CN107921132A - 糖尿病和igfbp3/tmem219轴抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及糖尿病的发生中IGFBP3/TMEM219轴的作用，以及IGFBP3/TMEM219轴抑制剂用于治疗和/或预防糖尿病的相关应用。本发明还涉及鉴定有患1型和/或2型糖尿病风险的对象的方法和相关试剂盒。

Description

糖尿病和IGFBP3/TMEM219轴抑制剂
技术领域
本发明涉及糖尿病的发生中IGFBP3/TMEM219轴的作用，以及IGFBP3/TMEM219轴抑制剂用于治疗和/或预防糖尿病的相关应用。本发明还涉及鉴定有患1型和/或2型糖尿病风险的对象的方法和相关试剂盒。
背景技术
胃肠病症，包括胃轻瘫，腹胀，肠易激综合征和大便失禁，常见于患有1型糖尿病(T1D)的个体之中(1993)。事实上，高达80％的患有长期T1D的个体表现出肠道症状，而这些个体通常受到包括末期肾病(ESRD)在内的多种糖尿病并发症的影响(1993；Atkinson等,2013；Fiorina等,2001)。这些被称为糖尿病肠病(DE)的胃肠症状的出现极大地降低了生活质量(1993；Atkinson等,2013；Camilleri,2007；Talley等,2001)，并且在很大程度上具有未知的发病机理(Feldman和Schiller,1983)。临床前研究显示，糖尿病啮齿动物中肠粘膜形态的明显紊乱(Domenech等,2011；Zhao等,2003)，这表明T1D肠内稳定可能被改变；然而，在人中的数据较少。肠上皮细胞通过肠干细胞和其小生境(niche)维持，其响应生理压力和环境损伤(Barker,2014；Medema和Vermeulen,2011)。位于大肠的隐窝基部(crypt base)并表达肝脏配蛋白B受体2(EphB2)，包含富亮氨酸重复的G蛋白偶联的受体5(LGR5)、h-TERT和醛脱氢酶(Aldh)，以及其它标志物的结肠干细胞(CoSC)(Carlone和Breault,2012；Carpentino等,2009；Jung等et al.,2011；Sato和Clevers,2013)与局部微环境构成CoSC小生境(van der Flier和Clevers,2009；Zeki等,2011)。最近的研究已经建立了一些条件，其概括肠道内稳态的多种特征并在体外生成正常的自我更新的大型隐窝类器官(cryptorganoid)，或所谓的“迷你肠道(mini-gut)”(Sato和Clevers,2013)。而如循环激素的全身性因素能否用来控制CoSC仍待建立(Sato和Clevers,2013)。
胃肠病症，特别是糖尿病肠病的治疗包括对于腹泻、腹痛、便秘和消化不良的对症药物和缓解药物。迄今为止，尚不存在对于糖尿病肠病的特效治疗。
胃肠病症，特别是糖尿病肠病的诊断包括：结肠内窥镜检查、胃内窥镜检查、肛门直肠测压、食管测压和粪便样品分析、外周癌症标志物(即，CEA、Ca 19.9、α-甲胎蛋白、Ca125)的评价和腹腔标志物的评价。前述所有方法都无法提供糖尿病肠病的特定诊断。
WO 2011133886和WO2007024715公开了一种IGFBP3结合抗体形式的治疗性复合物。
WO0187238涉及一种抗癌药物组合物，其包括治疗有效的TMEM219，特别是对于结肠癌的治疗。
WO 2014089262公开了IGFBP3作为慢性炎症(肥胖)病症诊断标志物的应用(特别是炎症性肠道疾病，如UC和克罗恩氏病和结肠癌)。
US6066464涉及一种免疫试验，用于在固体支持物上检测IGFBP3，所述固体支持物是纸。
WO2013152989涉及IGFBP3作为结直肠癌生物标志物的应用。
WO0153837公开了一种检测或诊断这样疾病病症的方法，所述疾病病症涉及测量肿瘤标志物和IGF轴的至少一个成分的组合。IGFBP3被提出作为结肠肿瘤的标志物。
1型糖尿病(T1D)历来被认为是T细胞介导的自身免疫疾病，导致产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏(Bluestone等,2010；Eisenbarth,1986)。根据这一观点，启动因子触发针对自身抗原的免疫应答，并且随后新激活的自身反应性T细胞靶向并进一步破坏胰岛和产生胰岛素的β细胞(Bluestone等,2010)。β细胞的破坏是否完全由自身免疫攻击所决定，又或者其它机制，如旁分泌调节、代谢失调、非免疫β细胞凋亡和停止的β细胞生成是否导致T1D发病是目前讨论的焦点(Atkinson和Chervonsky,2012；Atkinson等,2015)。近来，已经观察到，T1D中启动自身免疫应答需要环境因素，特别是病毒感染(Filippi和von Herrath,2008)，并且肠道微生物群作用的研究显示，肠道病毒参与激活自身活化T细胞(McLean等,2015)。正在进行的研究也集中在其它环境风险因素，如饮食、新生儿暴露于牛奶和麸质、和断奶年龄，这些表明研究T1D发病机理的新方法正在逐渐出现(McLean等,2015)，因此，遗传因素将不再被认为是TID的唯一决定因素(Alper等,2006)’(Oilinki等,2012)。
此外，免疫治疗策略的功效，这一在过去数十年间被认为是建立T1D治愈的主要希望，现如今备受质疑(Ben Nasr等,2015a)。尽管在啮齿动物中使用免疫抑制治疗或促调节方案靶向免疫应答被证明是令人满意的，但是这样的策略相反在少得可怜的T1D个体中实现了胰岛素独立(Atkinson等,2015)。除了强调动物模型和人之间的区别，这些数据还揭示了这样事实，即免疫应答的调查研究主要检验发生在外周的免疫事件，但是对于发生在胰岛中，特别是β细胞中的疾病过程知之甚少。就此而言，发现涉及启动/促进T1D中β细胞消亡的新因素将会具有重要价值。这样的发现可以为能够停止或延缓疾病第一阶段的新型的治疗方法铺平道路。并且，还需要对于T1D和T2D的替代性治疗。
WO2008153788要求抑制或降低IGFBP3水平以治疗胰岛素抗性或TD2的方法，其中，所述抑制剂是与IGFBP3mRNA互补的核酸或结合IGFBP3的抗体，抗IGFBP-3。但是该文件并未提及IGFBP3/TMEM219轴。
Muzumdar等(Muzumdar等,2006)公开了IGFBP3通过导致外周葡萄糖摄取降低的中心机制作为胰岛素拮抗剂。但是该文件并未公开IGFBP3/TMEM219轴的抑制。
WO9739032要求保护IGFBP3抑制剂治疗糖尿病的应用，其中所述抑制剂防止IGFBP-3结合IGF-1。但是其并没有考虑IGFBP3/TMEM219轴的抑制。
D’Addio等,(2015)指出eco-TEM219使循环IGF-I/IGFBP3水平标准化。
WO2007024715涉及工程改造的多价和多特异性结合蛋白的应用，即称为双重可变结构域免疫球蛋白，其使用单一中等接头结合两个不同的抗原或目标肽，并且其是双特异性的。该文件在众多靶蛋白之中提到IGFBP3与家族的其它成员组合。
WO2011133886涉及这样一种方法，其生成能够特异性地结合超过一个靶标的抗体和其它多聚化蛋白质复合物，即异源多聚化蛋白质。IGFBP3可以代表一个潜在的靶标。
发明内容
尚不明确全身性因素是否用于控制结肠上皮组织和结肠干细胞(CoSC)的稳态。发明人假设循环的“激素”二分体(dyad)控制CoSC，并且在导致糖尿病肠病(DE)的长期1型糖尿病(T1D)中被破坏。患有长期T1D的个体表现出肠粘膜和CoSC的异常，并且无法体外生成迷你肠道。血清蛋白质组学概况显示在长期T1D个体中改变的胰岛素样生长因子1(IGF-1)和其结合蛋白-3(IGFBP3)的循环水平，以及高血糖介导的IGFBP3的肝脏释放增加的证据。IGFBP3通过TMEM219-依赖性/胱天蛋白酶-介导的IGF-I-非依赖性作用防止体外迷你肠道生长，并且在临床前模型体内破坏CoSC。糖尿病小鼠中长期T1D中正常血糖的恢复，以及进行肾脏-胰腺移植，并用外-TMEM219(ecto-TMEM219)重组蛋白治疗，通过恢复适当的IGF-I/IGFBP3循环水平重建CoSC。外周IGF-I/IGFBP3二分体控制CoSC，并且在DE中功能失调。
本文中，发明人证明了患有长期T1D和DE的个体具有改变的CoSC，并且表现出增加的IGFBP3水平。在DE的临床前模型中。通过淬火循环IGF-I以及通过运用TMEM219-依赖性/胱天蛋白酶-介导的对CoSC的毒性作用，IGFBP3的给予改变CoSC再生性质以及体外和体内黏膜形态。最终，根据IGFBP3受体(TMEM219)的胞外结构域生成新的外-TMEM219重组蛋白。外-TMEM219淬灭(quench)外周IGFBP3，并且防止其结合IGFBP3受体，TMEM219。然后，用如外-TMEM219重组蛋白靶向IGFBP3，表达在CoSC，消除IGFBP3体外和体内的不良影响。
本发明报道了令人信服的数据，其显示了在对T1D和T2D高风险的个体中IGFBP3释放的增加。有趣的是，发明人发现IGFBP3受体——TMEM219表达在β细胞系中和小鼠/人胰岛上，并且其由IGFBP连接对β细胞是毒性的，引起内源性β细胞毒素存在的可能性。这表明β细胞毒素[β毒素]可能涉及TD1的致病机理，特别是在早期中，当胰岛/β细胞损伤可能促进自身抗原暴露于免疫细胞，因此产生局部发炎的环境和持续的免疫反应。有趣的是，作者已经观察到前-T2D以及T2D个体中IGFBP3水平的增加，这表明该轴的潜在作用在T2D中也很明显。
发明人还观察到IGFBP3可以在体外以胱天蛋白酶8-依赖性的方式诱导β细胞和鼠/人胰岛的细胞凋亡。最终，新生成的外-TMEM219蛋白，根据TMEM219胞外结构域，能够淬灭IGFBP3，防止其通过胰腺β细胞上的TMEM219信号转导。外-TMEM219治疗在糖尿病(T1D和T2D)的鼠模型中体内降低β细胞消亡，改善胰岛胰岛素含量和糖代谢控制，而在体外，其保护胰岛和β细胞避免IGFBP3-诱导的细胞凋亡。发明人证明IGFBP3是内源性外周β细胞毒素(或β毒素)，其在对于糖尿病(T1D和T2D)高风险的个体中渐增地释放。IGFBP3受体(TMEM219)在β细胞上的伴随表达开启/促进β细胞死亡，因此有助于糖尿病发生/发展。
换言之，本发明基于TMEM219在胰腺胰岛和β细胞上表达这一发现，其中所述TMEM219是介导IGFBP3/IGF1独立型有害效应的IGFBP3受体；此外，用外-TMEM219靶向IGFBP3/TMEM219轴在糖尿病小鼠中重建适当的IGFBP3信号转导并防止β细胞消亡，并且保持胰岛形态，从而证实IGFBP3/TMEM219轴在糖尿病中有利于β细胞消亡的重要作用。
基于IGFBP3/TMEM219轴的抑制，本公开的治疗方法可以克服当前T1D和T2D治疗的局限性，因为其可以防止β细胞受损，并且随后降低或消除导致糖尿病发展的胰岛素分泌。
因此，本发明优于现有技术治疗方法的优势是：
-防止β细胞和胰岛破坏
-保护β细胞群和产生胰岛素的细胞
-防止主要糖尿病并发症
-限制T1D中自身免疫进攻胰腺胰岛。
-防止T2D中胰岛素抗性，和
-T1D中不需要免疫治疗。
其次，本发明提供了IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂，用于治疗和/或预防对象的糖尿病。
所述抑制剂优选选自：
a)多肽；
b)编码所述多肽的多核苷酸，或能够抑制IGFBP3/TMEM219轴的多核苷酸；
c)包括或表达所述多核苷酸的载体；
d)宿主细胞，经遗传工程改造表达所述多肽或所述多核苷酸；
e)小分子；
f)肽、蛋白质、抗体、反义寡核苷酸、siRNA、反义表达载体或重组病毒或能够抑制或IGFBP3/TMEM219轴的任何其它试剂。
所述抑制剂优选受体TMEM219或其片段。
优选地，TMEM219的片段是包括TMEM219胞外结构域的片段。
在一个优选实施方式中，抑制剂是外-TMEM219。优选抑制剂是可溶的。
所述抑制剂优选是融合蛋白TMEM219-Ig，优选所述融合蛋白淬灭循环IGFBP3，并防止其结合TMEM219。
抑制剂优选是抗-IGFBP3抗体，所述抗体优选选择性阻断TMEM219结合位点。
所述抑制剂优选是抗-TMEM219抗体，所述抗体优选占据TMEM219受体的IGFBP3结合位点，因此防止IGFBP3结合。
更优选地，所述抑制剂是与IGFBP3mRNA互补的寡核苷酸。
在一个优选实施方式中，糖尿病是1型或2型糖尿病。
更优选地，对象选自：处于发生1型和/或2型糖尿病的对象，患有早期1型和/或2型糖尿病的对象。
本发明还提供了药物组合物，用于糖尿病的治疗和/或预防，其包括本发明的抑制剂和药学上可接受的运载体。药物组合物优选还包括治疗剂。
治疗剂优选选自：任何形式的胰岛素，普兰林肽(Pramlintide(Symlin))，血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)，阿司匹林，降胆固醇药物。二甲双胍(库鲁化锭(Glucophage)，Glumetza，其它)，磺酰脲(格列本脲(达安疗(DiaBeta)，Glynase)，格列吡嗪(格列吡嗪(Glucotrol))和格列美脲(亚莫利(Amaryl))，氯茴苯酸(例如，瑞格列奈(Prandin)和那格列奈(Starlix))，噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮(Avandia)和吡格列酮(艾可拓(Actos)))，DPP-4抑制剂(西他列汀(Januvia)，沙格列汀(安立泽(Onglyza))和利拉利汀(Tradjenta))，GLP-1受体激动剂(艾塞那肽(百泌达(Byetta))和利拉鲁肽(诺和力))，SGLT2抑制剂，实例包括卡格列净(卡格列净(Invokana))和达格列净(Farxiga)。
本发明还提供了鉴定有患1型和/或2型糖尿病风险的对象或在对象中监测对治疗处理的应答的方法，其包括：
a)测量获自对象的生物样品中蛋白质IGFBP3的量或编码所述蛋白的多核苷酸的量。
b)将测量的蛋白质IGFBP3量或测量的编码所述蛋白质的多核苷酸的量与对照量进行比较，其中如果测量的量高于对照量，那么对象处于发生1型和/或2型糖尿病的风险中。
优选地，通过抗体测量IGFBP3量。
更优选地，生物样品选自：血清、尿、细胞培养物上清液。
本发明还提供了这样的试剂盒，其中包括测量蛋白质IGFBP3量的手段，和/或测量编码所述蛋白质的多核苷酸量的手段，并且任选地，用于本发明的方法中的对照手段。
在本发明中，抑制GFBP3/TMEM219轴指阻断IGFBP3结合TMEM219，例如，通过由循环淬灭IGFBP3，其还指阻断TMEM219的结合IGFBP3的位点，阻断TMEM219上的IGFBP3结合位点。其还指抑制TMEM219功能和/或表达和/或信号转导，例如，这可以通过沉默TMEM219表达实现，特别是用SiRNA或寡核苷酸。其还指抑制IGFBP3的功能和/或表达。
根据本发明，结合TMEM219的IGFBP3的抑制剂可以是如下分子中的一种：
●可溶性外-TMEM219(TMEM219的胞外部分)，其中和循环IGFBP3；
●融合蛋白TMEM219-Ig，基于Fc的融合蛋白，包括直接连接TMEM219肽或其胞外部分的免疫球蛋白Fc结构域，其淬灭循环IGFBP3并且防止其结合表达在β细胞上的TMEM219；
●抗-IGFBP3抗体，其选择性地阻断TMEM219结合位点；
●抗-TMEM219抗体，其占据TMEM219受体的IGFBP3结合位点，因此防止IGFBP3结合(相对于IGFBP3，具有拮抗活性)；
●与IGFBP3 mRNA互补的寡核苷酸。
在本发明中，可以进行治疗的患者是这样的个体，所述个体处于发生T1D(自身免疫糖尿病，基于出现外周抗-胰岛自身抗体或遗传易感性或相似的易感性或改变的β细胞功能)或T2D(非自身免疫糖尿病，基于受损的空腹葡萄糖和/或受损的葡萄糖耐受的证据，没有达到诊断糖尿病的标准)的风险，或发生任何疾病阶段的T1D或T2D，特别是具有早期1型和/或2型糖尿病的对象，目的在于保护β细胞避免进一步的破坏。存在各种程度的保存的β细胞是评估成功的治疗的唯一要求。
IGFBP3的表达可以通过这些手段进行测量：对组织和细胞的RT-PCR，对组织和细胞的Western印迹，对组织的免疫组织化学，对组织和细胞的免疫荧光。生物流体中的IGFBP3水平可以通过免疫靶向的试验和蛋白质组学分析进行测量。
IGFBP3的功能可以通过这些手段进行测量：使用RT-PCR检测靶细胞上胱天蛋白酶8和9表达，微阵列，通过共培养靶细胞/结构与全胱天蛋白酶抑制剂，胱天蛋白酶8和9抑制剂，并且测量活细胞/结构。
在本发明中，“抑制或阻断IGFBP3与其受体TMEM219的相互作用”指淬灭循环IGFBP3并阻止其结合表达在胰腺胰岛和β细胞上的TMEM219受体。还可以通过使用IGFBP3-阻断抗体防止IGFBP3-TMEM219结合。此外，TMEM219阻断抗体可以结合TMEM219受体，因此当IGFBP3来自该循环之时，使得该受体无效。
本发明的抑制剂可以是受体TMEM219(MGNCQAGHNLHLCLAHHPPLVCATLILLLLGLSGLGLGSFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSRLLVLGSFLLLFCGLLCCVTAMCFHPRRESHWSRTRL，SEQ ID No.1)或其片段。
具体而言，TMEM219的片段被设计成阻断/防止IGFBP3接触和/或结合TMEM219，其具有较小的分子量，其包含形成二硫键桥和球状结构的五个半胱氨酸。片段优选至少50个氨基酸长度，优选100个氨基酸长度，更优选120个氨基酸长度，同样优选150个氨基酸长度，优选至少160个氨基酸长度。
在一个优选实施方式中，片段是至少162、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235个氨基酸长度。片段优选与TMEM219的序列有至少65％同一性，优选与TMEM219的序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性。
优选地，TMEM219的片段是TMEM219(外-TMEM219)的胞外结构域的片段，具体而言，片段包括下述序列：
THRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR(SEQ ID No.2)。
优选地，TMEM219的片段是TMEM219的胞外结构域，具体而言，片段包括下述序列：
SFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR(SEQ ID No.3)。
优选地，TMEM219的片段由以下组成：
THRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR(SEQ ID No.2)。
优选地，TMEM219的片段由以下组成：
SFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR(SEQ ID No.3)。
在本发明中，TMEM219优选是真核细胞TMEM219，优选哺乳动物TMEM219，并且优选人TMEM219。
IGFBP3与TMEM219的相互作用可以通过这些手段测量：间接评估IGFBP3对靶细胞的效果(用RT-PCR，升高的胱天蛋白酶8和9表达)，用液相或固相配体结合的结合试验(即，免疫沉淀、RT-PCR、免疫分析)和非放射性配体结合试验直接评估IGFBP3-IGFBP3-受体(TMEM219)。
在本发明中，“长期T1D”指与糖尿病并发症的发展有关且超过15年的1型糖尿病的病史。
在本发明的优选方面，抑制剂是抗体或其合成的或重组的衍生物。所述抗体优选单克隆或多克隆抗体，或其合成的或重组的衍生物，更优选地，所述抗体为人源化的单克隆抗体。
优选地，所述多核苷酸是RNA或DNA，优选siRNA、shRNA、微RNA或反义寡核苷酸。
在一个优选实施方式中，上述载体是选自下组的表达载体：质粒、病毒颗粒和噬菌体。
优选地，所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，优选地为动物细胞，更优选地为人细胞。
在一优选实施方式中，如上所定义的抑制剂(a)与至少一个治疗剂组合，(b)以定义组合或组合制剂。治疗剂可以是抗糖尿病剂，一种用于预防糖尿病的试剂，抗细胞凋亡剂，抗炎剂，免疫抑制剂，器官移植中的辅助治疗，细胞治疗中接近疼痛缓解剂的保护剂。
治疗剂的实例是：任何形式的胰岛素治疗，普兰林肽(Symlin)，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)，阿司匹林，降胆固醇药物，二甲双胍(库鲁化锭(Glucophage)，Glumetza，其它)，磺酰脲(格列本脲(达安疗(DiaBeta)，Glynase)，格列吡嗪(Glucotrol)和格列美脲(亚莫利(Amaryl))，氯茴苯酸(例如，瑞格列奈(Prandin)和那格列奈(Starlix))，噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮(Avandia)和吡格列酮(艾可拓(Actos)例如)，DPP-4抑制剂(西他列汀(Januvia)，沙格列汀(安立泽(Onglyza))和利拉利汀(Tradjenta))，GLP-1受体激动剂(艾塞那肽(百泌达(Byetta))和利拉鲁肽(诺和力))，SGLT2抑制剂，实例包括卡格列净(卡格列净(Invokana))和达格列净(Farxiga)。
本文所用术语“组合”和“组合制品”同样定义“部分的试剂盒”，从某种意义上说，如上所定义的组合部分(combination partner)(a)和(b)可以独立地给药，或通过使用不同固定的组合以相区分量的组合部分(a)和(b)给药，即，同时或以不同的时间点。其后，部分的试剂盒的部分可以，例如，同时或按时间顺序交叉给予，也就是在不同的时间点，以相等或不同的时间间隔给予部分的试剂盒的任意部分。例如，为了应对待治疗患者亚群的需求或单一个体的需求，组合制品中待给予的组合部分(a)与组合部分(b)的总量的比例可以改变。
组合治疗可以在糖尿病的治疗中导致预料之外的改进。当同时、先后或分别给予之时，抑制剂和其它治疗剂可以协同的方式相互作用以减轻糖尿病。这种意料之外的协同作用允许减少各化合物所需的剂量，从而导致副作用的减少并增强化合物和治疗的临床效果。通过将不同w/w比例范围和剂量的成分给予需要治疗的对象，可以确切地进行测量，确定一种或多种成分之间的协同相互作用，起作用的最佳范围以及各成分起作用的绝对剂量范围。对人而言，对患者进行临床研究的复杂性和成本使得使用以这种形式的测试作为协同作用的主要模型是不切实际的。然而，对一个物种中协同作用的观察可以预测其他物种的作用，并且存在动物模型，如本文所述，以对协同作用进行测量并且这样研究的结果还可以用于通过应用药代动力学/药效学方法在其它物种中预测所需的有效剂量和血浆浓度比例范围和绝对剂量和血浆浓度。糖尿病模型和在人中观察到的效果之间建立的关联表明动物中的协同作用可以，例如，在如下实施例中所述的模型中被证明。
上述药物组合物优选用于全身、口服、局部、优选直肠或局部给予。
对照量是在适当的对照中测量的量。
可以使用对照手段来对如上定义的化合物的量或增加量与适当的对照进行比较。例如，参考的已知标准，可以由正常对象或正常群体来获得适当的对照。
