CN107893102B - 一种杂交缓冲液、寡核苷酸aCGH芯片的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，本发明提供了一种杂交缓冲液、寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异的方法。本发明所述杂交缓冲液由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot‑1DNA组成，可明显改善杂交漏液、杂交信号弱、杂交不均匀、特异性差的问题，提高已知变异CNV的检出的准确性。

Description

一种杂交缓冲液、寡核苷酸aCGH芯片的试剂盒以及检测染色 体拷贝数量变异方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种杂交缓冲液、寡核苷酸比较基因组杂交芯片(寡核苷酸aCGH芯片)的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异的方法。
背景技术
染色体异常遗传病在自发性流产、死胎、早夭中占50％以上，新生儿中发病率约占1％，是性发育异常及男女不孕症、不育症的重要原因，也是先天性心脏病、智能发育不全等的重要原因之一。随着染色体分带技术、PCR技术、DNA检测技术等的发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日益加深，染色体病日趋增多。综合许多国家的资料，大约有15％的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异常所致，即约为5％-8％的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90％以上已有自然流产或死产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。《中国出生缺陷防治报告(2012)》指出我国每年约有1600万新生儿出生，出生缺陷或先天缺陷的新生儿数量达90万，约占所有新生儿的5.6％。近年来新生儿的出生缺陷率呈逐年上升的趋势，是导致早期流产、死胎、围产儿死亡、婴幼儿死亡和先天残疾的主要原因，不但严重危害儿童生存和生活质量，影响家庭幸福和谐，也会造成巨大的潜在寿命损失和社会经济负担。
在过去的30余年间，用于诊断染色体异常的金标准方法基于G显带的核型分析技术，但自从2003年之后，细胞遗传学基因芯片技术开始在不同的国家的不同实验室被用于检测染色体的异常情况。染色体基因芯片技术(aCGH和SNP芯片技术)较之于目前临床上主流的细胞遗传学诊断技术(如核型分析、FISH技术等)，在染色体异常检出率(一般高出4～5倍)、分辨率(比核型分析的分辨率高1000倍以上)、全基因组的覆盖度(即可一次全面检出染色体异常)及较短的检测周期等方面都有明显的优势。
基于芯片的比较基因组杂交技术(简称aCGH)是全基因组覆盖度范围内检测染色体拷贝数量变异的方法，通常是采用Cy5和Cy3荧光染料分别标记待检样本和正常样本，标记混合物和正常人的间期染色体微阵列芯片进行杂交，快速检测分辨待检样本相对于正常样本的DNA拷贝数变异。
寡核苷酸aCGH芯片主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子杂交反应和信号的检测。杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程，是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中(如杂交温度，杂交时间，杂交液的组成成分等)，减少生物分子之间的错配比率，提高寡核苷酸aCGH芯片检测灵敏度和特异性。
典型的杂交缓冲液中主要包括以下几种成分：1)一定浓度的盐离子，其正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分子的形成，同时含单价阳离子的盐，如SSPE、SSC能使杂交缓冲液的pH维持在6.8-8.5之间；2)表面活性剂如SDS、Triton，可以通过破坏水分子间的氢键作用而降低表面张力调节杂交缓冲液的流动性；3)其他添加物如鲑精DNA，通常用来降低杂交背景和非特异性杂交。芯片杂交体系还需要根据探针的类型、长度、GC含量以及研究目的来选择优化杂交条件。
此外，针对同一平台的芯片，对mRNA表达、DNA突变和CNV等不同检测需求，也需开发或优化配套的杂交缓冲液，以达到最优性能。目前，市场上对于商品化的寡核苷酸aCGH芯片产品，大部分厂商都有其配套的芯片杂交缓冲液。Affymetrix公司
Figure BDA0001348262260000021
Dx芯片、Illumina公司HumanCytoSNP-12、以及Agilent公司ISCA CGH+SNP芯片都有其配套商品化杂交缓冲液。
