燥12h，得到亲油包水属性的固定化载体；
(5)检测固定化载体的理化性能
检测合成的固定化微生物的载体的比表面积、疏水性、饱和吸油率、缓释吸油率等理化性能，检测结果数据见表3。
表3固定化载体的理化性能测试表
滚动接触角θ 比表面积 饱和吸油率 缓释吸油率
151.8° 854.2m2/g 14.46g/g 91.82％
(6)固定化菌体
以降解石油效果较好的泊库岛食烷菌作为模式菌株，使用2216E培养基用于海生细菌的增菌培养，24℃里恒温培养2d，称取10g步骤(4)合成的固定化微生物载体，放入2％的H2O2溶液中浸泡30min，用去离子水洗涤至中性，得到液体培养基；
将步骤(4)合成的固定化微生物载体加入上述已培养2d的液体培养基中，继续培养1d，滤去培养液，得固定化的泊库岛食烷菌；
(7)检测固定化微生物的降解效果。
菌株生长旺盛，检测固定化微生物对原油的降解效果表明，游离态微生物12h对原油的降解率为17.87％，固定化微生物12h对原油的降解率为33.76％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种亲油包水固定化微生物载体，其特征在于，由包括中间体双亲石墨烯、亲酯性高分子溶液和无机硅藻土合成，其中：
中间体双亲石墨烯含有以下组分及各组分的重量配比如下：
亲酯性高分子溶液含有以下组分及各组分的重量配比如下：
亲油包水固定化微生物载体各组分的重量配比如下：
中间体双亲石墨烯 0.5～5份，
亲酯性高分子溶液 5～10份，
无机硅藻土 0.5～5份。
2.一种亲油包水固定化微生物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备中间体双亲石墨烯
a.羧基化反应
称取1～5份石墨烯放入反应瓶中，加入1～10份浓硝酸浸泡1h进行酸化处理引发羧基基团；
b.酰化反应
酸化后的材料加入1～10份亚硫酰氯进行酰化反应，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，产物用去离子水洗涤至中性；
c.羟基化反应
向反应瓶中加入10～30份乙二醇作为羟基源，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到含羟基的石墨烯，在干燥箱内120℃烘干2h；
d.激发引发基团
继而向反应瓶中加入1～5份2-溴代异丁酰溴作为大分子引发剂用于激发引发基团，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，得到ATRP反应所需的基团，产物用去离子水反复洗涤至中性，在干燥箱内烘干2h；
e.水解反应
向反应瓶中加入0.5～5份溴化铜和5～15份丙烯酸正丁酯，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，发生水解反应，用去离子水洗涤至中性，在干燥箱内烘干1h；
f.疏水基团聚合反应
水解反应后，向反应瓶中加入5～20份二氯甲烷和0.1～2份三氟乙酸，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率反应1h，促使含双键疏水性的单体发生聚合，产物使用滤纸过滤，100ml去离子水洗涤,固态物在干燥箱内烘干1h，得到既含有亲油基团又含有亲水基团的双亲石墨烯材料；
(2)制备亲酯性高分子溶液
取一个反应瓶，加入1～5份二乙烯基苯作为交联剂，加入1～10份四氢呋喃作为极性调节剂，再加入0.5～2份水作为致孔剂，最后向反应瓶中加入0.05～2份偶氮二异丁腈作为油溶性偶氮引发剂，放置于40℃恒温水浴摇床上以120rpm的速率混合10～30min，得到亲酯性有机高分子溶液；
(3)制备载体混合液
向合成釜中加入步骤(1)得到的含有亲油亲水基团的石墨烯0.5～5份，加入步骤(2)得到的亲酯性有机高分子溶液5～10份，取天然无机硅藻土0.5～5份，将合成釜放置于40℃恒温水浴摇床以120rpm的速度混合20min形成有机高分子和无机材料结合基质的载体混合液；
(4)合成固定化载体
将合成釜放置于真空干燥箱，在120℃条件下恒温干燥12h，得到亲油包水属性的固定化载体；
(5)检测固定化载体的理化性能
检测合成的固定化微生物的载体的比表面积、疏水性、饱和吸油率、缓释吸油率等理化性能。
3.根据权利要求2所述的一种亲油包水固定化微生物载体的制备方法，其特征在于，所述的固定化载体降解石油用固定的微生物为泊库岛食烷菌。
4.根据权利要求3所述的一种亲油包水固定化微生物载体的制备方法，其特征在于，所述的固定化菌体的方法，具体如下：
以降解石油效果较好的泊库岛食烷菌作为模式菌株，使用2216 E培养基用于海生细菌的增菌培养，24℃里恒温培养1～3d，称取10g合成的固定化载体，放入2％的H2O2溶液中浸泡30min，用去离子水洗涤至中性，得到液体培养基；
将固定化微生物的载体加入上述已培养1～3d的液体培养基中，继续培养1～3d，滤去培养液，得固定化的泊库岛食烷菌；
检测固定化微生物的降解效果。
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