上述诊断方法还可以包括治疗所述对象的步骤，具体而言，该治疗可以是如本发明所定义的IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂，或如上所示用于糖尿病的现有治疗。
测量如上所定义的IGFBP3量的手段优选至少一种抗体，其功能性类似物或衍生物。所述抗体，其功能类似物或衍生物针对所述化合物具有特异性。
在一个优选实施方式中，本发明的试剂盒包含：
-附着有对于所述化合物具有特异性的抗体的固相；
-所述配体特异性-生物标志物复合物的检测手段。
根据本发明的试剂盒还可包含常用助剂，如缓冲液、运载体、标志物等和/或使用说明书。
适当的对照可以是取自健康患者或受到糖尿病以外的病症影响的患者的样品。
在用于监测糖尿病发展的试剂盒或方法的情况下，监测疾病的发展，并且适当的对照可以是取自处于不同时间的同一对象或不同的患者的样品，然后适当的对照量可以是在不同时间的同一对象或不同的患者中取得的样品中测量的相同蛋白质或多核苷酸的量。
在用于监测治疗处理的功效或应答的试剂盒或方法的情况下，适当的对照可以是取自同一对象在治疗开始之前或在治疗过程当中不同时间的样品，然后适当的对照量可以是在取自同一对象在治疗开始之前或在治疗过程当中不同时间的样品中测量的相同蛋白质或多核苷酸的量。该治疗可以是用本发明的抑制剂的治疗。
在本发明中，“测量…量”这样的表述可以意指测量各蛋白质和/或其mRNA和/或其DNA的水平或浓度或量，优选半定量或定量的。蛋白质的测量可以直接或间接地进行。直接测量表示，基于直接从蛋白质获得信号，生物标志物的量或浓度测量值，并且所述信号直接与样品中存在的蛋白质分子数量相关联。也可以被称为强度信号的该信号可以通过，例如，测量生物标志物的化学或物理性质的强度值获得。间接测量包括由次要成分(例如，基因表达产物的不同成分)和生物测量系统(例如，细胞响应、配体、“标签”或酶反应产物的测量)获得的测量。
本说明书中使用的术语“量”表示，但不限于蛋白质和/或其mRNA和/或其DNA的绝对或相对量，以及与其相关或可以由这些产生的其它任何值或参数。这样的值或参数包括获得自蛋白质的物理或化学性质的信号强度值，通过直接测量，例如，免疫分析、质谱或核磁共振中强度值获得的信号强度值。此外，这些值或参数包括通过间接测量获得的那些，例如，本文所述测量系统中的任一种获得的值或参数。测量样品中mRNA和DNA的方法是本领域已知的。为了测量核酸水平，可以裂解测试样品中的细胞，并且可以本领域熟知的各种方法测量裂解物中或由裂解物纯化的或半纯化的RNA中mRNA的水平。这样的方法包括，使用可检测标记的DNA或RNA探针进行杂交试验(即Northern印迹)，或使用适当的寡核苷酸引物进行定量或半定量RT-PCR方法。又或者，可以使用例如组织切片或为裂解的细胞悬浮液以及可检测标记的(例如，荧光或酶标记的)DNA或RNA探针进行定量或半定量原位杂交试验。定量mRNA的其它方法包括，RNA保护试验(RPA)、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析(RDA)、差异显示、EST序列分析和基因表达的系列分析(SAGE)。
如果将蛋白质IGFBP3或编码所述蛋白质的多核酸的测量量与获自对照样品的量进行比较，所述化合物在由对象分离的样品中的量对应较高的值，那么所述对象可能存在该疾病，或者所述疾病恶化。
如果将蛋白质IGFBP3或编码所述蛋白质的多核酸的测量量与获自对照样品的量进行比较，所述化合物在由对象分离的样品中的量对应相似或较低的值，那么所述对象可能并未受到该疾病的影响，或者所述疾病缓解。
或者，“检测”或“测量…量”的表述意在表示测量分子的改变。所述改变可以反映如上所定义的化合物量的增加或减少。蛋白质IGFBP3或编码所述蛋白质的多核苷酸的增加可以与疾病的恶化相关联。蛋白质IGFBP3或编码所述蛋白质的多核苷酸的减少可以与疾病的缓解或对象的恢复相关联。
“蛋白质IGFBP3”或“IGFBP3”或“TMEM219”这样的表述意在还包括由IGFBP3或TMEM直系同源或同源基因、功能性突变体、功能性衍生物、功能性片段或其类似物、同种型编码的对应蛋白质。
“基因IGFBP3”或“IGFBP3”或“基因TMEM219”或“TMEM219”这样的表述意在还包括直系同源或同源基因、功能性突变体、功能性衍生物、功能性片段或其类似物、同种型质。
在本发明中，蛋白质的“功能性突变体”是这样的突变体，其可以通过使其序列中的一个或多个氨基酸突变来产生，并且维持其对于糖尿病治疗的活性。事实上，如果需要，本发明的蛋白质可以被体内和/或体外修饰，例如，通过糖基化、豆蔻酰化、酰胺化、羧化或磷酸化，并且可以通过例如本领域已知的合成或重组技术获得。可以通过本领域已知的方法修饰本发明的蛋白质“IGFBP3”或“TMEM219”以增强其生物利用度或半衰期。例如，蛋白质可以与聚合物偶联，可以是PEG化的等。
在本发明中，活性成分也可包入通过例如凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，示例分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入乳浊液(macroemulsion)中。这类技术可参见《雷明顿药物科学》第16版，Osol,A.编(1980)。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，其中该基质是成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括：聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物释放分子的时间能够超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的时间则较短。包入胶囊的抗体能在体内长期留存，它们因接触37℃潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性降低、免疫原性也可能改变。取决于相关的机制，可设计合理方案实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过巯基-二硫键互换形成的分子间S-S键，可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
在本发明中，“功能性”意指，例如，“保持其活性”，例如，糖尿病的治疗处理。
本文所用术语“类似物”指经修饰的肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基所取代，和/或其中一个或多个氨基酸残基已经被从该肽中删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基已经被从该肽中删除和或一个或多个氨基酸残基已经被添加到该肽。这样的氨基酸残基添加或删除可以发生在肽的N-末端和/或肽的C-末端。
本文所用术语“衍生物”涉及蛋白质时指化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取代基是不存在于未修饰的肽或其类似物的，即，已经被共价修饰的肽。典型的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯等。本文所用术语“衍生物”还表示较长或较短的多肽，例如，其具有与IGFBP3至少41％，优选至少41.5％、50％、54.9％、60％、61.2％、64.1％、65％、70％或75％，更优选至少85％，例如至少90％，和甚至更优选至少95％的同一性百分比，或具有由IGFBP3直系同源或同源基因编码的对应区域的氨基酸序列。
本文所用的“片段”表示这样的多肽，其具有优选至少10个氨基酸，更优选地至少15个、至少17个氨基酸或至少20个氨基酸，甚至更优选地至少25个氨基酸或至少37或40个氨基酸，并且更优的至少50、或100、或150或200或250或300或350或400或450或500个氨基酸的长度。
根据本发明，组合物的“有效量”是足以在糖尿病的治疗或缓解的情况中实现所需生物效果的量。
应理解，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重，同时治疗的种类(如果有)，治疗频率以及所需作用的特性。提供的本发明抑制剂或分子的有效剂量范围(例如，从1mg/kg到1000mg/kg，特别是全身性给予)并非旨在限制本发明，并且仅代表优选的剂量范围。然而，可以对个体对象调整最优选的剂量，这是本领域技术人员能够理解和确定的，无需赘述。
可通过已知方法进行本发明的寡核苷酸的给药，其中在以体外或体内方式将核酸导入所需靶细胞中。
本发明的一个方面包括包含在递送载剂内的核酸构建体。递送载剂是可将核苷酸序列从至少一种介质运输至另一种介质的实体。递送载剂可通常用于核酸构建体内编码的序列表达和/或细胞内递送构建体。在本发明的范围内，递送载剂可以是选自下组的载剂：基于RNA的载剂、基于DNA的载剂/载体、基于脂质的载剂、基于病毒的载剂和基于细胞的载剂。这类递送载剂的示例包括：生物可降解聚合物微球、基于脂质的制剂如脂质体运载体、在胶体金颗粒上包覆构建体、脂多糖、多肽、多糖、PEG化病毒载剂。
在本发明的一个实施方式中，可包括病毒作为递送载剂，该病毒可选自：腺病毒、反转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、泡沫病毒、巨细胞病毒、塞姆利基森林病毒、痘病毒、RNA病毒载体和DNA病毒载体。此类病毒载体为本领域熟知。
通常使用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、转染、电穿孔和微注射以及病毒方法。用于将DNA导入细胞的另一种技术是使用阳离子脂质体。市售可得的阳离子液体制剂是例如Tfx 50(普洛麦格公司(Promega))或Lipofectamin2000(生命技术公司(LifeTechnologies))。
本发明的组合物可以是溶液剂的形式，例如可注射溶液剂、乳膏剂、油膏剂、片剂、悬浮剂等。该组合物可以任何合适的方法给予，例如通过注射，特别是通过眼内注射、通过口服、局部、经鼻、直肠施用等。该运载体可以是任何合适的药物运载体。优选地，可以使用运载体，其能够提高RNA分子进入靶细胞的效率。这类运载体的合适示例是脂质体，特别是阳离子脂质体。
本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计为用于增殖或扩增或用于表达或用于以上两种目的的那些，例如质粒和病毒。本发明的重组表达质粒可以使用标准重组DNA技术制备。环形或线形的表达载体构建体可制备为包含原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可来源于，例如，CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
优选地，重组表达载体包括调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对将导入该载体的宿主类型(如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，在适当时考虑该载体是基于DNA还是基于RNA。该重组表达载体可包括一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主。标志物基因包括杀生物剂抗性，例如，对抗生素、重金属等的抗性，其在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型，等等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和青霉素抗性基因。重组表达载体可以包括天然或非天然启动子，其可操作地连接编码PCYOX1抑制剂(包括其功能性部分和功能性变体)，或连接与编码RNA的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择(例如强、弱、可诱导、组织特异性和发育特异性)是在本领域公知常识的范围内。类似地，将核苷酸序列与启动子合并也在本领域公知常识的范围内。该启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
本发明的重组表达载体可设计为瞬时表达、稳定表达或上述两种表达。同样地，重组表达载体可制备为用于组成型表达或可诱导表达。
在上述IGFBP3组合物中，其他材料以及加工技术等可参见Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)第5部分，第20版，2000，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania)，其通过引用结合入本文。
还可以以持续释放形式或者由持续释放药物递送系统来给予本发明的化合物。在参考材料的Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)中还可以找到代表性持续释放材料的描述。此外，可使用制药领域熟知的方法制备药物制剂。
在本发明中，当将本发明的分子与另一治疗剂给予之时，可以同时或先后给予。
序列
IGFBP3的氨基酸序列：
MQRARPTLWAAALTLLVLLRGPPVARAGASSAGLGPVVRCEPCDARALAQCAPPPAVCAELVREPGCGCCLTCALSEGQPCGIYTERCGSGLRCQPSPDEARPLQALLDGRGLCVNASAVSRLRAYLLPAPPAPGEPPAPGNASESEEDRSAGSVESPSVSSTHRVSDPKFHPLHSKIIIIKKGHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHIPNCDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK(SEQ IDNo.4)
IGFBP3的核苷酸序列：智人(Homo sapiens)胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)，在染色体7上的RefSeqGene，NCBI参照序列：NG_011508.1
IGFBP3的mRNA序列：智人胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)，转录本变体1，mRNA，NCBI参照序列：NM_001013398.1
TMEM219的氨基酸序列：
MGNCQAGHNLHLCLAHHPPLVCATLILLLLGLSGLGLGSFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSRLLVLGSFLLLFCGLLCCVTAMCFHPRRESHWSRTRL(SEQ ID No.2).
TMEM219的核苷酸序列：TMEM219跨膜蛋白219[智人(人)]，Gene ID:124446。
TMEM219的mRNA序列：智人跨膜蛋白219(TMEM219)，转录本变体1，mRNA，NCBI参照序列：NM_001083613.1
通过参考下图的非限制性实施例阐述本发明。
图1：长期T1D中糖尿病肠病是通过结肠干细胞中的肠粘膜异常和损伤表征。A,B,C.柱状图描述了根据在健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)中给予的GSRS表，对腹泻、腹痛和便秘的评分。灰色区域指示参数的正常范围。D,E,F.柱状图报道了在健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)中通过直肠肛门测压法对肛门括约肌收缩张力(contracting tone)(mmHg)、反射响应(reflex response)(ml)和尿急体积(urgencyvolume)(ml)的测量。灰色区域指示参数的正常范围。评价包括N＝20CTRL和n＝60T1D+ESRD个体。G1-G2,I1-I2,K1-K2,M1-M2,O1-O2,Q1-Q2.获自健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)的活组织检查样品上苏木精和曙红(H&E)组织学染色，免疫染色的MIB1+细胞，红色箭头标出的神经结构的超微结构分析指示神经内分泌囊泡的位置和存在，免疫染色的5HT+，醛脱氢酶(ALDH)+细胞和的EphB2+表达的代表性成像。超微结构分比例尺：2000nm。初始放大：G1-G2中100X；I1-I2,K1-K2中400X；O1-O2中40X；Q1-Q2中200X。比例尺，80微米。H,J,L,N,P,R.柱状图报道了CTRL和长期T1D对象(T1D+ESRD)中隐窝，MIB1+细胞，神经末端的神经内分泌囊泡(各神经终端检测到的>3个NE囊泡的情况数)，5HT+，ALDH+细胞和EphB2+表达(强度评分0-5)的测量。评价包括N＝20CTRL和n＝60T1D+ESRD个体。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：GSRS，胃肠道症状评定量；CoSC，肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；H&E，苏木精和曙红；MIB1，针对Ki67的抗体；EphB2，肝脏配蛋白B受体2；Aldh，醛脱氢酶；5HT，血清素；NE，神经内分泌囊泡。
图2：长期T1D中的糖尿病肠病与CoSC中的缺陷相关。A,B.健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)中EphB2低、EphB2中和EphB2高细胞的代表性流式点图。C,D,E.柱状图描述了新鲜分离的隐窝(n＝10CTRL和n＝10T1D+ESRD)中EphB2高+、EphB2高+LGR5+和EphB2+h-TERT+细胞流式细胞术分析的结果。F,G,H.柱状图描绘了通过定量RT-PCR在分离的肠隐窝上由mRNA标准化的CoSC标记物EphB2、LGR5、h-TERT的表达数据。所有样品一式三份运行，并且标准化至管家基因ACTB的表达(ΔΔCt)。I.散点图表示n＝10健康对象(CTRL)和n＝10长期T1D个体(T1D+ESRD)的新鲜分离的肠隐窝中CoSC特征标志物和干细胞转录组概况。J1-J2.由之前分离的健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)的隐窝获得的迷你肠道体外培养8天后的代表性成像。10X放大。比例尺50微米。K.柱状图描述了n＝10CTRL和n＝10T1D+ESRD个体的新鲜分离的隐窝在8天培养时全部中成熟迷你肠道的％。L1-L4.由之前分离的健康对象(CTRL)的肠隐窝获得的迷你肠道和按所述条件培养8天后迷你肠道的代表性成像，所述条件为：L1＝正常(FBS)血清+正常葡萄糖(5mM)；L2＝T1D+ESRD血清+正常葡萄糖；L3＝正常血清+高葡萄糖(35mM)；L4＝T1D+ESRD血清+高葡萄糖。10X放大。比例尺50微米。M.柱状图将新鲜分离的肠隐窝按所述条件8天培养时全部中成熟迷你肠道的％分组，所述条件为：正常(FBS)血清+正常葡萄糖(5mM)；T1D+ESRD血清+正常葡萄糖；正常血清+高葡萄糖(35mM)；T1D+ESRD血清+高葡萄糖。通过比较不同培养条件，已经计算出各组的统计学限制性(正常葡萄糖+正常血清，培养基+高葡萄糖，培养基+长期T1D血清，高葡萄糖+长期T1D血清)。柱状图中的比较表示所有条件对比正常血清+正常葡萄糖。N.转录组概况描述了由健康的对象获得并与/不与高葡萄糖和/或长期T1D血清培养的分离的隐窝中CoSC特征标志物表达。评价N＝10对象/组。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；EphB2，肝脏配蛋白B受体2；LGR5，包含富亮氨酸重复的G蛋白偶联的受体5；RT-PCR，实时聚合酶链反应；ACTB，β肌动蛋白；FBS，胎牛血清。
图3：循环IGF-I和IGFBP3在长期T1D中被改变，并且其体外操控诱导对CoSC生长和自我更新的显著影响。A.热图表示相较于健康对象(CTRL)，长期T1D(T1D+ESRD)中蛋白质组概况。对鉴定的和定量的蛋白质的完整数据集进行统计分析(p<0.01)。显著差异表达的蛋白质通过分级聚类进一步分析。对n＝10CTRL和n＝10T1D+ESRD个体的血清进行分析。B.柱状图描述了对由未靶向的蛋白质组分析推测的单一蛋白质，胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)的LFQ强度。C1-C2.肝脏中IGFBP3表达的代表性成像(40X放大)。IGFBP3在来自健康对象(C1)的肝脏实质中适度且广泛的表达，而其在长期糖尿病个体(C2)中的阳性更加区域性。D.柱状图表示了通过ELISA在以不同葡萄糖浓度(35mM：高葡萄糖；20mM：中间葡萄糖；5mM：正常葡萄糖)下培养5天的固化的人肝脏癌细胞系(HuH-7)的上清液中测量的IGFBP3水平。实验一式三份运行。E.柱状图表示通过ELISA在健康对象和长期T1D(T1D+ESRD)中测量的胰岛素样生长因子1(IGF-I)水平。F.Western印迹分析(切割的印迹)确认在肠隐窝表面上的IGF-IR和TMEM219表达。通过WB评价总IGF-IR表达包括检测IGF-IR全蛋白的亚基——IGF-IRα。由CTRL获得的直肠粘膜活组织检查样品上进行的TMEM219原位杂交(G1阳性对照，G2TMEM219染色)的代表性图片。20X放大。G1-G2.由CTRL获得的直肠粘膜活组织检查样品上进行的TMEM219原位杂交(G1阳性对照，G2TMEM219染色)的代表性图片。放大400X。H.柱状图描述了使用ΔΔCt方法TMEM219(IGFBP3受体)标准化的mRNA表达。评价N＝5对象/组。I.柱状图将获得自不同条件下长期T1D个体并表现出IGF-I、IGFBP3和抗-IGF-IR效果的全部中成熟迷你肠道的％分组。p值是相对于基线条件，并且向培养物添加了IGF-1。J.柱状图表示了分离的自健康对象并在IGFBP3和IGF-I+IGFBP3存在下培养的隐窝中标准化的胱天蛋白酶8和9的mRNA表达，一式三份进行。K.柱状图将获得自健康对象并在全胱天蛋白酶抑制剂，胱天蛋白酶8、9和3的选择性抑制剂和/或IGFBP3存在下培养8天时全部中成熟正常迷你肠道的％分组。试验一式三份进行。L.柱状图将获得自健康对象并在不同条件(正常葡萄糖+正常血清，高葡萄糖+正常血清，T1D+ESRD血清+正常葡萄糖，T1D+ESRD血清+高葡萄糖)下培养且表现出IGF-I、IGFBP3和抗-IGF-IR效果的全部迷你肠道中成熟正常迷你肠道的％分组。p值相对于基线条件(单独培养基，培养基+高葡萄糖，培养基+长期T1D血清，高葡萄糖+长期T1D血清)。还计算了其它p值，以比较迷你肠道在如下条件下生长中的区别：单独培养基对培养基+高葡萄糖，对培养基+高葡萄糖+长期T1D血清)。试验一式三份进行。M.柱状图将获得自健康对象，培养八天，暴露于用siRNA靶向的TMEM219并最终与单独培养基中和培养基+高葡萄糖+长期T1D血清中表达TMEM219的隐窝比较的所有迷你肠道中成熟迷你肠道的％分组。试验一式三份进行。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IGF-IR，胰岛素样生长因子1受体；CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；RT-PCR，实时聚合酶反应；ACTB，β肌动蛋白；LFQ，无标签定量；SEM，平均值的标准误差；siRNA，小RNA干扰；inhib，抑制剂。