生物芯片的合成方式主要包括原位合成法和点样法两种。原位合成方法将多个寡核苷酸片段用单核苷酸底物直接合成到载体的特定位置上制备的芯片，其合成方法比较复杂，合成的基因芯片探针密度高，是高密度芯片的主要合成方法。Affymetrix公司将光平版印刷技术(photolithographicapproach)运用到DNA合成化学中，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样性的化合物集合，可合成任意序列15-25个碱基长度的片段。美国Agilent公司通过机械手臂直接将碱基合成试剂氨基膦酸酯点样到芯片适当的位置上，不断循环合成预计的寡核苷酸。这种方法灵活性高，能合成任意寡核苷酸片段。
点样法是将合成好的oligo、PCR产物等通过特定型号的芯片点样仪直接点在芯片上。为使探针能够稳定的固定在载体表面上，需要对载体表面进行适当的化学预处理。比如进行氨基修饰载体、环氧基修饰载体、醛基修饰等。也可在其表面包被多聚赖氨酸或氨基硅烷等，使其表面能够带上正电荷以便吸附带有负电荷的探针分子。这些方法使这些生物大分子紧密附着于基片表面上，与生物分子的活性基团如羟基、氨基等通过共价键连接或非共价键连接的方法将生物分子有效的固定在玻璃表面。不同的玻片修饰对固定不同的生物分子具有不同的特点和用途。
原位合成法和点样法合成原理不同，使用基片类型不同，其结合上的探针具有不同的空间结构。比如原位合成的基因芯片面积小，探针密度大，杂交信号较弱。而点样法合成基因芯片，将合成特定的oligo或PCR产物通过特定型号的芯片点样仪点制在基片上，通过基片表面修饰的活性集团与生物分子的活性基团如羟基、氨基等通过共价键连接或非共价键连接固定在基片表面。其探针密度小，杂交信号较强。因此，原位合成法和点样法由于其合成方法，基片类型不同，探针具有不同的空间结构，从而表现出不同的杂交动力学。
申请人在开发点制法高分子氨基化三维聚合物修饰的aCGH芯片过程中，采用原位合成aCGH芯片代表性公司Agilent商品化的Hybridization Buffer，与申请人开发的aCGH芯片配套使用时，对已知的拷贝数变异(CNV)检出率为0％，采用同为点制法制备的mRNA表达谱芯片配套杂交缓冲液时，可对拷贝数变异进行检测，但存在漏液、杂交信号弱、杂交不均匀的问题，已知变异CNV的检出率为仅为40％。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种杂交缓冲液，以适合于高分子氨基化三维聚合物修饰的aCGH芯片配套使用，改善杂交漏液、杂交信号弱、杂交不均匀的问题，提高对已知变异CNV的检出率。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种杂交缓冲液，由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot-1DNA组成。
其中，所述缓冲液Mix由LiCl、Li-MES、MEDTA、Triton-100、TEGO WET 260和水组成。
作为优选，所述缓冲液Mix中LiCl的终浓度为612.5mM、Li-MES的终浓度为150mM、MEDTA的终浓度为6mM、Triton-100的终浓度为1.0v/v％和TEGO WET 260的终浓度为1.5v/v％。
作为优选，所述甲酰胺的终浓度为40v/v％，所述十二烷基硫酸锂的终浓度为1.5v/v％，所述Cot-1DNA的终浓度为0.15μg/μL-0.25μg/μL之间。
本发明还提供了一种寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒，包括本发明所述杂交缓冲液。
本领域技术人员可以理解，所述缓冲液Mix可以以母液的形式存在，使用时按比例进行稀释。母液浓度为3×缓冲液Mix至10×缓冲液Mix之间任意浓度。
在一些实施方案中所述杂交缓冲液中的缓冲液Mix以3×缓冲液Mix形式存在，其中包括1.8MLiCl、0.45mM Li-MES、18mMEDTA、3v/v％Triton-100、4.5v/v％TEGO WET 260，余量为水。
作为优选，所述的试剂盒还包括寡核苷酸比较基因组杂交芯片。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸比较基因组杂交芯片为高分子氨基化三维聚合物修饰的寡核苷酸aCGH芯片。
本发明还提供了一种检测基因组DNA染色体拷贝数量变异的方法，经荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物与本发明所述杂交缓冲液混合后在杂交盖片的作用下平铺于寡核苷酸比较基因组杂交芯片表面，置于杂交炉内杂交12-14小时，取出芯片清洗后，在扫描仪上进行芯片扫描，根据杂交信号值进行CNV分析。
作为优选，所述荧光标记为待检样品和正常样本gDNA在高盐、高温条件下片段化，然后与荧光修饰引物、dNTP及聚合酶混合进行合成反应。所述高盐、高温条件下具体为12.5mM Mg+离子，以及98℃高温条件下。所述荧光修饰引物终浓度为0.4μg/μL、dNTP终浓度为1mM、聚合酶的终浓度为1U/μL。
进一步的，所述经荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物与所述杂交缓冲液混合的过程中杂交缓冲液中各组分的加样顺序依次为缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂、Cot-1DNA、荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物的混合物。