图4：外周IGF-I/IGFBP3二分体在单细胞体外衍生的迷你肠道和胱天蛋白酶级联上的作用。操控外周IGF-I/IGFBP3二分体在糖尿病肠病的临床前模型中改变糖尿病肠病的进程，而用胰肾联合移植(SPK)的长期T1D的治疗改善肠道症状、运动性和形态。A.柱状图表示在获得自健康对象的隐窝的EphB2+分选的单细胞中标准化的TMEM219、LRP1、TGF-βI型和II型的mRNA表达。实验一式三次进行。B.柱状图显示由健康对象新鲜分离的隐窝分选的EphB2+细胞获得并在不同条件下培养(正常葡萄糖+正常血清，高葡萄糖+正常血清，T1D+ESRD血清+正常葡萄糖，T1D+ESRD血清+高葡萄糖)并表现IGF-I和IGFBP3效果的成熟的单细胞衍生的迷你肠道(占全部)的％。p值相对于基线条件。C,D.散点图表示在用/不用IGFBP3和IGF-I培养的新鲜分离的健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)肠隐窝中检验到的细胞凋亡转录组概况。实验一式三次运行。E.原理图试图表示循环IGF-I和IGFBP3对CoSC的影响。F,G,I.线图报告了对在基线和在STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠(B6+STZ)、原初B6(WT)和IGFBP3处理的原初B6(WT+IGFBP3)8周后收获的下肠道切片进行的隐窝数量(B)、隐窝深度(C)和隐窝宽度(E)的评估。WT：野生型，STZ：链脲霉素处理的。评价N＝3小鼠/组。H1-H3.WT、产生糖尿病肠病的B6+STZ小鼠和用IGFBP3处理的天然B6(WT+IGFBP3)的H&E切片上肠隐窝的代表性成像。组织放大，400X。J.柱状图表示在STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠、WT和用IGFBP3处理的天然B6(WT+IGFBP3)免疫染色的切片中Aldh+细胞/mm2的数量。K1-K3.收获自STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠、WT和用IGFBP3处理的天然B6(WT+IGFBP3)的下肠道免疫染色切片上Aldh+细胞的代表性成像。组织放大，400X。L,N,P.柱状图报告了在4组对象(n＝20CTRL、n＝30SPK、n＝K+T1D和n＝60T1D+ESRD)中MIB1+和Aldh+细胞以及EphB2+表达(强度评分0-5)的测量。M1-M2,O1-O2,Q1-Q2.单独接受肾移植(K+T1D)或胰肾联合移植(SPK)的第8年随访的T1D+ESRD的免疫染色的直肠粘膜活组织检查样品中MIB1+和Aldh+细胞以及EphB2+表达的代表性成像。M1-M2和O1-O2中组织学为400X，Q1-Q2中为20X。比例尺，80微米。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：WT，野生型；STZ，链脲霉素处理的；B6，C57BL/6J小鼠；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IGF-IR，胰岛素样生长因子1受体；CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；SPK，胰肾联合移植；K+T1D，1型糖尿病中单独肾脏移植；H&E，苏木精和伊红；MIB1，针对Ki67的抗体；EphB2，肝脏配蛋白B受体2；Aldh，醛脱氢酶；SEM，平均值的标准误差。
图5：用SPK治疗长期T1D通过恢复循环IGF-1和IGFBP3恢复CoSC特征概况和迷你肠道成熟并且补充CoSC。A,B,C.柱状图描述了由长期T1D(基线)，由接受胰肾移植(SPK)或单独肾脏移植(K+T1D)第8年随访的T1D+ESRD中分离的隐窝获得的EphB2高+、EphB2高+LGR5+、EphB2+h-TERT+细胞流式细胞术分析的结果。评价N＝10对象/组。D,E,F.柱状图描述了由长期T1D(基线)，接受胰肾移植(SPK)或单独肾脏移植(K+T1D)第8年随访的T1D+ESRD获得分离的肠隐窝上，通过定量RT-PCR测量的肠干细胞标志物EphB2、LGR5、h-TERT经标准化的mRNA表达。所有样品一式三份运行，并且使用ΔΔCt方法标准化至管家基因ACTB的表达。评价N＝10对象/组。G.Western印迹分析描述了第8年随访的4个组分离的肠隐窝中EphB2、LGR5、h-TERT的表达。评价N＝5对象/组。H.柱状图描述了第8年随访的SPK和K+T1D对象获得的新鲜分离的肠隐窝在第8天培养时全部迷你肠道中成熟的迷你肠道的％。评价N＝10对象/组。I.热图表示在CTRL，长期T1D对象(T1D+ESRD)，第8年随访的SPK和K+T1D对象的新鲜分离的肠隐窝中检验的CoSC特征标志物转录组概况。评价N＝10对象/组。J.柱状图表示通过ELISA在第8年随访的4组的血清中测量的IGF-I水平。评价N＝10对象/组。K.柱状图描述了通过ELISA在4组对象的血清中测量的IGFBP3水平。评价N＝20对象/组。L,M使用GSRS表(0-7)在n＝20对象的K+T1D(L)和SPK(M)组中评估的肠道症状和IGFBP3血清水平之间的关联性。分析使用ANOVA(p<0.05)通过比较所有组进行。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；SPK，胰肾联合移植；EphB2，肝脏配蛋白B受体2；LGR5，包含富亮氨酸重复的G蛋白偶联的受体5；RT-PCR，实时聚合酶链反应；ACTB，β肌动蛋白；K+T1D，1型糖尿病中单独肾脏移植；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；SEM，平均值的标准误差。
图6：用新产生的重组蛋白外-TMEM219(外-TMEM219)的治疗消除IGFBP3-介导的迷你肠道破坏并且在临床前模型中保护CoSC。A.柱状图将获得自不同条件下的健康对象并在IGFBP3处理的迷你肠道或在那些暴露于高葡萄糖的迷你肠道中以不同浓度(1:2、1:1和2:1摩尔比力，相较于IGFBP3)表现外-TMEM219效果的全部迷你肠道中成熟迷你肠道的％分组。p值相对于基线条件。B.柱状图表示了分离自健康对象并在IGFBP3和外-TMEM219+IGFBP3存在下培养的隐窝中标准化的EphB2的mRNA表达，一式三份进行。C.D.柱状图表示了分离自健康对象并在IGFBP3和外-TMEM219+IGFBP3存在下培养的隐窝中标准化的胱天蛋白酶8和9的mRNA表达，一式三份进行。E,F,G.线图报告了对在基线和在STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠(B6+STZ)、原初B6(WT)和外-TMEM219处理的STZ-B6小鼠8周后收获的肠道下部进行的隐窝数量(E)、隐窝深度(F)和隐窝宽度(G)的评估。WT：野生型，STZ：链脲霉素处理的。评价N＝3小鼠/组。H.线图报告了在基线和STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠(B6+STZ)、原初B6(WT)和用外-TMEM219处理STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠8周后的体重。WT：野生型，STZ：链脲霉素处理的。评价N＝3小鼠/组。I.柱状图表示由来自原初B6小鼠、STZ处理的B6小鼠和在用外-TMEM219处理的STZ-B6小鼠8周的肠样品分离的EphB2+细胞的流式细胞术分析的结果。J.由分离自原初B6小鼠、STZ处理的B6小鼠和在用外-TMEM219处理的STZ-B6小鼠8周的隐窝分离的EphB2+细胞的代表性流式柱状图。评价N＝3至5小鼠/组。K.柱状图表示由收集自原初B6小鼠、STZ处理的B6小鼠和在用外-TMEM219处理的STZ-B6小鼠8周的肠样品中EphB2的标准化mRNA表达。L,M.柱状图表示由收集自原初B6小鼠、STZ处理的B6小鼠和在用外-TMEM219处理的STZ-B6小鼠8周的肠样品中胱天蛋白酶9(L)和胱天蛋白酶8(K)的标准化mRNA表达。N.柱状图表示在原初B6小鼠(WT)、STZ处理的B6小鼠(B6+STZ)和在用外-TMEM219处理的B6+STZ小鼠8周中测量的IGFBP3循环水平。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：WT，野生型；STZ，链脲霉素处理的；B6，C57BL/6J小鼠；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；CoSC，结肠干细胞；H&E，苏木精和伊红；EphB2，肝脏配蛋白B受体2；SEM，平均值的标准误差；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；RT-PCR，实时聚合酶链反应；ACTB，β肌动蛋白。
图7：在CTRL、T1D和T1D+ESRD个体的血清(A)和尿液(B)中评估IGFBP3水平。(C)在本研究评价的组的所有对象中血清和尿液IGFBP3水平之间的关联性。(D-E)在患有在透析的T1D+ESRD(D)和具有eGFR>15ml/分钟/m2的T1D(E)的对象中用MDRD公式计算的IGFBP3血清水平和eGFR之间的关联性。(F)在本研究评价的组的所有对象中血清和尿液IGFBP3水平之间的关联性。灰色区域指示尿液和血清中IGFBP3水平的正常范围。
图8：CoSC概况，迷你肠道的体外生成，在长期T1D和健康个体中CoSC上IGF-IR的表达以及IGFBP3在肝脏中的表达。A,B.健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)中PI-细胞门选策略的代表性流式点图。C.柱状图描述了新鲜分离的隐窝(n＝10CTRL和n＝10T1D+ESRD)中PI-细胞流式细胞术试验的结果。D-E.健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)中EphB2高LGR5+(D)和EphB2+h-TERT+细胞的代表性流式点图。F.Western印迹分析(切割的印迹)确认长期T1D个体(T1D+ESRD)的体外分离的肠隐窝中EphB2、LGR5、h-TERT的低表达。全长印迹如图5所示。评价N＝5对象/组。G.散点图表示健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)的新鲜分离的肠隐窝中干细胞转录组概况。表格总结了分析的途径和基因(表S1)。评价N＝10对象/组。H-I.获得自DAPI染色的健康对象和长期T1D个体的新鲜分离的隐窝的代表性成像。20X放大。J.柱状图表示获得自健康对象和长期T1D个体在12小时时迷你肠道形成效率的百分比。评价N＝10对象/组。K.柱状图表示获得自健康对象和长期T1D个体的肝脏样品免疫组学化学评价后IGFBP3强度/扩散(0-6)计算的综合评分。评价N＝3对象/组。L1-L6.肝脏中IGFBP3表达的代表性成像(63X放大)。免疫荧光确认Hep Par-1+细胞和IGFBP3表达的共定位(L1-L3)，而在IGFBP3和CD163+细胞之间并未观察到共定位(L4-L6)。M.柱状图描述了通过定量RT-PCR在分离的肠隐窝测量的IGF-I受体(IGF-IR)标准化的mRNA表达。所有样品一式三份运行，并且使用ΔΔCt方法标准化至管家基因ACTB。N1-N2.获得自CTRL和T1D+ESRD个体的直肠粘膜样品上IGF-IR+细胞的代表性图片。黑色箭头指示隐窝基部的阳性细胞。200X放大。O1-O2.获得自CTRL和T1D+ESRD个体的直肠粘膜活组织检查样品上进行TMEM219原位杂交的代表性图片。放大400X。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01。缩写：PI，碘化丙啶；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IGF-IR，胰岛素样生长因子1受体；CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；EphB2，肝配蛋白B受体2；LGR5，包含富亮氨酸重复的G蛋白偶联的受体5；RT-PCR，实时聚合酶反应；ACTB，β肌动蛋白；LFQ，无标签定量；SEM，平均值的标准误差。
图9：IGF-I/IGFBP3培养的迷你肠道中胱天蛋白表达及其它循环因子(circulating factor)效果的缺乏确认IGFBP3在迷你肠道发展上的主要促细胞凋亡作用。A.柱状图表示了分离自患有T1D+ESRD的个体并在IGFBP3、IGF-I+IGFBP3和IGF-1存在下培养的隐窝中标准化的胱天蛋白酶8的mRNA表达，一式三份进行。B.柱状图表示了分离自患有T1D+ESRD的个体并在IGFBP3、IGF-I+IGFBP3和IGF-1存在下培养的隐窝中标准化的胱天蛋白酶9的mRNA表达，一式三份进行。C,D.柱状图将由健康对象(C)和由长期T1D个体(D)发展，并在有FBS的培养基和有获得自健康对象血清——“CTRL血清”的培养基存在下培养的迷你肠道的％分组。试验一式三份运行。E.柱状图将获得自健康对象，培养八天，暴露于用siRNA和抗-IGF-IR靶向的TMEM219并最终与单独培养基中和培养基+高葡萄糖+长期T1D血清中表达TMEM219的隐窝比较的成熟迷你肠道的％分组。试验一式三份进行。F,G.柱状图将获得自健康对象(F)和长期T1D个体(G)，并在单独培养基以及用蛋白质组学分析鉴定的各种分子(表S7)存在下培养第8天时的迷你肠道的％分组。试验一式三份进行。H.柱状图将获得自健康对象并在单独培养基、培养基+高葡萄糖、培养基+高葡萄糖和长期T1D血清、IGF-I、具有/没有胰岛素的IGFBP3存在下培养的迷你肠道的％分组。试验一式三份进行。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001。缩写：IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IGF-IR，胰岛素样生长因子1受体；CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；RT-PCR，实时聚合酶反应；ACTB，β肌动蛋白；SEM，平均值的标准误差；siRNA，小RNA干扰；ALDOA，果糖二磷酸醛缩酶A；RNASE，核糖核酸酶胰腺；MASP，甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1。
图10：IGF-I/IGFBP3二分体在单细胞衍生的迷你肠道、干细胞转录组概况和细胞凋亡途径的效果。A1-A3.经体外培养8天、获得自先前分离的EphB2+分选的健康对象细胞并用单独培养基、培养基+IGFBP3、培养基+葡萄糖35mM+长期T1D血清培养的单细胞衍生的迷你肠道的代表性成像。成像以10X放大示出。比例尺，50微米。B,C,D.柱状图表示由健康对象分离并在不同条件下培养的流式分选的EphB2+细胞生长的单细胞衍生的迷你肠道中胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9和Ki67标准化的mRNA表达。试验一式三份进行。E,F.散点图表示在用/不用IGFBP3和IGF-I培养的新鲜分离的健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)肠隐窝中检验到的干细胞转录组概况。实验一式三次运行。G,H.散点图表示在用/不用IGF-I培养的新鲜分离的健康对象(CTRL)和长期T1D个体(T1D+ESRD)肠隐窝中检验到的细胞凋亡转录组概况。表格总结了分析的途径和基因(表S3)。试验一式三次运行。I,J.柱状图将由健康对象(I)和长期T1D(J)发展的，并在单独培养基、Fas配体(FasL)、过氧化氢(H2O2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)存在下培养的迷你肠道的％分组。试验一式三份进行。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；CoSC，结肠干细胞；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；RT-PCR，实时聚合酶链反应；ACTB，β肌动蛋白；SEM，平均值的标准误差；FasL，Fas配体；H2O2，过氧化氢；TNF-α，肿瘤坏死因子α。
图11：在糖尿病肠病的临床前模型中操控IGF-I/IGFBP3二分体。A.柱状图表示在原初B6小鼠(WT)和STZ处理的B6小鼠(B6+STZ)中测量的IGFBP3循环水平。B.柱状图表示在原初B6小鼠(WT)和STZ处理的B6小鼠(B6+STZ)中测量的IGF-I循环水平。C.柱状图表示在原初B6小鼠(WT)和STZ处理的B6小鼠(B6+STZ)中测量的胰岛素血清水平。D,E,F.线图报告了对在STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠(B6+STZ)、原初B6(WT)和用IGFBP3(B6+STZ+IGFBP3)或用IGF-I(B6+STZ+IGF-I)处理的STZ-B6小鼠在基线和8周后收获的肠道下部进行的隐窝数量(D)、隐窝深度(E)和隐窝宽度(F)的评估。WT：野生型，STZ：链脲霉素处理的。评价N＝3小鼠/组。G.柱状图表示在STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠、WT和用IGFBP3(B6+STZ+IGFBP3)或用IGF-I(B6+STZ+IGF-I)处理STZ-B6小鼠免疫染色的切片中Aldh+细胞/mm2的数量。H1-H2:用IGFBP3(B6+STZ+IGFBP3)，即(H1)或用IGF-I(B6+STZ+IGF-I)，即(H2)处理的STZ-B6小鼠H&E切片的肠隐窝代表性成像。组织放大，400X。I.线图报告了STZ处理的产生糖尿病肠病的B6小鼠(B6+STZ)、原初B6(WT)和用IGFBP3处理产生糖尿病肠病的STZ处理的B6小鼠的体重。WT：野生型，STZ：链脲霉素处理的。评价N＝3小鼠/组。J.柱状图表示收集自原初B6小鼠，STZ处理的B6小鼠和在用IGFBP3处理的STZ-B6小鼠(B6+STZ+IGFBP3)的肠样品中EphB2+细胞的流式细胞术分析的结果。K,L.柱状图表示由收集自原初B6小鼠、STZ处理的B6小鼠和在用IGFBP3处理的STZ-B6小鼠(B6+STZ+IGFBP3)的肠样品中EphB2(K)和LGR5(L)的标准化mRNA表达。M,N.柱状图表示由收集自原初B6小鼠、STZ处理的B6小鼠和在用IGFBP3处理的STZ-B6小鼠(B6+STZ+IGFBP3)的肠样品中胱天蛋白酶9(N)和胱天蛋白酶8(M)的标准化mRNA表达。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示，除非不同的报道。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。缩写：WT，野生型；STZ，链脲霉素处理的；B6，C57BL/6J小鼠；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；CoSC，结肠干细胞；H&E，苏木精和伊红；EphB2，肝配蛋白B受体2；Aldh，醛脱氢酶；SEM，平均值的标准误差。
图12：用SPK治疗长期T1D缓解糖尿病肠病。A,B,C.柱状图描述了根据在健康对象(CTRL)，长期T1D个体(基线)，接受胰肾移植(SPK)或单独肾脏移植(K+T1D)的T1D+ESRD中给予的GSRS表，对腹痛、腹泻和便秘的评分。灰色区域指示所有参数的正常范围。数据表示为平均值±SEM。D1-D2,E1-E2,G1-G2,J1-J2.在由接受胰肾移植(SPK)或单独肾脏移植(K+T1D)第8年随访的T1D+ESRD获得的直肠粘膜活组织检查样品上进行的对神经结构(红色箭头指示神经内分泌囊泡的位置和存在)、施旺(Schwann)细胞(红色箭头指示细胞质错乱)和5HT+细胞的超微结构分析和苏木精和伊红(H&E)染色的代表性图片。放大400X。F,H,I,K.柱状图报告了在由CTRL、长期T1D个体(基线)、接受胰肾移植(SPK)或单独肾脏移植(K+T1D)第8年随访的T1D+ESRD获得的活组织检查样品上进行的对神经内分泌囊泡(具有>3NE囊泡各神经终端的情况的％)，使用电子显微镜的具有固缩核和细胞质错乱的施旺细胞的％(阳性情况的％)、5HT+细胞的测量。数据表示为平均值±SEM。评价N＝20CTRL、n＝30SPK、n＝30K+T1D和n＝60T1D+ESRD对象。统计数据表示为平均值±SEM。当如下比较不同组之时，所有检测的参数是统计学显著不同的：*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001。评价N＝10对象/组。缩写：GSRS，胃肠道症状评定量；SPK，胰肾联合移植；K+T1D，1型糖尿病中单独肾脏移植；CTRL，健康对象；T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；5HT，血清素；H&E，苏木精和伊红；NGF，中性生长因子；SEM，平均值的标准误差；NE，神经内分泌囊泡。
图13：SPK和K+T1D组中糖尿病肠病中循环因子的蛋白质组概况、IGF-IR和结肠干细胞的分析。A1-A6.由之前分离的长期T1D个体(T1D+ESRD)、接受胰肾移植(SPK)或单独肾脏移植(K+T1D)的T1D+ESRD第8年随访的隐窝获得的迷你肠道体外培养8天后的代表性成像。图像以5X和10X放大示出。比例尺，10微米。B.散点图表示SPK个体新鲜分离的肠隐窝中干细胞转录组概况。评价N＝3对象。C.柱状图描述了通过定量RT-PCR测量健康对象(CTRL)、长期T1D个体(T1D+ESRD)、SPK和K+T1D的分离的隐窝上IGF-I受体(IGF-IR)相对表达水平。所有样品一式三份运行，并且使用ΔΔCt方法标准化至ACTB相对表达水平。结果表示为平均值±SEM。D.热图表示相较于CTRL和SPK对象第8年随后时，长期T1D的蛋白质组概况。对鉴定的和定量的蛋白质的完整数据集进行统计分析(p<0.05)。显著差异表达的蛋白质通过分级聚类进一步分析。数据表示为平均值±SEM。评价N＝10对象/组的血清。当如下比较不同组之时，所有检测的参数是统计学显著不同的：*p<0.01。缩写：T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；SPK，胰肾联合移植；K+T1D，1型糖尿病中单独肾脏移植；RT-PCR，实时聚合酶链反应；ACTB，β肌动蛋白；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IGF-IR，胰岛素样生长因子1受体；SEM，平均值的标准误差。
图14：SPK和K+T1D组中肠道症状与胰岛素、HbA1C和血糖水平的关联性。A,B使用GSRS表评估胰岛素血清水平和肠道症状之间的关联性，并在n＝20对象的K+T1D(A)和SPK(B)组中考虑具有最高评分(0-7)的项目。分析通过在比较所有组中使用ANOVA(p<0.05)进行。C.使用无胰岛素的方法在n＝20对象的K+T1D(A)和SPK(B)组中测量胰岛素水平。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示。D,E.使用GSRS表(0-7)在n＝20对象的K+T1D(A)和SPK(B)组中评估的肠道症状和糖化血红蛋白(HbA1C)血清水平之间的关联性。.分析通过在比较所有组中使用ANOVA(p<0.05)进行。F,G.使用GSRS表(0-7)在n＝20对象的K+T1D(A)和SPK(B)组中评估的肠道症状和血糖水平(血糖)之间的关联性。.分析通过在比较所有组中使用ANOVA(p<0.05)进行。缩写：T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；SPK，胰肾联合移植；K+T1D，1型糖尿病中单独肾脏移植；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图15：暴露于不同培养条件的迷你肠道中细胞谱系标志物的表达。A1-A4,B1-B4,C1-C4,D1-D4,E1-E4.由分离自健康对象、CTRL(A1-A4)和T1D+ESRD个体(B1-B4)的隐窝获得的，用IGFBP3(C1-C4)、葡萄糖35mM(D1-D4)、和葡萄糖35mM)+长期T1D血清(T1D+ESRD血清)+IGF-I(E1-E4)培养的迷你肠道中细胞角蛋白20(KRT20)、波形蛋白、突触泡蛋白(Synaptofisin)和醛脱氢酶(ALDH)表达的代表性成像(10X放大)。免疫荧光确认获得自T1D+ESRD个体的迷你肠道中所有谱系标志物的表达相较于CTRL(A1-A4,B1-B4)下降，并且ALDH是最少表达的标志物(B4)。同样在IGFBP3处理的迷你肠道中检测到ALDH表达的下降(C4)，尽管暴露于高葡萄糖和长期T1D血清，并且用IGF-I处理的迷你肠道表现出明显的ALDH表达恢复。F.柱状图描述了通过定量RT-PCR测量的非干细胞(EphB2-细胞)上TMEM219、KRT20、上皮细胞粘附分子(EpCam)和嗜铬粒蛋白A(CHGA)的表达。所有样品一式三份运行，并且使用ΔΔCt方法标准化至ACTB相对表达水平。结果表示为平均值±SEM。缩写：T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；IF，免疫荧光；KRT20，细胞角蛋白20；ALDH，醛脱氢酶；EpCam，上皮细胞粘附细胞；CHGA，嗜铬粒蛋白；RT-PCR，实时聚合酶链反应；ACTB，β肌动蛋白。
图16：选择策略，以在体外迷你肠道试验中检验候选蛋白质。
流程图描述了基于待在体外迷你肠道试验中检验的蛋白质组概况，用于选择候选蛋白质候选物的策略。
图17：使用隐窝域量化标准对成熟的迷你肠道的分析。
A-P.柱状图将具有在通过本文所报道的不同条件下可检测的至少1个隐窝域的成熟迷你肠道的％分组。
图18：相较于健康对象，外周IGFBP3水平在患有炎性肠病的个体中增加。
图19：IGFBP3外周水平在T1D(A)和T2D人对象(B)的前驱糖尿病的和糖尿病病症中增加。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；CTRL，健康对象；T1D，1型糖尿病；T2D，2型糖尿病；AutoAb阳性：处于患T1D风险、具有检测到的针对胰岛肽抗体阳性的非糖尿病对象；IGT：在禁食和非禁食条件下的OGTT(口服葡萄糖耐受测试)中测量的受损的葡萄糖耐受。NGT：在OGTT测量的正常葡萄糖耐受。IFG：在OGTT测量的受损的禁食葡萄糖耐受以及仅在禁食条件下产生的阳性。
图20：IGFBP3外周水平在T1D(A)和T2D(B)鼠模型的前驱糖尿病的和糖尿病病症中增加。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：C57BL6/J，B6小鼠；B6，原初小鼠；NOD，非肥胖小鼠；HFD，高脂膳食；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图21：原代人肝细胞中IGFBP3产生在葡萄糖暴露(11mM、20mM、35mM)(A)和炎症(IFNγ1,000U/ml，加Il-1β2ng/ml)(B)时增加。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：INF，炎症(IFNγ+Il-1β)；mM，毫摩尔；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图22：TMEM219表达于人胰岛(A-C)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：β-ACT，β-肌动蛋白
图23：TMEM219表达于鼠胰岛(A)和鼠β细胞系(B-D)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：β-TC，鼠β细胞系；β-ACT，β肌动蛋白。
图24：相较于在体外鼠β细胞系中促炎性刺激(IFNγ+Il-1β)，IGFBP3(50ng/ml)增强细胞凋亡和胱天蛋白酶8表达(A-B)并且降低胰岛素释放和表达(C、D1-D2、E)至更大的程度。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：IFNγ，干扰素γ；IL-1β，白细胞介素β；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3；β-TC，鼠β细胞系。
图25：IGFBP3(50ng/ml)增强细胞凋亡(A)和鼠胰岛中胱天蛋白酶8表达(B)，并降低体外胰岛素(C)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
图26：IGFBP3(50ng/ml)增强细胞凋亡和人胰岛中胱天蛋白酶8表达(A-B和C1-C2)，并降低体外胰岛素表达(D1-D2,E)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：Pi，碘化丙啶；M30，识别胱天蛋白酶切割的细胞角蛋白18的单克隆抗体M30；INS，胰岛素，IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图27：糖尿病8周后，将IGFBP3(150μg/天，15天)注射到C57BL/6小鼠改变体内胰岛素形态(A1-A6)。缩写：STZ，链脲霉素；B6，原初C57BL6/J小鼠。
图28：外-TMEM219(130ng/ml)在鼠β细胞系上防止IGFBP3相关的细胞凋亡作用(A-B,C1-C3)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：β-TC，鼠β细胞系；INS，胰岛素，IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图29：外-TMEM219处理(130ng/ml)将体外鼠胰岛中的胱天蛋白酶8和胰岛素表达接近标准化。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图30：外-TMEM219(130ng/ml)在人胰岛上防止IGFBP3相关的细胞凋亡作用(A-B,C1-C3)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。缩写：M30，识别胱天蛋白酶切割的细胞角蛋白18的单克隆抗体M30；INS，胰岛素，IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图31：糖尿病小鼠中外-TMEM219处理(130ng/ml)拯救(rescues)血清胰岛素(A,C)和血糖水平(B)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
图32：工作假设。缩写：IGFBP3，胰岛素样生长结合蛋白3；IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGF-IR，胰岛素样生长因子1受体。
具体实施方式
实施例1
材料和方法
注册在胰肾联合移植(SPK)候补名单的60个患有长期T1D(T1D+ESRD)的个体参加了本研究，并且与年龄和性别匹配的20个健康对象(CTRL)进行比较。胃肠道症状、肠运动性和肠粘膜病理学的评估定义了DE。根据CoSC特定标志物的表达在结肠纯化的隐窝上鉴定CoSC(流式细胞术、RT-PCR、Western印迹、转录组概况)。通过评价体外成熟迷你肠道的％并通过在不同条件下表征其细胞谱系的表达来评估CoSCs自我更新性质(图15)。使用广泛的血清蛋白质组以检测可能调控CoSC的循环因子，并且然后在体外迷你肠道试验中检测候选因子(图16)。具体的方法和统计分析如下所述。该研究经意大利米兰圣拉斐尔医院住院和护理研究所(Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico Ospedale SanRaffaele)的机构审查委员会批准(肠病-胰肾移植/01Secchi/Fiorina)。
患者和研究设计
60个注册在胰肾联合移植(SPK)候补名单上患有T1D+ESRD且符合年龄(41至43岁)、性别和T1D持续时间(29.4±1.8年)的个体参加了本研究。同样还研究了20个符合年龄和性别的健康对象(CTRL)，其具有正常的肾功能和正常的糖代谢参数。在参加本研究之时，T1D+ESRD对象都在接受强化胰岛素治疗，而并未向CTRL组给予任何药物。所有的T1D+ESRD对象接受如抗血小板疗法(ASA)和降血压(血管紧张素转换酶抑制剂)的相同治疗，而在参加该研究的时候，60中的40个个体接受他汀类药物。具有炎性肠病以及乳糜泻明显迹象的患者没有入选。
根据移植当时宏观外科评估，接受SPK(n＝30)或K+T1D(n＝30)移植后，对T1D+ESRD个体进行8年随访(平均随访:8.6±1.1年)。不包括口服抗凝剂的个体。在整个随访期间，SPK个体都是非胰岛素依赖型的，然而K+T1D个体是强化的皮下胰岛素治疗。所有对象在参加研究之前签署知情同意书。不包括在常规临床随访之中的研究被适当的机构审查委员会批准(肠病-胰肾移植/01Secchi/Fiorina)。
移植和免疫抑制
用于移植的组织通过“北意大利移植(North Italia Transplant)”器官获得联盟(NITp，米兰)从已故捐献者处获得。在用ATG(复宁(thymoglobulin)，IMTIX，赛达公司(SANGSTAT))诱导后，使用环孢菌素(通过在100-250ng/ml之间的水平)或FK506(通过在10-15ng/ml之间的水平)、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)(500-2000mg/天)和甲泼尼龙(10mg/天)维持免疫抑制。在移植后3-6个月内撤回类固醇。T1D+ESRD和SPK组的所有患者接受抗-血小板治疗(80％ASA和20％噻氯匹定)以防止移植物或瘘血栓形成。代谢状态、肾功能和血压在入选时检查，并在移植后每2年进行检查。使用肾脏疾病饮食的改变(Modification of Diet in Renal Disease，MDRD)计算估计的肾小球滤过率(eGFR)(Levey等,1999)。
胃肠道症状评定量(GSRS)
在健康对象，长期T1D个体(T1D+ESRD)和移植后2、4、8年的SPK和K+T1D组中通过GSRS表来评价胃肠道症状。胃肠道症状评定量(GSRS)包括具有由描述性集合定义的7个分级的李克特量表的15个项目组成的调查表(Svedlund等,1988)。该调查表最初被构造为基于面试的评定量表旨在评价范围广泛的胃肠道症状，并且后来被修改成为一个自填调查表。评分越高、症状越严重：评分的范围是从最小值1到最大值7。如果个体中断参加该研究，最后有效观测时的数值将在分析中继续进行。项目可以被分为之前根据因素分析的基础上鉴定的5个维度：腹痛综合症(3个项目)、回流综合症(2个项目)、消化不良综合症(4个项目)、腹泻综合症(3个项目)和便秘综合症(3个项目)。
肛门直肠测压
已有健康对象的肛门直肠测压的数据，并且将其与通过在长期T1D个体(T1D+ESRD)进行肛门直肠测压所获得的数据进行比较，所述肛门直肠测压使用定制设计、开放末端、14-Fr直径的PVC探针，其具有7个内腔和绑在探针尾部的4cm的乳胶气球(生物工程实验室公司(Bioengineering Laboratories Plc.)意大利米兰)(Carrington等,2014；Remes-Troche等,2010)。在10分钟磨合期后测量括约肌长度，在静息条件下记录肛门压力15分钟。指导对象尽可能紧地收紧肛门并持续尽可能长的时间，至少20秒。发明人的研究评价了如下项目：静息张力、收缩张力、反射响应和尿急响应。
病理学，免疫组织化学和电子显微镜
在健康对象，基线的长期T1D个体(T1D+ESRD)和移植后2、4、8年的SPK和K+T1D组中使用Welch Allyn光学乙状结肠范围(Welch Allyn optic sigmoid scope)进行结肠直肠内镜步骤。肠粘膜样品被固定在缓冲的福尔马林(甲醛4％w/v和醋酸盐缓冲液0.05M)中，并且在固体石腊中进行常规处理。用苏木精&曙红(H&E)对各入选病例的3μm厚的切片染色，用于形态学评价。对免疫组织化学，将3μm厚的切片安置在聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，脱蜡，并通过梯度的乙醇与水水合。通过将切片浸于650W微波炉中pH 6的0.01M柠檬酸盐缓冲剂10分钟进行抗原修复以及通过将切片浸于3％过氧化氢10分钟进行内源性过氧化物酶活性抑制后，在4℃进行18–20小时一抗的孵育，然后进行亲和素-生物素复合物过程(Hsu等,1981)。使用0.03％3,3’二氨基联苯胺四盐酸盐进行免疫反应，然后哈里斯苏木精复染切片。使用以下抗体：Ki67(单克隆，克隆MIB1，1:100稀释，美国加利福尼亚州卡皮特亚的大科细胞公司(Dako CytoMation,Carpinteria,California,USA))、醛脱氢酶(单克隆，克隆44/ALDH，1:1000稀释，美国新泽西州富兰克林湖的转导实验室公司(TransductionLaboratories,Franklin Lakes,NJ,USA))、EphB2(单克隆，克隆48CT12.6.4，1:200稀释，美国华盛顿州西雅图的LifeSpan生物科学公司(Lifespan Biosciences,Seattle,WA,USA))、LGR5(单克隆，克隆2A2，1:100稀释，美国马里兰州罗克维尔的OG技术公司(OrigeneTechnologies,Rockville,MD,USA))、hTERT(单克隆，克隆Y182，1:500稀释，美国马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore,Billerica,MA,USA))、肠高血糖素(多克隆，1:1250稀释，瑞典马尔摩的Milab公司(Milab,Malmo,Sweden))、胰腺多肽(多克隆，1:500稀释，美国加利福尼亚州贝尔蒙的半岛公司(Peninsula,Belmont,CA,USA))、PYY(多克隆，1:1000稀释，英国伯恩茅斯的生物发生公司(Biogenesis,Bournemouth,UK))、血清素(单克隆，克隆YC5，1:50稀释，生物发生公司)、生长抑素(多克隆，1:550稀释，大科公司)、IGF-I(多克隆，1:500稀释，阿柏堪穆公司(Abcam))和IGF-1R(多克隆，1:100，细胞信号转导技术公司(CellSignaling Technologies))，(Fiorina等,2003)。对于超微结构研究，将样品在含2％多聚甲醛和2％戊二醛混合物的0.05M甲砷酸盐缓冲液，pH 7.3中以4℃固定2小时。然后在1％四氧化锇以室温固定1小时，然后脱水并包埋于Epon-环氧树脂(Epon-Araldite)。用金刚石刀切割超薄切片，并安置于200目镍网格，之前用福尔瓦(Formvar)膜包被。超薄切片用含水铀酰醋酸盐和雷诺式(Reynold’s)柠檬酸铅溶液染色，并且随后用飞利浦莫尔加尼(Philips Morgagni)268D电子显微镜检查。根据神经内分泌囊泡的数量(n>3和n<3)对病例进行分组，用于统计学分析。对于隐窝分离，在包含抗生素混合物的样品中收集组织，并如下一段中所述进行处理。将EphB2的免疫染色强度以1(对各区域各隐窝较少细胞阳性的阴性EphB2梯度)至5(在所有纵向隐窝中强EphB2梯度)分级。抗-IGFBP3一抗(多克隆，1:50稀释，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))在来自1型糖尿病患者的肝活检中进行免疫组织化学测试。将无病理学发现的肝活检用作对照。所有这些组织样品来自存储于意大利帕尔马的帕尔马大学的生物医学、生物技术和转化科学院的病理学系(Unit of Pathologyof the Department of Biomedical,Biotechnological,and Translational Sciences,University of Parma,Parma,Italy)的文件。免疫染色强度以1(轻度)、2(中度)、和3(强)分级，而其扩散以1(病灶)、2(区域)、和3(扩散)分级。
免疫荧光
获得自肝活检的免疫荧光样品使用有63x油浸物镜的共聚焦系统(整合有Axiovert 200M倒置显微镜的LSM 510Meta扫描头；德国耶拿卡尔蔡司(Carl Zeiss,Jena,Germany))进行观察。使用连续和独立光通路在多轨模式下获得图像。使用以下一抗：兔IGFBP3(1:10，西格玛(Sigma))小鼠Hep Par-1(1:20，单克隆，大科公司)、小鼠CD163(1:10，克隆MRQ26，CellMarque)。
与/不与IGFBP3、与/不与长期T1D血清+高葡萄糖(35mM葡萄糖)共培养的迷你肠道以及由T1D+ESRD个体获得的那些迷你肠道经波形蛋白、细胞角蛋白20、醛脱氢酶和突触泡蛋白染色，用于免疫荧光分析以评估细胞谱系标志物的表达(图15：A1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D4、E1-E4)。使用以下一抗：小鼠波形蛋白(1:80，单克隆，克隆：V9大科公司)小鼠醛(1:1000，单克隆，克隆：44，BD公司)，小鼠细胞角蛋白20(1:100，单克隆，克隆：Ks20.8，大科公司)和突触泡蛋白(1:100，单克隆，克隆：syn88,生物基因公司(Biogenex))。
原位杂交
根据标准方法将人结肠粘膜石蜡切片去石蜡并再水化。室温使用0.2M HCl处理切片15分钟后，PBS中洗涤3次并在蛋白酶K(PBS中30μg/ml)中孵育15分钟。将含0.2％甘氨酸的PBS加入1分钟，从而中和蛋白酶K活性，并且在PBS中洗涤样品两次。室温下在4％PFA中进行10分钟的后固定并在PBS中洗涤3次后，通过将样品在包含1.5％三乙醇胺、0.15％HCl和0.6％乙酸酐的水溶液中进行两次5分钟的孵育实现组蛋白乙酰化。然后洗涤样品，并在杂交溶液(50％甲酰胺、5XSSC,pH4.5、2％阻断试剂(罗氏公司(Roche))、0.05％CHAPS(西格玛公司)、5mMEDTA、50μg/ml肝素(西格玛公司)和50μg/ml酵母RNA中以68℃进行1小时的预杂交。对于TMEM219，将地高辛标记的探针在杂交溶液中稀释750ng/ml并在65℃孵育24小时。在50％甲酰胺/2XSSC中以65℃进行3次20分钟后杂交洗涤。在TBS-T缓冲液(0.1M TrisHClpH7.5、0.15M NaCl、0.1％吐温20)中漂洗切片，并在阻断溶液(含0.5％阻断试剂、10％山羊血清的TBS-T)中在室温进行30分钟的阻断。山羊抗-DIG抗体(Fab片段，罗氏公司)在阻断溶液中1/2000稀释，并在4℃过夜孵育。之后，在TBS-T中洗涤样品，然后在NTM缓冲液(0.1MTris pH9.5、0.1M NaCl、0.05M MgCl2)中洗涤，并在NBT/BCIP溶液(罗氏公司)显色24小时。
CoSC表征
隐窝纯化
将肌肉层和黏膜下层小心地从人新鲜直肠活检样品移除，将粘膜与抗生素混合物(Normocin，[美国加利福尼亚州92121圣地亚哥的英杰公司(Invivogen)]，庆大霉素[美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司]和两性霉素[英杰公司])在室温(RT)孵育15分钟。然后，将组织切成小块并在RT用10mM二硫苏糖醇(DTT)(美国密苏里州63103圣路易斯的西格玛公司)在PBS中进行5分钟孵育2-3次。然后将样品转移至含8mM EDTA的PBS中，并且在4℃缓慢地旋转60-75分钟。将上清液换成新鲜的PBS，并且剧烈摇晃样品得到富含结肠隐窝的上清液。添加胎牛血清(FBS，西格玛公司)至终浓度5％，并且为了移除单细胞，以40×g对组分进行2分钟的离心。用补充了2mM GlutaMax(英杰公司)、10mM HEPES(西格玛公司)和5％FBS(西格玛公司)的先进DMEM/F12(ADF，吉布可公司(Gibco))培养基重复该洗涤步骤3次。
200-300个分离的人结肠隐窝单元与50μl基质凝胶混合，并如所述铺板在预热的24孔培养皿。固化后(15-20分钟，37℃)，用600μl完全隐窝培养基[Wnt3a条件培养基和先进DMEM/F12(纽约州格兰德岛的生命技术公司(LifeTechnologies))50:50，补充有谷氨酰胺、10mM HEPES、N-2[1×]、无视黄酸的B-27[1×]、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰-L-半胱氨酸、50ng/ml人EGF(纽约州格兰德岛的生命技术公司)、1μg/ml RSPO1(中国北京的义翘神州生物技术公司(Sino Biological)、100ng/ml人头蛋白(美国新泽西州洛基山脉的派罗科技公司(Peprotech))、1μg/ml胃泌素(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)\500nM LY2157299(荷兰格罗宁根Axon MedChem公司)、10μMSB202190(西格玛公司)和0.01μM PGE2(西格玛公司)]覆盖隐窝。每隔一天更换培养基。最初2-3天将Rock抑制剂Y-27632(10μM，西格玛公司)加入培养物。直接培养纯化的隐窝8天。在迷你肠道和在EphB2+和EphB2-分选的单细胞中用RT-PCR通过测试CHGA、KRT20和EPCAM(纽约州格兰德岛的生命技术公司)评估肠细胞和内分泌细胞的细胞谱系标志物。在新鲜分离的隐窝上评价集落形成效率(％)以便排除活检过程和分离处理可能使得新鲜分离的隐窝在体外培养中形成迷你肠道的效率受损。进行DAPI染色，以确认由CTRL和T1D+ESRD对象新鲜分离的隐窝中核的数量。对有至少1个隐窝域的成熟迷你肠道同样计数，并计算其百分比，以便为测量成熟的迷你肠道添加更加定量的标准(图17：A-P)。长期T1D(T1D+ESRD)和CTRL血清测量的胰岛素和葡萄糖水平如下：
葡萄糖水平(T1D+ESRD比CTRL，178±47.5比90±5.5mg/dl，p0.0001)；
胰岛素水平(T1D+ESRD比CTRL，12.9±4.6比5.8±1.6μIU/ml，p＝0.009)。
流式细胞术
通过流式细胞术将CD45阳性细胞和CD11b阳性细胞(V450抗-人CD45和CD11b，美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)去除以确定CoSC标志物EphB2(APC抗-人EphB2抗体，明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和LGR5(PE抗-人LGR5，马里兰州罗克维尔的(OG技术公司))的表达。将碘化丙啶(PI)(10μg/ml)加入，以去除死细胞。同样还通过流式细胞术分选EphB2+细胞，以获得用于培养目的的单细胞悬浮液。人端粒酶逆转录酶(hTERT)的细胞内检测是通过透化细胞并用抗-人hTERT一抗(美国加利福尼亚州爱尔文的GeneTex公司)染色，然后用DAPI抗-山羊二抗(生命科技公司)染色来进行。对于分析，在评估其它表面或细胞内标志物之前，首先以PI-对所有细胞进行门选。样品在BDLSR-Fortessa上运行，并通过FSC Express 3.0(美国加利福尼亚州洛杉矶DeNovo软件公司(DeNovo Software))分析。
体外迷你肠道生成研究
由健康对象直肠活检样品中分离隐窝，然后如之前所述培养以生成迷你肠道。为了创造高血糖条件，通过加入不同浓度的葡萄糖(35mM：高葡萄糖；5mM：正常葡萄糖)来改变培养基。为了模拟尿毒症条件，将由ESRD的长期T1D个体获得的尿毒症血清添加到隐窝，将其如在培养方法部分所报道的进行培养。8天后，收集隐窝，然后使用RT-PCR检验形态学、迷你肠道生长、肠标志物(EphB2、LGR5、h-TERT)、IGF-IR和TMEM219(Life Technologies)的表达和胱天蛋白酶9(生命科学公司)。在迷你肠道中体外使用全-胱天蛋白酶抑制剂(胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK，20mM，威斯康星州麦迪逊普罗麦格(Promega))、胱天蛋白酶8选择性抑制剂(Z-IETD-FMK，BD法敏进公司(BD Pharmingen))、胱天蛋白酶9选择性抑制剂(Z-LEHD-FMK，BD法敏进公司)、胱天蛋白酶3抑制剂Z-DEVD-FMK(BD法敏进公司)，以确认IGFBP3的抗凋亡作用。
为了将分离的隐窝与包含健康对象人血清(即，CTRL血清)的隐窝培养基在常规FBS中培养，L-Wnt3细胞在10％CTRL血清中生长以生成条件培养基，之后以50:50添加至先进DMEM/F12，以便获得如前所述的隐窝培养基(参见，隐窝纯化)。
为了评估生成的迷你肠道中分选的EphB2+细胞的性质，将2000个分选的细胞与50μl基质胶混合，并铺板在预热的24孔培养皿。基质胶固化后(10-15分钟，37℃)，用“单细胞生长培养基：(＝完全隐窝培养基+10M Rock抑制剂Y-27623)覆盖细胞。用新鲜的单细胞生长培养基每隔一天更换培养基。在第7至9天，培养基中包括Rock抑制剂。
免疫印迹。
在利姆里(Laemmli)缓冲液(Tris–HCl 62.5mmol/l,pH 6.8,20％甘油,2％SDS,5％β-巯基乙醇)中提取肠活检样品的总蛋白质，并且测量它们的浓度(Lowry等,1951)。35μg总蛋白质在7％SDS-PAGE凝胶上电泳，并印迹至硝化纤维(德国达塞尔的施莱些许尔公司(Schleicher&Schüll))。然后用丽春红S(Ponceau S)染色印迹。将膜在TBS(Tris[10mmol/l],NaCl[150mmol/l])、0.1％吐温-20、5％脱脂奶粉，pH 7.4中在25℃封闭1小时，用200mg/ml在TBS–5％乳液中以1:200稀释的多克隆抗-山羊EphB2抗体或多克隆抗-山羊LGR5抗体(美国加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))或单克隆IGF-IR(圣克鲁兹生物技术公司)和多克隆TMEM219(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D公司)或用1:1000稀释的单克隆小时抗-β-肌动蛋白抗体(圣克鲁兹生物技术公司)4℃孵育12小时，用TBS–0.1％吐温-20洗涤4次，然后用在TBS–5％乳液中以1:1000稀释的过氧化物酶标记的兔抗-山羊IgG二抗(或β-肌动蛋白的兔抗鼠)(圣克鲁兹生物技术公司)孵育，并最终用TBS–0.1％吐温-20洗涤。使用增强化学发光法(SuperSignal；美国伊利诺州洛克福德的皮尔斯公司(Pierce))将获得的条带可视化。
肠隐窝生长的实时成像
通过纯化和培养CTRL,T1D+ESRD和SPK个体的肠隐窝获得的迷你肠道的成像在配置有环境控制的蔡司Axiovert S100(来自意大利的Oko-Lab)上进行，其中环境控制具有被注入由5％CO2和95％空气组成的加湿预混合气体的腔室，并且整个步骤被设定在37℃。成像以20分钟的间隔捕获采集72小时。使用Time Lapse(意大利的Oko-Lab)采集并处理成像，并且如果必要，使用Adobe Photoshop Elements7.0进行成像编辑。
形态学成像分析
迷你肠道的成像通过倒置显微镜Leica DH/RB在第0、5和8天拍摄并通过AxioVision AC Release 4.3获得。附图中报道的图片表示第5天的迷你肠道，10X放大。
转录组概况
用RNeasy迷你试剂盒(加州瓦伦西亚的凯杰公司)和柱上的DNA酶消化从纯化的肠隐窝悬浮液分离总RNA。然后，使用RT2第一链试剂盒(C-03；马里兰州福德里克的SA生物科学公司(SABioscience))逆转录来自各样品的3μg总RNA。发明人使用人干细胞RT2ProfilerPCR阵列(PAHS-405Z)、人干细胞信号转导PCR阵列(PAHS-047Z,)和具有如下基因的定制阵列：AXIN2、OLFM4、BMI1、RNF43、CDCA7、SLC12A2、CDK6、SOX9、DKC1、ZNRF3、ETS2、EPHB2、FAM84A、LGR5、GPX2、ACTB(SA生物科学公司)。Profiler PCR阵列使用基于SYBR绿的实时PCR定量测量一组基因的表达(Kosinski等,2007)。为了评估细胞凋亡标志物和氧化应激标志物的转录组概况，使用了人细胞凋亡PCR阵列(PAHS-012Z，SA生物科学公司)和人氧化应激PCR阵列(PAHS-065Z，SA生物科学公司)。
qRT-PCR分析
使用Trizol试剂(英杰公司)提取来自纯化的肠隐窝的RNA，并且按照生产商的说明使用TaqMan试验(纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies))进行qRT-PCR分析。使用ΔΔCt方法确定标准化的表达值。用ACTB的表达标准化定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)数据，并且计算ΔΔCt值。统计分析经由单相ANOVA比较各患者的所有细胞群的基因表达，然后进行邦弗朗尼后测试(Bonferroni post-test)，用于感兴趣的群和所有其它群之间的多重比较。统计分析还通过使用软件可及的RT2profiler PCR阵列数据分析(凯杰公司)。对于两组比较，使用斯氏t检验。分析在新鲜的隐窝分离后和/或迷你肠道培养8天后一式三份进行。表I-B报道了使用的引物的主要特征。
表I-B：引物
基因符号 UniGene# Refseq登录# 条带尺寸(bp) 参照位置
LGR5 Hs.658889 NM_003667 91 1665
EPHB2 Hs.523329 NM_004442 68 2908
TERT Hs.492203 NM_198253 106 1072
ACTB Hs.520640 NM_001101 174 730
IGF-IR Hs.643120 NM_000875.3 64 2248
TMEM219 Hs.460574 NM_001083613.1 60 726
KRT20 Hs.84905 NM_019010.2 75 974
CHGA Hs.150793 NM_001275.3 115 521
EpcaM Hs.542050 NM_002354.2 95 784
LRP1 Hs.162757 NM_002332.2 64 656
TGFbR1 Hs.494622 NM_001130916.1 73 646
TGFbR2 Hs.604277 NM_001024847.2 70 1981
胱天蛋白酶8 Hs.599762 NM_001080124.1 124 648
胱天蛋白酶9 Hs.329502 NM_001229.4 143 1405
ELISA试验
所有组的对象的汇集血清/血浆中IGF-I和IGFBP3水平以及所有处理和未处理小鼠组的汇集血清/血浆中IGF-I和IGFBP3水平使用市售ELISA试剂盒，根据生产商的说明(R&D公司和西格玛公司)进行评估。
人永生化肝癌细胞系HuH-7在DMEM 10％FBS中以不同的葡萄糖浓度培养5天，所述不同的葡萄糖浓度为：5.5mM、20mM和35.5mM。收集培养上清液，使用IGFBP3ELISA试剂盒(西格玛公司)按照生产商的说明评估IGFBP3。收集的细胞通过胰蛋白酶分离，并用血细胞计数器计数。
用微粒子酶免疫测定(Mercodia Iso-胰岛素ELISA)以3.0％和5.0％的试验内和试验间变异系数(CV)测定胰岛素水平。
重组蛋白和干预性研究
将重组人IGF-I(西格玛公司，I3769)，(IGF-I)，重组人IGFBP3(生命科技公司，10430H07H5)，(IGFBP3)，和抗-IGF-IR(波士顿的赛力克化学公司(Selleckchem)，OSI-906)在分离的+2天加入隐窝培养物。将IGFBP3(纽约州沃利卡特其的Reprokine(Reprokine,Valley Cottage,NY))以0.3mg/小鼠/天向原初和STZ处理的B6小鼠给予15天；将IGF-I(Reprokine)和外TMEM219体内给予糖尿病2周后STZ处理的B6小鼠，分别以5μg/小鼠/天进行20天和100μg/小鼠/天进行15天的剂量。
在体外迷你肠道试验中测试的以及在由分离+2天时加到隐窝培养物的其它分子是：脂联素(R&D公司)、胸腺素β4(阿柏堪穆公司)、C-反应蛋白(默克密理博公司)、胱抑素C(Cystatin C，细胞信号转导技术公司)、嗜铬粒蛋白A(生命科技公司)、果糖-二磷酸醛缩酶(Novoprotein公司)、骨桥蛋白(R&D公司)、核糖核酸酶胰(RNASE，Novoprotein公司)、血清淀粉样A蛋白(阿柏堪穆公司)、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1(MASP1，Novoprotein公司)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，R&D公司)、FaS配体(FasL，R&D公司)。过氧化氢(H2O2,50μM)同样在迷你肠道试验中测试。
重组人外TMEM219的生成
重组人外-TMEM219使用大肠杆菌作为合成表达宿主生成。简言之，获得细胞外TMEM219的基因序列：
THRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR(SEQ ID No.2)。
胞外TMEM219的DNA序列被克隆进包含lac启动子的高拷贝数质粒，然后将其转化到细菌大肠杆菌中。IPTG(乳糖类似物)的添加活化lac启动子，并且引起细菌表达胞外TMEM219(外TMEM219)。使用SDS-PAGE和Western印迹以确认纯度高于90％。新生成的蛋白质重组人外TMEM219的分子量是80kda。
如前述分离并培养来自健康对象的隐窝，并且相较于使用的IGFBP3浓度(2:1、1:1和1:2)，将外-TMEM219以3个浓度(260ng/ml、130ng/ml和75ng/ml)添加到培养物中，并且对各浓度设立适当的对照。8天培养后，进一步评估胱天蛋白酶8和9表达、CoSCSC特征标志物(EphB2和LGR5)表达、成熟的迷你肠道数量。
小RNA干扰
从健康对象获得的分离的隐窝在完全培养基中和如前所述，通过添加高葡萄糖和长期T1D血清修饰的培养基中生长以在体外生成迷你肠道。使得隐窝恢复的72小时培养后，750ng的小干扰RNA(siRNA；Flexitube siRNA SI04381013，加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司)在100μl含6μl HiPerFect转染试剂(凯杰公司)的无血清培养基中以室温孵育，从而允许转染复合物形成。隐窝与这些转染复合物在其正常生长条件下孵育6小时。基因沉默的分析在24、48和72小时时通过评估正常迷你肠道发育的百分比进行。将对照siRNA用作阴性对照，以确认基因沉默的效果。
蛋白质组分析
来自各组10个患者的8μl的汇集血清使用ProteoPrep 20离心柱(西格玛公司)消耗，从而允许移除20种高丰度蛋白质。根据生产商的说明，重复该过程两次，从而获得～99％的消耗。按照标准使用直接检测IR分光光度计(Direct Detect IRspectrophotometer)和BSA对回收的上清液进行分析以确定总蛋白质浓度。为了获得足够的蛋白质用于蛋白质组分析，按照如上所述对各库的32μl进行处理。如文献中报道(Wisniewski等,2009)，使用滤纸收集样品(FASP)方法将来自各样品的40μg总蛋白质在溶液中消化。使用C18自制尖柱(C18Empore膜，3M公司)对样品进行脱盐，并注射到毛细管色谱系统(EasyLC,Proxeon生物系统公司(Proxeon Biosystems)，热科学公司(ThermoScientific))。在填充了3μm ReproSil Pur 120C18-AQ的自制25cm反相喷涂熔融石英毛细管柱上进行肽分离。使用洗脱液A(纯水与2％v/v CAN、0.5％v/v醋酸)和B(ACN与20％v/v纯水与0.5％v/v醋酸)的梯度以实现分离(0.15μL/分钟流速)(230分钟内从10至35％B、5分钟内从35至50％B以及30分钟内从50至70％B)。使用装配有纳米电喷雾离子源(Proxeon生物系统公司)的LTQ-Orbitrap质谱仪(马萨诸塞州沃特汉姆市的热科学公司)进行质谱分析。采用锁定质量(lock-mass)选项以及设置为60,000的分辨率获得全扫描质谱。各样品的获得质量范围是m/z 300至1750Da。选择10个最强的双电荷离子和三电荷离子，并使用标准化的碰撞能量37％在离子陷阱中将其分段。已经为MS/MS选择的目标离子被动态排除120秒。使用Mascot(v.2.2.07，英国伦敦Matrix科学公司(Matrix Science))搜索引擎对所用的MS/MS样品进行分析，以寻找UniProt_人类完整的蛋白质组_cp_hum_2013_12(UniProt_Human Complete Proteome_cp_hum_2013_12)。搜索这样进行：胰蛋白酶特异性，允许2个错误切割，半胱氨酸脲甲基作为固定修饰，蛋白N-末端乙酰化和甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。前体和片段离子的质量公差分别设置为5ppm和0.6Da。为了定量蛋白质，将原始数据上传至MaxQuant软件版本1.3.0.5(Cox,2011)。无标记蛋白质定量是基于前体的强度。接受具有FDR小于1％的肽和蛋白质，各蛋白质最低两个肽。实验在技术上一式三份进行。通过蛋白质学分析(表I-C)获得的蛋白质的完整数据集通过使用MeV软件v.4_8_1的斯氏t-检验分析。对照库中相较于T1D-ESDR库中显著差异(p值<0.01)的47个蛋白质进一步提交进行分级聚类分析。
表I-C.通过蛋白质组分析鉴定的定量的蛋白质列表。该表格报告了通过蛋白质组分析检测到的蛋白质名称和数量之间的对应性，并且以热图在图10中示出。
选择候选蛋白质的策略
在长期T1D对象和健康对照中分别分离的46个因子中，发明人首先选择了在比较两组的LFQ强度中具有更显著差异的那些(p>0.005)，这导致12个因子被排除(图16)。其次，发明人通过研究已报道的研究和本领域的出版物评价了改变的因子是否可能与肠道病症和/或糖尿病的发展相关联。这使得我们排除了其它12个因子。发明人还排除了那些主要涉及淋巴室(lymphoid compartment)的因子(n＝5)。发明人最终剩余17个因子。发明人排除了细胞膜蛋白(n＝4)并且在迷你肠道试验中对余下的(n＝13)进行测试。两个因子无法在体外进行测试。发明人一共测试了n＝11个蛋白质。
动物研究
C57BL/6(B6)小鼠由缅因州巴港的杰克逊实验室获得。所有小鼠按照哈佛医学院实验动物管理和使用委员会批准机构准则饲养和使用。用链脲菌素注射(225mg/kg，腹膜内给予；西格玛公司)使小鼠患糖尿病。糖尿病被定义为3个连续测量的血糖水平>250mg/dL。糖尿病肠病如下进行评估：简言之，从处死小鼠提取整个肠脏，并用PBS冲洗。然后将结肠的末端部分(extreme part)切割并分成两片。结肠组织中的一片被直接浸没在福尔马林，而另一个被纵向切开，以暴露腔和内部粘膜，然后淹没在福尔马林之中。然后将组织石蜡包埋，并进行H&E和免疫染色处理。此外，同样切割结肠组织并如前述进行结肠肝细胞的分离(Merlos-Suarez等,2011)。简言之，将结肠切成2–4mm的片，然后将片段在30mL冰冷PBS中洗涤。将片段转移到包含预热的20mM EDTA-PBS的50ml离心管，并在37℃孵育30分钟。孵育后，将悬浮组织液转移到包含30ml冷PBS的离心管，并进行离心。隐窝在13ml冷DMEMF12中重悬，用PBS洗涤，并在5-10ml的胰蛋白酶/DNA酶溶液中以37℃进行30分钟消化。隐窝然后在DMEMF12/EDTA中重悬，在40微米的过滤器中过滤两次并洗涤。最终，隐窝在流动培养基(DMEM+FBS+EDTA)中重悬，并针对抗EphB2-APC(R&D公司)、小鼠抗-CD45-PeRCP和小鼠抗-CD11b-PE(BD法敏进公司)染色。使用FACSCalibur分析仪运行样品，并用FlowJo分析数据。
将部分组织极速冷冻并储存在Tryzol中以进行针对以下标志物的RT-PCR研究：
基因符号: UniGene#: Refseq登录#: 条带尺寸(bp): 参照位置:
LGR5 Mm.42103 NM_010195.2 64 571
EPHB2 Mm.250981 NM_010142.2 85 1696
Casp8 Mm.336851 NM_001080126.1 96 1525
Casp9 Mm.88829 NM_001277932.1 68 377
GAPDH Mm.304088 NM_008084.2 107 75
最终，收集血浆和血清以进行IGF-I(IGF-I ELISA试剂盒，R&D公司)、IGFBP3(IGFBP3 ELISA试剂盒，R&D公司)和胰岛素水平(Mercodia小鼠胰岛素ELISA试剂盒)分析。一周两次对血糖进行8周的监测，以确定糖尿病发病和持续性。
统计学分析
数据以平均值和平均值的标准误差(SEM)表示，并且用柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)测试其正态分布，以及用列文氏检验(Levene’s test)测试其同方差性。用双尾的t-检验和卡方(χ2)检验来测试统计学上显著的差异。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定。对于多重比较，使用Bonferroni校正的ANOVA检验。将所有数据输入社会科学统计软件包(伊利诺伊州芝加哥SPSS有限公司)并进行分析。使用GraphPad Prism 5.0(加利福尼亚州拉由拉市的格拉夫派得(GraphPad)软件公司)生成图表。所有的统计学检验在5％显著性水平进行。
结论
肠功能失调和临床症状出现在长期T1D中
发明人在患有长期T1D和末期肾病个体(T1D+ESRD)和健康对象(CTRL)的群中首次表征了肠形态和功能。通过使用胃肠道症状评定量(GSRS)调查问卷进行评估，在T1D+ESRD个体中证实了7个肠道症状，如腹泻、腹痛、便秘(图1：A-C)。症状与肛门直肠括约肌功能异常相关联(图1：D-F)。相较于健康对象，有T1D+ESRD个体的肠黏膜被改变，其具有较低数量的隐窝，失真和固有层的硬化(图1：G1-G2,H)。观察到由Ki67(MIB1抗体)染色(图1：I1-I2,J)评估的上皮细胞增殖的显著减少，神经变性的信号(图1：K1-K2,L)和肠神经内分泌细胞中血清素表达的降低(图1：M1-M2,N)，这确认了在这些个体中DE的存在。
CoSC在长期T1D中被改变
结肠隐窝的表征显示，相较于健康对象，T1D+ESRD个体中，局部干细胞的两种标志物(Carpentino等,2009；Jung等,2011)，EphB2+表达和醛脱氢酶(Aldh)+免疫反应细胞数量的显著减少(图1:O1-O2,P,Q1-Q2,R)。在以FACS分析对PI-细胞门选后(图8：A-C)，相较于健康个体，由获得自T1D+ESRD个体的肠隐窝分离的EphB2高,EphB2高+LGR5+和EphB2+h-TERT+细胞的百分比出现了显著的降低(图2：A-B,C-E,图8:D-E)，并通过RT-PCR(图2：F-H)和western印迹(WB)分析(图8F)确认。相较于Notch途径(Notch1和2，JAG1，Dll1，Sox1和2)、Wnt途径(APC，FZD1，DKC1，ETS2，FAM84A，GPX2，RNF43)和BMP途径(BMP1，BMP2，BMP3)基因在健康对象中的表达，获得自T1D+ESRD的隐窝的转录组概况证明Notch途径(Notch1和2，JAG1，Dll1，Sox1和2)、Wnt途径(APC，FZD1，DKC1，ETS2，FAM84A，GPX2，RNF43)和BMP途径(BMP1，BMP2，BMP3)基因表达的降低，而其是先前已知的控制CoSC的途径(图8G和表II)。
表II.通过转录组概况鉴定的CTRL相对于T1D+ESRD新鲜分离的结肠隐窝中上调和下调干细胞靶基因的列表(至少p<0.05)。
-CoSC特征基因的分析显示，相较于健康对象，LGR5、EphB2(Gracz等,2013；Merlos-Suarez等,2011)、h-TERT(Breault等,2008)和其它肠干细胞标志物基因(Hughes等,2011；Munoz等,2012；Ziskin等,2013)在T1D+ESRD中显著地低表达(图2I)，这证明CoSC在患有DE的个体中被改变。
迷你肠道的体外生成在长期T1D中被改变
为了评价CoSC自我更新性质，发明人使用了体外迷你肠道试验。事实上，相较于健康对象，尽管在两组中形成迷你肠道的效率(图8J)和活力(图8：H-I)相当，分离自T1D+ESRD个体并体外培养8天的隐窝形成了无法生长的小球体迷你肠道(图2：J1,J2,K)。为了开始说明循环因子和高葡萄糖对CoSC的影响，发明人将由获得自健康对象的分离的肠隐窝在具有/不具有获得自长期T1D个体的血清的高葡萄糖中体外培养8天(图2：L1-L4，M)。高葡萄糖部分阻止完全成熟的迷你肠道的生成，并且与长期T1D个体的血清协同增强CoSC自我更新性质的改变，因此迷你肠道出现崩塌(collapse)(图2：L2-L4)。基因表达的分析还显示，CoSC特征的改变(图2N)，因此表明高血糖和循环因子共同作用以改变CoSC在长期T1D中的再生性质。
血清无偏蛋白质组概况显示长期T1D中IGFBP3水平的增加
为了鉴定可以作为向肠(enterotrophic)激素和可以在调整CoSC中具有作用的潜在循环因子，发明人使用无偏蛋白质组阵列比较了健康对象与T1D+ESRD个体的血清蛋白质组。相较于健康对象，在T1D+ESRD个体中显示了清晰的蛋白质组概况，其中具有超过50％检测的蛋白质在一个组或另一个组中分离(图3A)。一些蛋白质与糖尿病相关联，并且一些是生长因子或干细胞相关的蛋白质或可能涉及肠功能(图3A)。具体而言，相较于健康对象，IGF-I结合蛋白(IGFBP2和3)的水平可以在长期T1D个体中检测，其中IGFBP3增加将近5倍(图3B)，而IGFBP1、4、5和6仍然几乎检测不到。有趣的是，相较于健康对象，在患有长期T1D个体的肝脏中，肝细胞，而不是枯否细胞，表现出较高的IGFBP3免疫组织化学表达(图3：C1-C2，图8：K,L1-L6)，这表明IGFBP3肝合成和释放的增加。高葡萄糖对于IGFBP3肝释放的作用通过在暴露于高葡萄糖的人永生化肝细胞上清液中检测增加的IGFBP3水平确认(图3D)。最终，相较于健康对象，游离IGF-I的血清水平在长期T1D中出现显著地降低(图3E)，这表明循环IGF-I和IGFBP3水平在长期T1D中被改变。
外周IGFBP3和IGF-I控制CoSC
为了进一步说明循环IGF-I和IGFBP3在调整CoSC和肠上皮细胞增殖中的作用，发明人使用RT-PCR和WB(图3：F、H，图8M)证明了在分离的隐窝上IGF-IR和IGFBP3受体(TMEM219)的表达(图3：F、H，图8：M、N1-N2)，并用免疫染色确认CoSC上IGF-IR的表达(图8：N1-N2)，以及用原位杂交确认TMEM219的表达(图3：G1-G2)。为了机械地确认IGF-I和IGFBP3在CoSC上的作用，发明人测试了通过蛋白质组概况鉴定的几个分子在其体外迷你肠道试验中的作用。发明人选择潜在靶标的策略在补充信息中报告。通过将重组人IGF-I(IGF-I)添加至培养基中拯救由获得自T1D+ESRD个体的肠样品生成的严重改变的迷你肠道(图3I)，而重组人IGFBP3(IGFBP3)的添加导致用IGF-I观察到的正面效果消失，其使得迷你肠道的成熟减少并且增加崩塌和扭曲类器官的形成(图3I)。因为最近IGFBP3已经显示出通过IGFBP3受体(TMEM219)(Baxter,2013)独立于IGF-I作用(Williams等,2007)，有必要阐明是否IGFBP3通过结合IGF-I又或是通过直接靶向CoSC上的TMEM219发挥其在CoSC上的作用。通过证明获得自健康对象和长期T1D个体并用IGFBP3培养的迷你肠道中胱天蛋白酶8和9表达的增加，发明人首先证明IGFBP3对CoSC具有直接促凋亡作用(图3J，图9：A-B)，而添加全胱天蛋白酶抑制剂(Z-VAD-FMK)或添加胱天蛋白酶8和9的选择性抑制剂，但是不添加其它胱天蛋白酶级联抑制剂(胱天蛋白酶3抑制剂)使得IGFBP3作用被消除(图3K)。发明人其后证明IGF-I的添加并未拯救获得自健康对象并暴露于IGFBP3的迷你肠道的发育(图3L)，这确认了IGFBP3可以通过直接和间接IGF-I机制作用。有趣的是，高葡萄糖独自无法完全破坏迷你肠道生长，并且抗-IGF-IR并不使由健康对象形成的迷你肠道的生长和形态学恶化(图3L)。向由健康对象生成但是并未用高葡萄糖和来自长期T1D个体的血清培养的迷你肠道中添加IGF-1拯救了迷你肠道的形态，而当IGFBP3添加到迷你肠道培养物中时，其使得IGF-I的正面效果消除(图3L)。有趣的是，在培养获得自长期T1D的隐窝中使用健康对象“CTRL”血清几乎恢复了迷你肠道发育/形态，这表明循环因子，并且具体的是IGF-I/IGFBP3二分体控制CoSC(图9：C-D)。发明人然后通过在获得自健康对象的迷你肠道中体外使用siRNA遗传调整了TMEM219表达。尽管添加了IGFBP3和高葡萄糖以及长期T1D血清，迷你肠道中TMEM219的敲减保留其生长和自我更新的能力(图3M)。通过SiRNA阻断TMEM219以及通过阻断抗体阻断IGF-IR的同时阻断(Concomitant blockade)并未在迷你肠道发育导致任何额外的有益效果，尽管使用了来自健康对象和来自长期T1D的血清(图9E)。
对在长期T1D个体的血清蛋白质组中表现出改变的其它循环蛋白质在体外迷你肠道试验中进行测试，并且并未在迷你肠道生长上表现出任何显著的作用(图9：F-G)。也对T1D中水平通常被改变且可以通过结合IGF-IR干扰IGF-I/IGFBP3二分体(图9H)的C-肽和胰岛素进行测试，并且没有显示出任何作用。
为了进一步确认IGF-I/IGFBP3二分体有效地靶向CoSC并且不止隐窝，发明人检测了其在单细胞衍生的迷你肠道上的作用。发明人由分离的隐窝流式分选EphB2+细胞，并确定TMEM219高度表达在其表面(图4A)。然后，发明人在体外单细胞衍生的迷你肠道试验中培养EphB2+细胞，并确认高葡萄糖和长期T1D血清暴露以及IGFBP3的添加显著地消除单细胞衍生的迷你肠道生长，因此概括了之前对于隐窝衍生的迷你肠道观测所报道的主要特征(图4B、图10：A1-A3)。此外，胱天蛋白酶8和9的表达在IGFBP3处理的迷你肠道中和在那些暴露于高葡萄糖和长期T1D血清的迷你肠道中被上调，而细胞增殖的标志物Ki67表达显著下降(图10:B-D)。
IGF-I/IGFBP3二分体在之前已知控制CoSC的途径上的作用
为了阐述IGF-I/IGFBP3二分体在之前已知涉及CoSC生态位功能(nichefunction)(即Wnt/Notch/BMP)上的作用，发明人由其干细胞转录组概况获得生态位(niche)特异性基因转录本的表达。IGF-I显著地恢复了与获得自T1D+ESRD的迷你肠道上Wnt/Notch信号转导通路相关联的一些因子的表达(图10E，表III)，而IGFBP3不充分地影响了获得自健康对象的迷你肠道和获得自T1D+ESRD迷你肠道中Wnt/Notch/BMP基因表达(图10F，表III)。
表III.通过转录组概况鉴定的获得自CTRL和T1D+ESRD并用/没有用IGFBP3和IGF-I培养的结肠隐窝中上调和下调的干细胞靶基因的列表(至少p<0.05)。
缩写：IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3，CTRL，健康对象，T1D，1型糖尿病，ESRD，末期肾病。
这不但确认了IGF-I保护了涉及Wnt/Notch/BMP信号转导的一些基因的表达，而且确认了IGFBP3独立地作用于CoSC，并且在其他之前已知的途径的关键靶向基因的表达中无主要改变。
IGF/IGFBP3二分体在CoSC中凋亡途径上的作用
为了阐述迷你肠道上IGFBP3胱天蛋白酶介导的作用所进行的广泛的转录组分析(图4：C-D，图10：G-H，表IV)显示添加IGFBP3到由健康对象隐窝生长的迷你肠道与胱天蛋白酶级联抑制剂(胱天蛋白酶8和9)以及促凋亡基因的显著上调相关联，而抗-凋亡基因Bcl2被下调(图4C)。
表IV.CTRL相对于T1D+ESRD新鲜分离的结肠隐窝中和那些用IGFBP3和IGF-I培养的隐窝中通过转录组概况鉴定的上调和下调的促/抗-凋亡靶基因的列表(至少p<0.05)。
缩写：IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3，CTRL，健康对象，T1D，1型糖尿病，ESRD，末期肾病。
有趣的是，相较于健康对象，在由T1D+ESRD隐窝生长的迷你肠道中抗-凋亡基因(Bcl2、Fas、Nol3)也被显著地低表达，而大部分胱天蛋白酶相关的基因(胱天蛋白酶1、5、7、8、9、14)被过表达(图10G)。此外，涉及其它促凋亡途径的基因的表达在T1D+ESRD迷你肠道中并没有被改变(即Fas配体、FADD、TNF)或被抑制(TRADD)。通过添加IGF-I，观测到相反的作用(图4D、图10H)。氧化应激靶基因表达中改变的缺失(表V)以及氧化应激因子作用的缺失(图10：I-J)确认主要凋亡相关的胱天蛋白酶介导的IGFBP3机制，借此，循环IGFBP3直接控制CoSC(图4E)。
表V.CTRL相对于T1D+ESRD新鲜分离的结肠隐窝中和那些用IGFBP3和IGF-I培养的隐窝中通过转录组概况鉴定的上调和下调的氧化应激靶基因的列表(至少p<0.05)。
缩写：IGF-I，胰岛素样生长因子1；IGFBP3，胰岛素样生长因子结合蛋白3，CTRL，健康对象，T1D，1型糖尿病，ESRD，末期肾病。
操控循环IGF-I/IGFBP3二分体轴在临床前模型中改变糖尿病肠病的进程
为了进一步证明IGF-I/IGFBP3循环因子体内的关联性，发明人测试了在DE临床前模型中IGF-I和IGFBP3给予的作用。8周化学诱导的糖尿病(使用链脲霉素[STZ])后，C57BL/6(B6)小鼠表现出结肠组织中隐窝数量的降低(图4F)，其中超过70％的病例中显示了增加的深度和宽度(图4：G、H1-H2、I)以及Aldh+细胞数量的降低(图4：J、K1-K2)。有趣的是，这些小鼠表现出增加的IGFBP3血清水平和低水平的IGF-I，相较于原初B6具有较低的鼠胰岛素水平(图11：A-C)。IGFBP3腹膜内(i.p.)给予原初B6小鼠导致局部隐窝数量的减少(图4：F、H3)，并且相较于未处理的小鼠，隐窝的大部分表现出增加的深度和宽度(图4：G、H3、I)以及Aldh+细胞显著的减少(图4：J、K3)。这些特征通过向STZ-处理的B6小鼠给予IGFBP3加重(图11：D-G、H1-H2)，并且具有体重下降(图11J)、CoSC缺失(图11：J-L)和胱天蛋白酶8和9表达的上调(图11：M-N)的证据。STZ-处理的B6小鼠中IGF-I的腹膜内给予只部分地改善粘膜形态，增加正常隐窝的数量，其仍然保持非正常(图11D)，并且只有部分恢复Aldh+细胞的数量(图11：G、H1-H2)。
胰肾联合移植(SPK)治疗长期T1D使得DE的临床和形态学特征恢复
长期T1D的金标准治疗是SPK，其提供了稳定的糖代谢控制、近标准化的风险因素以及延长存活(表VI)(Fiorina等,2004；Fiorina等,2005；Folli等,2010；Secchi等,1998；Smets等,1999)。
表VI.SPK中正常血糖和正常肾功能两者的恢复与相较于K+T1D，在长达8年的随访中糖/脂代谢和血压控制随时间保持稳定相关联(显示第8年随访的数据)。
参数 T1D+ESRD(n＝60) SPK(n＝30) K+T1D(n＝30) p值
eGFR(ml/分钟/1.73m2) <15 65.6±20.2* 61.8±25.2§ *,§<0.0001
HbA1c(％) 8.4±1.5 5.4±0.3* 7.5±1.4§ *<0.0001；§<0.001
EIR(UI) 37.4±2.3 0* 26.0±7.0§ *<0.0001；0.001
TG(mg/dl) 162.5±92.7 90.4±23.0* 147.1±98.0§ *0.01；§0.04
Chol(mg/dl) 201.0±45.7 185±27.2 191.1±41.1 Ns
LDL(mg/dl) 116.3±40.3 119.5±34.0 97.8±2.1 Ns
HDL(mg/dl) 48.1±14.4 51.4±4.1 43.13±5.7 Ns
心脏收缩BP 146.3±18.7 133.1±14.2* 140.1±15.7§ 0.03；§0.04
舒张BP 83.7±8.3 79.1±9.2 78.3±9.2 Ns
缩写：T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；SPK，胰肾联合移植；K+T1D，1型糖尿病中单独肾脏移植；eGFR，估计血管小球过滤速率；HbA1c，糖化血红蛋白；EIR，外源性胰岛素需求；TG，三酸甘油酯；Chol，总胆固醇；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白；BP，血压；UI，国际单位。
然而，同样用单独肾脏移植治疗患有T1D+ESRD的个体，仍然患有糖尿病(K+T1D)(Fiorina等,2001)。在发明人的移植个体组中，SPK后随时间显现了胃肠道症状中显著的改善A，而K+T1D组并未报告任何益处(图12：A-C)，这表明DE是可逆的。
用SPK对长期T1D的治疗重新建立了肠粘膜形态和局部自我更新特征。
肠粘膜样品的分析显示上皮室(epithelial compartment)结构显著地恢复，以及在SPK组中补偿性上皮增生(图12：D1-D2)。正常上皮细胞组织学和数量的恢复是当长期T1D被成功地治疗时SPK组的证据，然而没有一个这些特征出现在仅接受肾脏移植并仍然患有糖尿病的个体中(图12：D1-D2)。相较于基线以及K+T1D，SPK后，上皮细胞增殖(MIB1+细胞)在各时间点上随时间增加(图4：L、M1-M2)，并且肠形态学、上皮更新和神经功能接近正常化(图12：E1-E2、F、G1-G2、H-I、J1-J2、K)。这表明，用SPK治疗长期T1D促进肠道上皮修复和自我更新特征的恢复。
长期T1D的治疗促进CoSC的恢复
用SPK治疗长期T1D与肠隐窝中Aldh+细胞(图4：N、O1-O2)和EphB2+表达(图4：P、Q1-Q2)的增加相关联，并且相较于基线，其使得分离的肠隐窝中EphB2高+、EphB2+hTERT+和EphB2高+LGR5+细胞的百分比几乎恢复正常(图5：A-C)。CoSC标志物表达(图5：D-G)和获得自SPK个体的迷你肠道的生长/形态学也几乎恢复正常(图5H、图13：A1-A6)。转录组分析揭示，SPK基本上恢复了干细胞和CoSC标志物的表达，以及涉及保护CoSC的途径的表达(图5I、图13B、表VII)。
表VII.通过转录组概况鉴定的SPK相较于T1D+ESRD新鲜分离的结肠隐窝中上调和下调的干细胞靶基因的列表(至少p<0.05)。
缩写：EGF，上皮生长因子；FGF，纤维母细胞生长因子，BMP，骨形态生成蛋白。
结论是用SPK治疗长期T1D促进CoSC的恢复。
用SPK治疗长期T1D恢复循环IGF-I和IGFBP3
广泛的蛋白质组分析和靶向的免疫分析揭示，SPK后，几乎恢复正常的IGFBP3和IGF-I血清水平(图5：J-K)与几乎重建的IGF-IR表达(图13C)相关联。这些结果在K+T1D组中并不明显，其显示了IGF-I(图5J)和IGF-IR表达(图13C)的低水平，并且在其IGFBP概况中只有部分恢复(图13D)。SPK和K+T1D组中，IGFBP3血清水平和肠症状之间显著的相关性，特别是在后者中更明显的相关性确认IGFBP3水平的恢复与糖尿病肠病的改善相关联(图5：L-M，图14：A-G)。用SPK治疗长期T1D通过葡萄糖相关的循环IGF-I/IGFBP3二分体恢复缓解糖尿病肠病。
外-TMEM219重组蛋白质体外消除IGFBP3介导的迷你肠道破坏并在DE的小鼠模型中保护CoSC。
为了进一步证明IGFBP3介导的对CoSC的不利影响，发明人根据TMEM219胞外结构域(外-TMEM219)生成了重组蛋白。将外-TMEM219(与IGFBP3为2:1摩尔比例)加入获得自CTRL并用IGFBP3培养的隐窝中消除了IGFBP3在迷你肠道上的促凋亡作用并且保护了隐窝生成迷你肠道的再生性能(图6A)。用IGFBP3和外-TMEM219培养的迷你肠道中CoSC特征标志物LGR5和EphB2的表达显著恢复，这强调了在保护CoSC中的有利作用(图6B)，这样的作用也在高葡萄糖培养的迷你肠道中得到确认(图6A)。此外，通过RT-PCR对胱天蛋白酶8和9的分析证明了，相对于单独添加IGFBP3，当将外-TMEM219添加到IGFBP3培养的迷你肠道中时，其表达出现净减少(图6：C-D)。其后，发明人用外-TMEM219处理了STZ-B6小鼠，并观察到改善的粘膜形态学，即恢复的隐窝数量、深度和宽度(图6：E、F、G)。相较于STZ处理的B6，外-TMEM219的给予与小鼠体重的增加相关联(图6H)，其具有CoSC显著恢复(图6：I-K)，胱天蛋白酶8和9表达的下降(图6：L-M)和循环IGFBP3水平的重新建立(图6N)。
讨论
在患有T1D的个体中，糖尿病肠病代表了临床相关的并发症，其与生活质量降低、营养不良和吸收不良相关联(Bytzer等,2002；Faraj等,2007；Talley等,2001)。特别是在患有长期T1D的个体(T1D+ESRD)中，肠道病症以高频率和严重程度出现(Cano等,2007；Wu等,2004)，导致体重降低和恶病质(Pupim等,2005)，这表明肠病变是长期T1D的一个重要并发症i(Atkinson等,2013；Pambianco等,2006)。发明人的结论证明患有长期T1D个体经历严重的肠道病症(表VIII)，并且这些临床症状与肠粘膜的改变相关联，即降低肠道上皮细胞的增殖并且具有神经变性的迹象。
表VIII.T1D+ESRD个体相较于CTRL和SPK的糖尿病肠病评估概况
任意单位：+++(高改善)；++(中改善)；+(轻微改善)；＝无改善；---(严重恶化)：--(中度恶化)；-(轻微恶化)。评价按照如下进行：T1D+ESRD对比CTRL，SKP对比T1D+ESRD，K+T1D对比SKP。缩写：T1D，1型糖尿病；ESRD，末期肾病；CTRL，健康对象；SPK，胰肾联合移植。
类似的特征也在T1D和DE的啮齿动物模型中报道(Domenech等,2011)。发明人的数据首次将DE与CoSC中的缺陷相连，并且指出IGFBP3在肠上皮内稳态的维持中具有重要作用。尽管高血糖症是T1D的一个突出特征，发明人的体外研究表明该特征并不能完全解释DE，并且循环因子可能起着重要作用。蛋白质组分析将IGF-I鉴定为涉及CoSC内稳态的向肠因子。然后，发明人确认了IGF-I和IGFBP3控制CoSC，并且该轴在长期T1D中功能失调。发明人的数据表明IGF-I作为循环向肠因子，其促进隐窝生长并控制CoSC通过IGF-IR，而IGFBP3可以通过结合循环IGF-I并降低其生物利用度来阻断IGF-I信号转导。此外，并且最为重要的是，发明人显示，IGFBP3通过促凋亡IGF-I独立性机制作用于CoSC，其中发明人证明表达TMEM219(IGFBP3受体)，因此诱导迷你肠道生长的失效。后者的作用是胱天蛋白酶8和9介导且TMEM219依赖性的；事实上，CoSC上不存在IGFBP3受体(TMEM219)很大程度上减弱了高葡萄糖相关的CoSC损伤。由于肝IGF-1释放的减少，T1D以及饥饿和恶病质一起通过低循环IGF-I水平表征(Bondy等,1994；Giustina等,2014)，而肝IGF-1受到内源性胰岛素的控制和刺激(Le Roith,1997；Sridhar和Goodwin,2009)。更重要的是，高血糖症似乎对肝脏合成和释放IGFBP3有直接影响。因此，IGFBP3可以充当高血糖症期间降低肠道吸收能力的肝激素。有趣的是，SPK为发明人的假说提供概念的证明，并且支持了发明人关于存在控制CoSC的循环因子的发现。发明人在其研究中观察到的DE的功能特征和临床的显著改善以及与之相关的CoSC的补充和循环IGF-I和IGFBP3的恢复强化了发明人的假说。最终，新生成的外-TMEM219重组蛋白质在糖尿病小鼠体内改善了DE并且恢复了迷你肠道正常地体外生长的能力，因此，这确认了IGFBP3在控制CoSC中的作用，并且为新型潜在的治疗策略铺平了道路。总之，发明人的研究显示，在DE中，与高血糖症关联的IGFBP3介导的CoSC的破坏是明显的。发明人提出，循环IGF-I/IGFBP3代表了控制CoSC的激素二分体以及针对患有肠道病症的个体的新型治疗，特别是对由持续时间长的糖尿病(Bondy等,1994；Bortvedt和Lund,2012；Boucher等,2010)。
实施例2
材料和方法
患者和研究设计
60个注册在胰肾联合移植(SPK)候补名单上患有T1D+ESRD且符合年龄(41至43岁)、性别和T1D持续时间(29.4±1.8年)的个体参加了本研究。受到1型糖尿病(T1D)影响10至20年的20个对象也同样被纳入。同样还研究了20个符合年龄和性别的健康对象(CTRL)，其具有正常的肾功能和正常的糖代谢参数。在参加本研究之时，T1D+ESRD对象都在接受强化胰岛素治疗，而并未向CTRL组给予任何药物。所有的T1D+ESRD对象接受如抗血小板疗法(ASA)和降血压(血管紧张素转换酶抑制剂)的相同治疗，而在参加该研究的时候，60中的40个个体接受他汀类药物。具有炎性肠病以及乳糜泻明显迹象的患者没有入选。
根据移植当时宏观外科评估，接受SPK(n＝30)或K+T1D(n＝30)移植后，对T1D+ESRD个体进行8年随访(平均随访:8.6±1.1年)。不包括口服抗凝剂的个体。在整个随访期间，SPK个体都是非胰岛素依赖型的，然而K+T1D个体是强化的皮下胰岛素治疗。所有对象在参加研究之前签署知情同意书。不包括在常规临床随访之中的研究被适当的机构审查委员会批准(肠病-胰肾移植/01Secchi/Fiorina)。
尿液和血清中IGFBP3评估
由离心后3ml的新鲜血液中收集血清。新鲜收集尿液样品，离心，然后存储在-80℃。使用市售可得的ELISA试剂盒，按照生产商的说明(R&D公司)，在血清和尿液的冷冻样品中评估各组对象的IGFBP3水平。
统计学分析
使用Prism Graphpad软件爱你新鲜关联性分析和制图。关联性分析包括在评价的个体的血清和尿液中评估IGFBP3水平，IGFBP3血清水平相较于估计血管小球过滤速率(eGFR)。当p值<0.05时认为是统计学显著性。
肾功能和糖代谢参数的测量
使用MDRD公式来评估ml/分钟/平方米的预估血管小球过滤速率(eGFR)。.血液检查包括在参加该研究的所有对象中进行肌酐、血糖、糖化血红蛋白的评估，着重比较CTRL与T1D个体以及患有长期T1D的个体(T1D+ESRD)。
结论
血清IGFBP3水平与尿液IGFBP3水平相关
对参加研究的所有对象进行的IGFBP3的血清和尿液水平分析记录了，相较于CTRL和T1D程度较轻的个体，T1D+ESRD对象中IGFBP3的血清(图7A)和尿液(图7B)水平两者显著增加。在所有评价的对象中都观察到IGFBP3的血清水平和尿液水平之间显著的关联性(图7C)。较高水平的血清IGFBP3与较高水平的尿液IGFBP3相关联。为了排除这一关联性可能与肾功能相关，进行了IGFBP3血清水平和肾功能(eGFR)之间的关联。IGFBP3血清水平在患有ESRD的对象中显著较高(eGFR<15ml/分钟/平方米)(图7D)。然而，具有eGFR>15ml/分钟/平方米的对象，因此不受ESRD的影响，无论是T1D的存在和病史，都未表现出任何eGFR和IGFBP3血清水平之间统计学上显著的关联性(图7E)。考虑CTRL中IGFBP3尿液水平相对血清水平之间的关联性并在25°和75°百分位内比较其平均值和中位数值，发明人可以对尿液IGFBP3设立如下的范围：
<350pg/ml：正常水平(在健康对象中观测到的水平)
350-500pg/ml：改变的水平(在具有<5年病史的T1D中观测到的水平)
>500pg/ml：肠病的指示(在长期T1D，患有其它T1D并发症的T1D对象，T1D的病史>5年中观测到的水平)。
通过考虑尿液IGFBP3水平与血清IGFBP3水平之间的关联性，如图7F灰色区域所示，发明人可以同样鉴定尿液IGFBP3水平的正常范围(<350pg/ml)。
实施例3
按照如上所述用于糖尿病样品分析相同的方法，纳入5个患有长期炎症性肠病(IBD)的个体并针对IGFBP3，IGF-1的外周水平和IGFBP-3/IGF-1的比例进行筛选。
发现尽管IGFBP3略有增加，但是IGF1的水平严重降低，并且伴随着IGFBP3/IGF1比例的整体改变(图18)。因此，在炎性肠病中，大量的IGFBP3是游离的，并且能够释放其对于肠干细胞的毒性作用。
因此，IGFBP3的抑制剂也有助于治疗和/或预防炎性肠病。
实施例4
材料和方法
患者和研究设计
在圣拉斐尔医院由获得符合年龄和性别的患有1型糖尿病(T1D)、患有长持续时间(>15年)的T1D(长期T1D)和健康志愿者(CTRL)获得60个血清样品。在盖恩斯维尔(佛罗里达州)的协作点，由经筛选对胰岛自身免疫测试呈阳性的个体收集20个血清样品。由比萨大学(意大利)的Genfiev方案研究，收集来自正常葡萄糖耐受(NGT)、受损的葡萄糖耐受(IGT)和2型糖尿病(T2D)个体的235、200和81个血清样品。NGT、IGT和T2D基于根据ADA 2003标准的OGTT测试的结果确定。
在参加本研究之时，T1D和长期T1D对象都在接受强化胰岛素治疗，而并未向CTRL组给予任何药物。所有的T1D对象接受如抗血小板疗法(ASA)和降血压(血管紧张素转换酶抑制剂)的相同治疗。联合治疗，入选和排除标准已经描述(Diabetes Care 2015)并在如下网址报道：https://clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT00879801？term＝GENFIEV。
所有对象在参加研究之前签署知情同意书。不包括在常规临床随访之中的研究被适当的机构审查委员会批准(肠病-胰肾移植/01Secchi/Fiorina)。
胰岛
用于本研究的人胰岛根据已经描述步骤(Petrelli等,2011)按照符合由NiguardaCàGranda伦理委员会批准的伦理要求分离自尸体器官捐赠人。简言之，使用已经描述的自动化分离方法将胰岛分离(D'Addio等,2014)。使用了两种类型的酶：P型胶原酶(1–3mg/ml)和释放酶(0.5–1.4mg/ml)(印第安纳州印第安纳波利斯市的罗氏公司)。胰岛的纯化是通过注射器中不连续的梯度(密度梯度：1,108；1,096；1,037：Euroficoll，(意大利米兰的西格玛-奥德里奇公司)，或通过如前所述具有冷却的COBE处理器的连续梯度(Nano等,2005)。分离后，在潮湿的环境中(5％CO2)，将胰岛以22℃在补充有10％FCS、100U/ml盘尼西林、100μg/ml硫酸链霉素(Celbio的Euroclone公司)和2mmol/l谷氨酰胺(美国弗吉尼亚州密迪亚泰克塞尔格罗公司(Mediatech Cellgro))的M199培养基(意大利米兰Celbio的Euroclone,公司)或CMRL(美国弗吉尼亚州密迪亚泰克塞尔格罗公司(Mediatech Cellgro))中培养。胰岛的体外表征和培养在分离后72小时内处理的胰岛材料上进行。胰岛在补充有100μg/ml硫酸链霉素(Celbio的Euroclone公司)和2mmol/l谷氨酰胺(美国弗吉尼亚州密迪亚泰克塞尔格罗公司)、具有5mM葡萄糖浓度的CMRL 10％FCS中培养4天。
鼠类胰岛来自James Markmann教授的友情提供(波士顿哈佛医学院马萨诸塞州总医院外科移植病房)(Ben Nasr等,2015b；Vergani等,2010)。胰岛由C57Bl6/J小鼠通过胶原酶消化分离，然后进行密度梯度分离，然后人工挑选，如前述(Forbes等,2010)。然后将胰岛铺板并在补充有L-谷氨酰胺、青霉素和10％如已经描述的具有5mM的葡萄糖浓度的RPMI1640培养基中培养。
β细胞系
鼠βTC3和αTC1细胞由米兰大学的Carla Perego在Douglas Hanahan教授的批准下(加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学生物化学与生物物理系)友情提供(Di Cairano等,2011)。如所述，βTC3在包含0.1mM谷氨基酸并补充有0.7mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(西格玛公司)中培养(Di Cairano等,2011)。对于细胞系，葡萄糖浓度是11mM。
病理学和免疫组织化学
样品被固定在缓冲的福尔马林(甲醛4％w/v和醋酸盐缓冲液0.05M)中，并且在固体石腊中进行常规处理。用苏木精&曙红(H&E)对各入选病例的3μm厚的切片染色，用于形态学评价。对免疫组织化学，将3μm厚的切片安置在聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，脱蜡，并通过梯度的乙醇与水水合。通过将切片浸于650W微波炉中pH 6的0.01M柠檬酸盐缓冲剂10分钟进行抗原修复以及通过将切片浸于3％过氧化氢10分钟进行内源性过氧化物酶活性抑制后，在4℃进行18–20小时一抗的孵育，然后进行亲和素-生物素复合物过程。使用0.03％3,3’二氨基联苯胺四盐酸盐进行免疫反应，然后哈里斯苏木精复染切片。使用以下抗体：胰岛素(大科公司，A0564)、抗-IGFBP3一抗(多克隆，1:50稀释，西格玛奥德里奇公司HPA013357)和抗-TMEM219一抗(多克隆，1:100，西格玛公司HPA059185)。这些抗体在健康对象、B6和NOD小鼠的胰腺组织和患有T1D/T2D患者的肝活检，并未实现胰岛素独立的胰岛移植患者中进行免疫组织化学检测。将无病理学发现的组织用作对照。所有这些组织样品来自存储于意大利帕尔马的帕尔马大学的生物医学、生物技术和转化科学院的病理学系(Unit ofPathology of the Department of Biomedical,Biotechnological,and TranslationalSciences,University of Parma,Parma,Italy)的文件。免疫染色强度以1(轻度)、2(中度)、和3(强)分级，而其扩散以1(病灶)、2(区域)、和3(扩散)分级。
免疫荧光
使用共聚焦系统(莱卡TCS SP2激光扫描共聚焦)观测免疫荧光样品。使用连续和独立光通路在多轨模式下获得图像。如下一抗用于人组织/细胞染色：细胞角蛋白18M30的小鼠单克隆抗-胱天蛋白酶切割产物(克隆M30，瑞士巴塞尔的H-R公司(Hoffmann-LaRoche))、兔多克隆IGFBP3(1:250，西格玛公司，HPA013357)、兔多克隆TMEM219(1:250，西格玛公司，HPA059185)和豚鼠多克隆胰岛素(1:50，大科公司，A0564)。如下一抗用于鼠组织/细胞染色：兔多克隆IGFBP3(1:250，西格玛公司，SAB4501527)，山羊多克隆TMEM219(1:50，圣克鲁兹公司，244405)，豚鼠多克隆胰岛素(1:50，大科公司，A0564)。如下二抗用于人组织/细胞染色：驴抗-兔FITC(杰克逊公司)和驴抗-豚鼠TRITC(杰克逊公司)。如下抗体用于鼠组织/细胞染色：驴抗-山羊FITC(杰克逊公司)。
用/不用IGFBP3(生命科技公司，10430H07H5)，用/不用外-TMEM219(由我们与金斯瑞公司(Genscript)合作生产，130ng/ml)，用/不用高葡萄糖(20mM葡萄糖)，用/不用IFN-γ和IL-1β(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司201-LB-005，2ng/ml和派普技术公司(PeProTech)，300-02，1,000U/ml)共培养的人和鼠胰岛经TMEM219、胰岛素和M30染色，用于免疫荧光的共定位研究。在与胰岛相同条件下共培养的鼠β细胞被固定在10％中性缓冲液中30分钟，然后用PBS洗涤3次，并用PBS-BSA 2％曲通x1000.3％透化渗透20分钟，用血清10％封闭，并最终在4℃用一抗过夜孵育，并且后续用荧光二抗在室温进行标记2小时。一抗和二抗如上所述进行选择。
体外研究和表征胰岛和β细胞
培养条件
用/不用炎性刺激物/混合物(IFN-γ+IL-1β，分别为2ng/ml R&D系统公司和1,000U/ml派普罗泰克公司)，用/不用IGFBP3(生命科技公司，50ng/ml)，用/不用外-TMEM219(130ng/ml，参见重组蛋白和介入性研究)，以不同的葡萄糖浓度(5mM、20mM，西格玛公司)培养人和鼠胰岛，并且收集胰岛用于免疫荧光研究、RNA提取、凋亡检测和蛋白质分析。收集上清液，用于评估胰岛素、IGFBP3和IGF-I分泌。
如之前所述，用/不用炎性刺激物/混合物(IFN-γ+IL-1β)，用/不用IGFBP3，用/不用外-TMEM219(参见重组蛋白质和介入性研究)培养β-TC，并且如胰岛研究收集细胞。
免疫印迹。
在利姆里(Laemmli)缓冲液(Tris–HCl 62.5mmol/l,pH 6.8,20％甘油,2％SDS,5％β-巯基乙醇)中提取肠活检样品的总蛋白质，并且测量它们的浓度。35mg总蛋白质在7％SDS-PAGE凝胶上电泳，并印迹至硝化纤维(德国达塞尔的施莱些许尔公司(Schleicher&Schüll))。然后用丽春红S(Ponceau S)对印迹染色。将膜在TBS(Tris[10mmol/l],NaCl[150mmol/l])、0.1％吐温-20、5％脱脂奶粉，pH 7.4中在25℃封闭1小时，用1:250稀释的兔多克隆IGFBP3抗体(西格玛公司，HPA013357)或1:200稀释的山羊多克隆TMEM219(圣克鲁兹生物技术公司，244404或244405)或用以4℃在TBS–5％乳液中1:500稀释的单克隆小鼠抗-β-肌动蛋白抗体(圣克鲁兹生物技术公司)孵育12小时，用TBS–0.1％吐温-20洗涤4次，然后用在TBS–5％乳液中以1:1000稀释的过氧化物标记的小鼠抗-兔IgG二抗(大科公司)(针对IGFBP3)或兔抗-山羊(针对TMEM219)或针对β-肌动蛋白的兔抗小鼠(圣克鲁兹生物技术公司)孵育，并最终用TBS–0.1％吐温-20洗涤。使用增强化学发光法(SuperSignal；美国伊利诺州洛克福德的皮尔斯公司(Pierce))将获得的条带可视化。
qRT-PCR分析
使用Trizol试剂(英杰公司)提取来自纯化的肠隐窝的RNA，并且按照生产商的说明使用TaqMan试验(纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies))进行qRT-PCR分析。使用ΔΔCt方法确定标准化的表达值。用ACTB的表达标准化定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)数据，并且计算ΔCt值。统计分析经由单相ANOVA比较各患者的所有细胞群的基因表达，然后进行邦弗朗尼后测试(Bonferroni post-test)，用于感兴趣的群和所有其它群之间的多重比较。统计分析还通过使用软件可及的RT2profiler PCR阵列数据分析(凯杰公司)。对于两组比较，使用斯氏t检验。培养3天前/后一式三份进行分析。下述是用于人基因的引物的主要特征：
基因符号 UniGene# Refseq登录# 条带尺寸(bp) 参照位置
INS Hs.272259 NM_000207.2 126 252
IGF-IR Hs.643120 NM_000875.3 64 2248
TMEM219 Hs.460574 NM_001083613.1 60 726
LRP1 Hs.162757 NM_002332.2 64 656
TGFbR1 Hs.494622 NM_001130916.1 73 646
TGFbR2 Hs.604277 NM_001024847.2 70 1981
CASP8 Hs.599762 NM_001080124.1 124 648
ACTB Hs.520640 NM_001101 174 730
下述是用于鼠基因的引物的主要特征：
基因符号 UniGene# Refseq登录# 条带尺寸(bp) 参照位置
INS Mm.4626 NM_008386.3 80 533
IGF-IR Mm.275742 NM_010513.2 106 3901
TMEM219 Mm.248646 NM_026827,1 78 677
LRP1 Mm.271854 NM_032538.2 104 2995
TGFbR1 Mm.197552 NM_009370.2 85 90
TGFbR2 Mm.172346 NM_033397.3 132 1656
Casp8 Mm.336851 NM_001080126.1 96 1525
GAPDH Mm.304088 NM_008084.2 107 75
ELISA试验
所有组的对象的汇集血清/血浆中IGF-I和IGFBP3水平以及所有处理和未处理小鼠组的汇集血清/血浆中IGF-I和IGFBP3水平使用市售ELISA试剂盒，根据生产商的说明(R&D公司SG300，和西格玛公司RAB0235)进行评估。
依据生产商的说明，以不同葡萄糖浓度在William培养基中培养人原代肝细胞(HEP10TM汇集的人肝细胞，赛默飞世尔科学公司)3天，所述不同葡萄糖浓度为：11mM、20mM和35mM。收集培养上清液，使用IGFBP3 ELISA试剂盒(西格玛公司，RAB0235)按照生产商的说明评估IGFBP3。收集的细胞通过胰蛋白酶分离，并用血细胞计数器计数。
用微粒子酶免疫测定(Mercodia Iso-胰岛素ELISA，10-1113-01)以3.0％和5.0％的试验内和试验间变异系数(CV)测定胰岛素水平。
重组蛋白和干预性研究
将重组人IGF-I(西格玛公司，I3769)，100ng/ml(IGF-I)，重组人IGFBP3(生命科技公司，10430H07H5)，50ng/ml(IGFBP3)和抗-IGF-IR(波士顿的赛力克化学公司(Selleckchem)，OSI-906)，1μM/L和外TMEM219(D'Addio等,2015)，130ng/ml在胰岛收集/细胞培养的+1天加入胰岛/细胞培养物。同样将胰岛和β细胞暴露在复合的致糖尿病条件下72小时：20mM葡萄糖，2ng/ml重组人IL-1β(明尼苏达州明尼阿波里斯市的R&D系统公司201-LB-005)，和1,000U/ml重组人IFN-γ(派普技术公司，300-02)的混合物。
将IGFBP3(纽约州沃利卡特其的Reprokine(Reprokine,Valley Cottage,NY))以150μg/小鼠/天向原初B6小鼠腹腔内(i.p.)给予15天；将外-TMEM219体内腹腔内(i.p.)给予STZ处理的B6、10周龄的NOD和以高脂肪饮食饲养的B6(HFD-B6)小鼠，其中以150μg/小鼠/天的剂量向STZ处理的B6和NOD小鼠给予15天，以100μg/小鼠的剂量向HFD-B6小鼠每隔一天给予8周。
动物研究
雄性C57BL/6(B6)小鼠和雌性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(4周龄和10周龄)由缅因州巴港的杰克逊实验室获得。所有小鼠按照哈佛医学院实验动物管理和使用委员会批准机构准则饲养和使用。使用链脲霉素(STZ)注射(225mg/kg，腹膜内给予；西格玛公司S0130)的化学方法使B6小鼠呈现糖尿病，该模型被接受并确认为T1D糖尿病的模型(Carvello等,2012；Petrelli等,2011；Vergani等,2013)。糖尿病在STZ处理的B6和NOD中被定义为3次连续测量的血糖水平>250mg/dL。
为了研究T2D的发病和进展，将B6小鼠(6周龄)按照实验室动物护理原理(NIH出版物号85–23，1985修订)饲养在无菌动物房中，并接受随意饮水和进食。该研究方案经当地伦理委员会批准。用购自Research Diets(意大利塞蒂莫米兰的Mucedola)的高脂饮食(HFD)(DIO饮食D12492，来自脂肪的60％总卡路里)或正常脂肪饮食(NFD；DIO饮食D12450B；来自脂肪的10％总卡路里)饲养小鼠。治疗或对照的各组包括10只动物。16周后，测量血糖并进行IV葡萄糖耐受测试(IVGTT)。次日，麻醉小鼠，然后获得血液样品并收获胰腺，用于组织学研究。同样将部分组织极速冷冻并储存在Trizol中以进行RT-PCR研究。
最终，收集血浆和血清以进行IGF-I(IGF-I ELISA试剂盒，R&D公司)、IGFBP3(IGFBP3ELISA试剂盒，R&D公司)和胰岛素水平(Mercodia小鼠胰岛素ELISA试剂盒)分析。一周两次对HFD-B6的血糖进行12周的监测，以确定糖尿病发病和持续性。
统计学分析
数据以平均值和平均值的标准误差(SEM)表示，并且用柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)测试其正态分布，以及用列文氏检验(Levene’s test)测试其同方差性。用双尾的t-检验和卡方(χ2)检验来测试统计学上显著的差异。统计学显著的区别通过双侧斯氏t检验确定。对于多重比较，使用Bonferroni校正的ANOVA检验。将所有数据输入社会科学统计软件包(SPSS，甀BM，伊利诺伊州芝加哥甋PSS有限公司)并进行分析。使用GraphPad Prism 5.0(加利福尼亚州拉由拉市的格拉夫派得(GraphPad)软件公司)生成图表。所有的统计学检验在5％显著性水平进行。
结果
IGFBP3外周水平在前驱糖尿病的和糖尿病小鼠中增加。
为了鉴定在诱导β细胞死亡中作用的潜在循环因子，发明人基于一种或多种抗-胰岛自身抗体的存在，使用无偏见的蛋白质组方法对健康个体和处于T1D风险的个体的血清蛋白质组进行概述。对照库中相较于处于T1D风险的个体库中显著差异(p值<0.01)的蛋白质进一步提交进行分级聚类分析。相较于健康对象，在处于T1D风险的个体中显示了清晰的蛋白质组概况(并且在明显的T1D中也是一样)，其中具有超过50％检测的蛋白质在一个组或另一个组中分离。具体而言，使用免疫靶向的试验，IGF-I结合蛋白3(IGFBP3)的水平在处于T1D风险的个体中增加(图19A)，并且因此先于高血糖症的发病。有趣的是，在由Genfiew研究中获得的样品中，IGFBP3水平同样改变，在Genfiew研究中有超过800个个体参加，并且根据OGTT测试中的结果将这些个体分类在三个主要类别中，所述三个主要类别为：正常葡萄糖耐受(NGT)对象、受损的葡萄糖耐受(IGT)对象以及T2D个体(T2D)。发明人观察到，相较于NCT对象，IGFBP3水平在IGT和T2D中增加，这证实了高外周水平的IGFBP3主要表征前驱糖尿病病症(图19B)。
为了证明IGFBP3在胰岛和β细胞上的作用，发明人首先证明了前驱糖尿病NOD小鼠以及糖尿病NOD小鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病C57BL/6小鼠(STZ-B6)表现出相较于原初B6增加的外周IGFBP3水平(图20A)。然后，发明人在T2D的鼠模型，HFD模型中对此进行了确认。用高脂饮食饲养的C57Bl6/J(B6)小鼠在16周产生T2D，并相较于用正常脂肪饮食饲养的B6小鼠，显示出增加的外周IGFBP3水平(图20B)。
发炎的环境中和T1D中增加的由肝细胞生成IGFBP3。
肝脏是已知的IGFBP3生成部位。为了探索炎性刺激物是否可以影响肝IGFBP3生成，发明人用各种细胞因子并以不同的葡萄糖浓度(11、20和35mM)培养了人原代肝细胞，并且证明了在不同的促炎性刺激以及增加的葡萄糖水平后，上清液中IGFBP3水平快速增加(图21：A-B)。
TMEM219表达于人胰岛。
为了评价IGFBP3/TMEM219轴在胰岛和β细胞上的作用，发明人首先通过免疫荧光以及其在共聚焦显微镜与胰岛素的共定位评估了TMEM219表达(图22：A1-A2)。对获得自其胰腺不适合器官捐献的尸体捐赠者的人胰岛进行研究。TMEM219(绿色染色)在胰岛中广泛表达，并且与胰岛素(红色染色)共定位(图22：A1-A2)。发明人进一步评价了IGFBP3的其它已知受体(即，LPR1、TGF-βR1和TGF-βR2)的表达，但是这些受体未显示表达(图22B)。发明人通过使用RT-PCR和WB确认了TMEM219表达(图22：B-C)。
发明人使用RT-PCT进一步证明鼠胰岛中TMEM219的表达，并且排除了在其它细胞和模型(Baxter,2013；Forbes等,2010)中已经描述的其它已知IGFBP3受体(LRP1、1型TGF-β和2型TGF-β)(图23A)。最后，发明人利用了鼠β和α细胞系(αTC和βTC)的可用性，并且通过RT-PCR确定了TMEM219的表达受限于β细胞，而其它胰岛细胞，如α细胞并不表达(图23B)，并且通过WB进一步确认了TMEM219表达(图23C)。TMEM219的免疫荧光染色(绿色)及其与胰岛素的共定位同样在共聚焦显微镜上确认了β细胞系(图23D)。
IGFBP3体外损害β细胞系。
为了证明在胰岛中IGFBP3靶向β细胞，发明人用/不用IGFBP3对β细胞系(βTC)进行了3天的培养。通过使用活力/凋亡试验，发明人能够证明，相较于未处理的细胞，在IGFBP3处理的条件下的活力β细胞的百分比降低(图24A)。有趣的是，通过免疫荧光和RT-PCR，IGFBP3处理的β细胞还表现出胱天蛋白酶8表达的显著增加(图24B)和胰岛素表达的降低(图：24：C、D1-D2、E)。有趣的是，IGFBP3诱导的凋亡显著地高于由促炎性刺激物IL-1β和IFN-γ所诱导的凋亡(图24：A-B)，并且胰岛素表达和释放仅有轻微的降低(图24：C-E)。
IGFBP3体外损害鼠胰岛。
为了进一步证明IGFBP3介导的对于胰岛的不利影响，发明人用/不用IGFBP3对由C57BL/6小鼠分离的鼠胰岛进行了4天的培养。由FACS(膜联蛋白V+7AAD-)对广泛凋亡出现的评估记录了经历早期凋亡的IGFBP3处理的胰岛(87±2相对67±2％，p＝0.004)，其与通过RT-PCR评估的胱天蛋白酶8表达的增加和胰岛素表达的降低相关联(图25：A-C)。
IGFBP3体外损害人胰岛。
通过免疫荧光(图26：D1-D2)和使用RT-PCR(图26E)证明体外培养的人胰岛表现出与胰岛素表达降低相关联的胱天蛋白酶8表达的增加(图26B)以及M30表达的降低(图8：C1-C2)，发明人最终确认了人胰岛中IGFBP3介导的不利影响，其中所述胰岛获得自其胰腺不适合器官捐献的尸体捐赠者，并将其在IGFBP3下暴露4天，经历了大量凋亡(图26A)，所述M30是凋亡的标志物。
将IGFBP3注射到C57BL/6小鼠改变了体内胰岛形态。
为了确认IGFBP3改变胰岛形态，发明人将重组IGFBP3(Reprokine)注射到原初B6和STZ处理的B6小鼠(每天150μg，15天)。收集的胰腺的组织学(H&E)分析证明了，相较于原初和STZ-B6小鼠的胰岛，IGFBP3处理的STZ-B6小鼠的胰岛中紊乱增加，这是通过对分散的胰岛素表达进行免疫染色确认的(图27：A1-A6)。
重组蛋白外-TMEM219防止体外β细胞系中IGFBP3相关的损害。
问了证明外-TMEM219防止IGFBP3相关的不利影响，特别是对β细胞的不利影响，发明人用IGFBP3和外-TMEM219培养β细胞系，并且观察到β细胞凋亡通过外-TMEM219的添加被极大地降低。该作用还通过分析胱天蛋白酶8表达确认，其中相较于那些单独用IGFBP3培养的细胞，IGFBP3+外-TMEM219处理的β细胞中胱天蛋白酶8的表达出现降低(图28：A-B)。通过RT-PCR和免疫荧光(红色)评估的胰岛素表达通过将外-TMEM219添加到IGFBP3培养的β细胞中持续增加(图28：C1-C3)。
重组蛋白外-TMEM219防止体外鼠胰岛中IGFBP3相关的不利作用。
为了进一步确认外-TMEM219在预防IGFBP3相关的损伤中的治疗性质，发明人测试了外-TMEM219在体外培养的鼠胰岛中的作用。将外-TMEM219(与IGFBP3以2:1摩尔比例)添加至与IGFBP3共培养的分离的C57BL/6胰岛消除IGFBP3的促凋亡作用。此外，胱天蛋白酶8表达在用IGFBP3和外-TMEM219培养的胰岛中显著降低(图29A)。胰岛素表达通过将外-TMEM219添加至用IGFBP3培养的鼠胰岛增加(图29B)，这强调了外-TMEM219在保护胰岛功能上的有利作用。
重组蛋白外-TMEM219防止体外IGFBP3对人胰岛的不利作用。
为了证明外-TMEM219在预防胰岛破坏中的有益作用，发明人用IGFBP3和外-TMEM219对人胰岛进行了4天的培养，并且发明人证明了通过外-TMEM219拯救了IGFBP3介导的胰岛损伤，其与在RT-PCR中胰岛素表达的增加和胱天蛋白酶8表达降低相关联(图30：A-B)。
有趣的是，胰岛素(红色)与凋亡标志物M30(绿色)的共染色确认了产生胰岛素的细胞在用IGFPB3共培养中被外-TMEM219保护(图30：C1-C3)。
重组蛋白外TMEM219防止IGFBP3相关的胰岛改变。
为了证明外-TMEM219在治疗糖尿病中的作用，发明人在第8周测量了STZ处理的糖尿病小鼠中胰岛素血清水平，并且相较于未处理的STZ-B6小鼠，在这些用外-TMEM219(腹膜内，每隔一天150μg，持续2周)处理的小鼠中观测到胰岛素显著地增加(图31A)。最后，在另一个胰岛受损体内模型中，用高脂饮食饲养的B6小鼠(B6-HFD)表现出改变的血糖和胰岛素水平，而用外-TMEM219(腹膜内，每隔一天100，持续6周)处理的B6-HFD保持接近正常的葡萄糖和胰岛素水平(图31B)，因此这表明外-TMEM219在1型和2型糖尿病中的疗效。
讨论
1型糖尿病(T1D)历来被认为是T细胞介导的自身免疫疾病，导致产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏(Bluestone等,2010；Eisenbarth,1986)。根据这一观点，启动因子触发针对自身抗原的免疫应答，并且随后新激活的自身反应性T细胞靶向并进一步破坏产生胰岛素的β细胞(Bluestone等,2010)。β细胞的破坏是否完全由自身免疫攻击所决定，又或者其它机制，如旁分泌调节、代谢失调和非免疫β细胞凋亡是否导致T1D发病是目前讨论的焦点(Atkinson和Chervonsky,2012；Atkinson等,2015)。最近，观测到在T1D中启动自身免疫应答需要环境因子(例如，病毒感染、饮食，新生儿暴露于牛奶和微生物群)(Filippi和vonHerrath,2008；McLean等,2015)。因此，研究T1D发病机理的新方法正在逐渐出现(McLean等,2015)，使得免疫和遗传因素将不在被认为是TID的唯一决定因素(Alper等,2006；Oilinki等,2012)。此外，免疫治疗策略的功效，这一在过去数十年间被认为是建立T1D治愈的主要目的，现如今备受质疑(Ben Nasr等,2015a)。尽管在啮齿动物中使用免疫抑制治疗或促调节方案靶向免疫应答被证明是令人满意的，但是这样的策略在少得可怜的T1D个体中相反地实现了胰岛素独立(Atkinson等,2015)。除了强调动物模型和人之间的区别，这些数据还揭示了这样事实，即免疫应答的调查研究主要检验发生在外周的免疫事件，但是对于发生在胰岛中，特别是β细胞中的疾病过程知之甚少。就此而言，发现涉及启动/促进T1D中β细胞消亡的新型因子将会具有重要价值。这样的发现可以为能够停止或延缓疾病第一阶段的新型的治疗方法铺平道路。在本发明中已经发现，处于T1D高风险的个体中以及那些明显具有T1D的个体中，IGFBP3外周水平增加。有趣的是，相似的模式也在处于患T2D(IGT、IFG)风险的个体以及那些具有T2D的个体中观测到，其中在处于患T2D分线的个体中已经检测到葡萄糖不耐受，这表明尽管病因不同，但是发生在两种类型的糖尿病中导致β细胞缺失的介导物可能是同一种，即被称为IGFBP3的β毒素。事实上，T1D和T2D都通过β细胞缺失表征，这导致胰岛素分泌的降低，血糖水平控制的失效和高血糖症(Brennand和Melton,2009；Yi等,2014)。尽管不同的病因机制，无论是T1D中的自身免疫应答或T2D中的胰岛素抗性/炎症都导致β细胞群的逐步减少。目前有几种方法能够治疗T1D和T2D，但是没有一种是针对β细胞损失，保护β细胞避免损伤和保全β细胞群，从而防止糖尿病发病。IGFBP3也可以作为解释在T2D患者中观测到的呼吸苦难的机制，其缓慢但是逐步的丧失其β细胞功能并停止产生胰岛素。在T2D中观测到的慢性IGFBP3过度生成过程可能有利于β细胞的破坏，并且导致口服抗糖尿病药剂的失效。发明人还观测到IGFBP3受体(TMEM219)在鼠/人胰岛中表达，并且其通过IGFBP连接对β细胞是毒性的，提高内源性β细胞毒素(β毒素)存在的可能性，而这可能涉及早期T1D和大部糖尿病。非免疫因素可能确定胰岛/β细胞损伤，并且促进自身抗原暴露于免疫细胞，因此产生局部发炎的环境和持续的免疫反应。肝脏已经被证明是IGFBP3的主要来源，并且将其暴露于炎症和高葡萄糖水平显著地增加了循环中IGFBP3释放。其结果是IGFBP3靶向胰岛和β细胞因此有利于其破坏和损失。因此，通过应用新生成的IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂，如重组外-TMEM219来中和IGFBP3介导的β细胞损伤可以通过淬灭外周IGFBP3来防止β细胞损失，因此经由TMEM219阻断其信号转导以及停止/延迟T1D进展(图32)。这可能产生在糖尿病预防这一领域的临床应用，导致将外-TMEM219应用在处于T1D高风险的个体中，并且最终应用于T2D个体中。通过抑制IGFBP3与表达于靶向组织的TMEM219的结合，IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂可以因此预防与早期T1D相关联的早期β细胞损伤。考虑到其在预防β细胞的早期损失中的作用，还可以考虑到IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂在T2D的早期治疗中的益处。因此，IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂可以代表这样一种治疗策略，所述治疗策略预防糖尿病防病并且保护β细胞避免损失和破坏并因此成为用于处于产生糖尿病(同时包括T1D和T2D)高风险的个体以及那些处于早期糖尿病个体的相关临床选择。处于产生T1D风险的个体主要通过在血清中早期检测针对胰岛肽多种自身抗体表征，而这些自身抗体通常并不存在于健康对象中(Ziegler等,2013)。这些个体通常是患有T1D个体的亲属(兄弟、姐妹)，但是并不具有与T1D相关的任何迹象或症状。这些对象在10年内产生T1D的可能性非常高，并且其中的大部分(70％)在未来15年内患上T1D，但是这通常被低估(Ziegler等,2013)。难以鉴定处于患T2D的个体，特别是在早期阶段。预防主要包括改变生活方式，这可能延缓糖尿病的发病，但是不能防止其发病(Schwarz等,2012)。现在已经在进行的各种筛选方法(遗传分析、代谢概况、肥胖和分享因素评估)，从而早期检测葡萄糖代谢中的改变，但是能够预防或保护免于T2D发病的治疗剂尚不存在，并且当前的选择仅包括控制高血糖症和延缓T2D发展(二甲双胍)的抗糖尿病药剂，或控制其它风险因素的药剂(降脂试剂和降血压试剂)(Nathan,2015)。因此，旨在所有群体(同时包括T1D和T2D)中降低糖尿病负担的治疗应当关注这些高风险群体。本发明旨在一种通过消除β细胞损失和保护β细胞群、用于在处于患糖尿病高风险个体中预防糖尿病防病以及用于在那些早期糖尿病个体(新发病)中保护其免于发展成成型的糖尿病的新临床治疗剂。鉴于其在预防β细胞损失和破坏中的作用，IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂被用于处于患T1D或T2D风险的个体，以及那些患有该疾病早期阶段的个体。
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<130> PCT129932
<150> EP15170679.3
<151> 2015-06-04
<150> EP16169222.3
<151> 2016-05-11
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gly Asn Cys Gln Ala Gly His Asn Leu His Leu Cys Leu Ala His
1 5 10 15
His Pro Pro Leu Val Cys Ala Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Gly Leu
20 25 30
Ser Gly Leu Gly Leu Gly Ser Phe Leu Leu Thr His Arg Thr Gly Leu
35 40 45
Arg Ser Pro Asp Ile Pro Gln Asp Trp Val Ser Phe Leu Arg Ser Phe
50 55 60
Gly Gln Leu Thr Leu Cys Pro Arg Asn Gly Thr Val Thr Gly Lys Trp
65 70 75 80
Arg Gly Ser His Val Val Gly Leu Leu Thr Thr Leu Asn Phe Gly Asp
85 90 95
Gly Pro Asp Arg Asn Lys Thr Arg Thr Phe Gln Ala Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Gln Met Gly Leu Lys Gly Ser Ser Ala Gly Gln Leu Val Leu Ile
115 120 125
Thr Ala Arg Val Thr Thr Glu Arg Thr Ala Gly Thr Cys Leu Tyr Phe
130 135 140
Ser Ala Val Pro Gly Ile Leu Pro Ser Ser Gln Pro Pro Ile Ser Cys
145 150 155 160
Ser Glu Glu Gly Ala Gly Asn Ala Thr Leu Ser Pro Arg Met Gly Glu
165 170 175
Glu Cys Val Ser Val Trp Ser His Glu Gly Leu Val Leu Thr Lys Leu
180 185 190
Leu Thr Ser Glu Glu Leu Ala Leu Cys Gly Ser Arg Leu Leu Val Leu
195 200 205
Gly Ser Phe Leu Leu Leu Phe Cys Gly Leu Leu Cys Cys Val Thr Ala
210 215 220
Met Cys Phe His Pro Arg Arg Glu Ser His Trp Ser Arg Thr Arg Leu
225 230 235 240
<210> 2
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Thr His Arg Thr Gly Leu Arg Ser Pro Asp Ile Pro Gln Asp Trp Val
1 5 10 15
Ser Phe Leu Arg Ser Phe Gly Gln Leu Thr Leu Cys Pro Arg Asn Gly
20 25 30
Thr Val Thr Gly Lys Trp Arg Gly Ser His Val Val Gly Leu Leu Thr
35 40 45
Thr Leu Asn Phe Gly Asp Gly Pro Asp Arg Asn Lys Thr Arg Thr Phe
50 55 60
Gln Ala Thr Val Leu Gly Ser Gln Met Gly Leu Lys Gly Ser Ser Ala
65 70 75 80
Gly Gln Leu Val Leu Ile Thr Ala Arg Val Thr Thr Glu Arg Thr Ala
85 90 95
Gly Thr Cys Leu Tyr Phe Ser Ala Val Pro Gly Ile Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Pro Ile Ser Cys Ser Glu Glu Gly Ala Gly Asn Ala Thr Leu
115 120 125
Ser Pro Arg Met Gly Glu Glu Cys Val Ser Val Trp Ser His Glu Gly
130 135 140
Leu Val Leu Thr Lys Leu Leu Thr Ser Glu Glu Leu Ala Leu Cys Gly
145 150 155 160
Ser Arg
<210> 3
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Ser Phe Leu Leu Thr His Arg Thr Gly Leu Arg Ser Pro Asp Ile Pro
1 5 10 15
Gln Asp Trp Val Ser Phe Leu Arg Ser Phe Gly Gln Leu Thr Leu Cys
20 25 30
Pro Arg Asn Gly Thr Val Thr Gly Lys Trp Arg Gly Ser His Val Val
35 40 45
Gly Leu Leu Thr Thr Leu Asn Phe Gly Asp Gly Pro Asp Arg Asn Lys
50 55 60
Thr Arg Thr Phe Gln Ala Thr Val Leu Gly Ser Gln Met Gly Leu Lys
65 70 75 80
Gly Ser Ser Ala Gly Gln Leu Val Leu Ile Thr Ala Arg Val Thr Thr
85 90 95
Glu Arg Thr Ala Gly Thr Cys Leu Tyr Phe Ser Ala Val Pro Gly Ile
100 105 110
Leu Pro Ser Ser Gln Pro Pro Ile Ser Cys Ser Glu Glu Gly Ala Gly
115 120 125
Asn Ala Thr Leu Ser Pro Arg Met Gly Glu Glu Cys Val Ser Val Trp
130 135 140
Ser His Glu Gly Leu Val Leu Thr Lys Leu Leu Thr Ser Glu Glu Leu
145 150 155 160
Ala Leu Cys Gly Ser Arg
165
<210> 4
<211> 297
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Gln Arg Ala Arg Pro Thr Leu Trp Ala Ala Ala Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Arg Gly Pro Pro Val Ala Arg Ala Gly Ala Ser Ser Ala
20 25 30
Gly Leu Gly Pro Val Val Arg Cys Glu Pro Cys Asp Ala Arg Ala Leu
35 40 45
Ala Gln Cys Ala Pro Pro Pro Ala Val Cys Ala Glu Leu Val Arg Glu
50 55 60
Pro Gly Cys Gly Cys Cys Leu Thr Cys Ala Leu Ser Glu Gly Gln Pro
65 70 75 80
Cys Gly Ile Tyr Thr Glu Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys Gln Pro
85 90 95
Ser Pro Asp Glu Ala Arg Pro Leu Gln Ala Leu Leu Asp Gly Arg Gly
100 105 110
Leu Cys Val Asn Ala Ser Ala Val Ser Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Glu Pro Pro Ala Pro Gly Asn Ala Ser
130 135 140
Glu Ser Glu Glu Asp Arg Ser Ala Gly Ser Val Glu Ser Pro Ser Val
145 150 155 160
Ser Ser Thr His Arg Val Ser Asp Pro Lys Phe His Pro Leu His Ser
165 170 175
Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys Asp Ser Gln Arg Tyr
180 185 190
Lys Val Asp Tyr Glu Ser Gln Ser Thr Asp Thr Gln Asn Phe Ser Ser
195 200 205
Glu Ser Lys Arg Glu Thr Glu Tyr Gly Pro Cys Arg Arg Glu Met Glu
210 215 220
Asp Thr Leu Asn His Leu Lys Phe Leu Asn Val Leu Ser Pro Arg Gly
225 230 235 240
Val His Ile Pro Asn Cys Asp Lys Lys Gly Phe Tyr Lys Lys Lys Gln
245 250 255
Cys Arg Pro Ser Lys Gly Arg Lys Arg Gly Phe Cys Trp Cys Val Asp
260 265 270
Lys Tyr Gly Gln Pro Leu Pro Gly Tyr Thr Thr Lys Gly Lys Glu Asp
275 280 285
Val His Cys Tyr Ser Met Gln Ser Lys
290 295

Claims (19)

1.一种IGFBP3/TMEM219轴的抑制剂，用于治疗和/或预防对象的糖尿病。
2.如权利要求1所述的抑制剂，其中，所述抑制剂选自：
a)多肽；
b)编码所述多肽的多核苷酸，或能够抑制IGFBP3/TMEM219轴的多核苷酸；
c)包括或表达所述多核苷酸的载体；
d)宿主细胞，经遗传工程改造表达所述多肽或所述多核苷酸；
e)小分子；
f)肽、蛋白质、抗体、反义寡核苷酸、siRNA、反义表达载体或重组病毒或能够抑制或IGFBP3/TMEM219轴的任何其它试剂。
3.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂，其中，所述抑制剂是受体TMEM219或其片段。
4.如权利要求3所述的抑制剂，其中，所述TMEM219的片段是包括TMEM219胞外结构域的片段。
5.如权利要求3或4所述的抑制剂，所述抑制剂是外-TMEM219。
6.如权利要求3-5中任一项所述的抑制剂，所述抑制剂是可溶性的。
7.如权利要求1-2中任一项所述的抑制剂，其中，所述抑制剂是融合蛋白TMEM219-Ig，优选所述融合蛋白淬灭循环IGFBP3并阻止其结合TMEM219。
8.如权利要求1-2中任一项所述的抑制剂，其中，所述抑制剂是抗-IGFBP3抗体，优选所述抗体选择性阻断TMEM219结合位点。
9.如权利要求1-2中任一项所述的抑制剂，其中，所述抑制剂是抗-TMEM219抗体，优选所述抗体占据TMEM219受体的IGFBP3结合位点，因此阻止IGFBP3结合。
10.如权利要求1-2中任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是与IGFBP3mRNA互补的寡核苷酸。
11.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂，其中，所述糖尿病是1型或2型糖尿病。
12.如前述权利要求中任一项所述的抑制剂，其中，所述对象选自：处于患1型和/或2型糖尿病风险中的对象，患有早期1型和/或2型糖尿病的对象。
13.一种药物组合物，用于糖尿病的治疗和/或预防，其包括如权利要求1-10中任一项所述的抑制剂和药学上可接受的运载体。
14.如权利要求13所述应用的药物组合物还包括治疗剂。
15.如权利要求14所述应用的药物组合物，其中所述治疗剂选自：任何形式的胰岛素，普兰林肽(Symlin)，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)，阿司匹林，降胆固醇药物，二甲双胍(库鲁化锭，Glumetza，其它)，磺酰脲(格列本脲(达安疗，Glynase)，格列吡嗪(Glucotrol)和格列美脲(亚莫利)，氯茴苯酸(例如，瑞格列奈(Prandin)和那格列奈(Starlix))，噻唑烷二酮类(例如罗格列酮(Avandia)和吡格列酮(艾可拓))，DPP-4抑制剂(西他列汀(Januvia)，沙格列汀(安立泽)和利拉利汀(Tradjenta))，GLP-1受体激动剂(艾塞那肽(百泌达)和利拉鲁肽(诺和力))，SGLT2抑制剂，示例包括卡格列净(Invokana)和达格列净(Farxiga)。
16.一种鉴定处于患1型和/或2型糖尿病风险中的对象或在对象中监测对治疗处理的应答的方法，其包括：
c)在获得自对象的生物样品中测量蛋白质IGFBP3的量或编码所述蛋白质的多核苷酸的量；
d)将测得的所述蛋白质IGFBP3量或测得的编码所述蛋白质的多核苷酸的量与对照量进行比较，其中如果测得量高于对照量，那么所述对象处于患1型和/或2型糖尿病的风险中。
17.如权利要求16所述的方法，其中，用抗体测量所述IGFBP3的量。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述生物样品选自：血清、尿液、细胞培养物上清液。
19.一种试剂盒，其中包括测量蛋白质IGFBP3的量的手段和/或测量编码所述蛋白质的多核苷酸的量的手段，和任选地，用于如权利要求16-18中任一项所述方法的对照手段。
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