作为优选，所述经荧光标记的待测样品和正常样品合成产物的混合物终浓度为≤10μg/μL。
本发明所述检测染色体拷贝数量变异的方法为：杂交盖片与寡核苷酸比较基因组杂交芯片之间形成溶液腔，经荧光标记的待测样品和正常样品合成产物与本发明所述杂交缓冲液混合后变性在杂交盖片的作用下平铺于芯片表面，并形成溶液腔，置于杂交炉内杂交。所述杂交炉优选为BioMixerTMII杂交炉。
优选的，所述杂交后的芯片从杂交炉中取出后立即插入芯片清洗仪按照设置程序进行芯片清洗。
在一些实施方案中，所述芯片清洗仪为SlideTMWasher8，所述设置的程序为：①在45℃条件下清洗30sec，洗一遍；②在45℃条件下清洗30sec，洗两遍。
本发明所述检测染色体拷贝数量变异的方法中，包括清洗后的芯片在扫描仪进行芯片扫描。
在一些实施方案中，所述扫描仪为LuxScan10K/A扫描仪。
在一个具体实施方案中，本发明选择了具有代表性并已知染色体拷贝数量变异的质控品gDNA(NA04671)和正常对照gDNA(NA12891)进行荧光标记和芯片杂交，取出芯片清洗后，在扫描仪上进行芯片扫描，根据杂交信号值，使用配套分析软件进行CNV分析，结果显示，与现有技术的杂交缓冲液比，采用本发明所述杂交缓冲液进行芯片杂交可以明显改善芯片杂交漏液信号弱的问题，提高芯片杂交信号强度。并且可以明显改善芯片杂交不均匀的问题，保证芯片杂交信号的均匀度。
在一个具体实施方案中，采用本发明所述杂交缓冲液，使用同管的NA04671和NA12891样品进行不同批次芯片杂交后，不同批次芯片杂交信号均较强，芯片杂交信号的均匀度高，表明本发明所述杂交缓冲液的杂交稳定性好。
在一个具体实施方案中，分别采用Agilent公司商品化杂交缓冲液及本发明实施例3所述杂交缓冲液进行芯片杂交，结果显示，商品化杂交缓冲液与本发明实施例3所述杂交缓冲液均可改善芯片杂交漏液，提高芯片杂交信号值。但在已知变异检出方面，本发明所述杂交缓冲液可检出100％已知变异，而商品化杂交缓冲液未能检出已知变异，表明本发明所述杂交缓冲液的杂交特异性高。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种杂交缓冲液、寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异的方法。本发明所述杂交缓冲液由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot-1DNA组成，可明显改善杂交漏液、杂交信号弱、杂交不均匀的问题，提高已知变异CNV的检出准确率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例5采用现有技术的杂交缓冲液进行芯片杂交后芯片后，杂交信号弱的芯片杂交图；
图2示实施例5采用本发明所述的杂交缓冲液进行芯片杂交后芯片后，杂交信号强的芯片杂交图；
图3示实施例5采用现有技术的杂交缓冲液和本发明所述的杂交缓冲液进行芯片杂交后芯片信号值、背景值比较分析图；
图4示实施例6采用现有技术的杂交缓冲液进行芯片杂交后芯片后，杂交信号不均匀的芯片杂交图；
图5示实施例6采用本发明所述的杂交缓冲液进行芯片杂交后，杂交信号均匀的芯片杂交图；
图6-8示实施例7采用本发明所述的杂交缓冲液，使用同管的NA04671和NA12891样品进行不同批次芯片杂交后，不同批次芯片杂交信号均强，杂交信号均匀；其中图6为批次1、图7为批次2、图8为批次3；
图9示实施例8采用商品化杂交缓冲液进行芯片杂交后芯片杂交信号图；
图10示实施例8采用本发明所述的杂交缓冲液进行芯片杂交后芯片杂交信号图；
图11示实施例8采用商品化杂交缓冲液进行芯片杂交后已知变异分析图进行芯片杂交后芯片杂交信号图；
图12示实施例8采用本发明所述的杂交缓冲液进行芯片杂交后已知变异分析图进行芯片杂交后芯片杂交信号图。
具体实施方式
本发明公开了一种杂交缓冲液、寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中所述芯片为高分子氨基化三维聚合物修饰。所述水优选为ddH2O。
实施例1、样本的选择
在NIGMS的人类遗传细胞库中，有些细胞样品已被Affymetrix、Illumina、Agilentand NimbleGen等公司的染色体异常检测平台作为质控品购买并使用。申请人从这些样品中挑选购买了具有代表性并已知染色体异常情况的质控品gDNA和对照gDNA，用于本发明技术方案的验证。具体样本信息如表1：
表1样本信息
Figure BDA0001348262260000081
实施例2、gDNA标记及质控
NA04671和NA12891各取500ng gDNA分别加入0.2ml离心管中，随后加入Cy3/Cy5-Random primer、片段化buffer后充分混匀，98℃变性10分钟后，立即放置冰上冰浴2分钟。加入dNTP、Klenow酶混匀后37℃反应2h，终止反应后加入等体积异丙醇沉淀标记产物，标记产物经80％乙醇清洗后室温晾干后加入ddH2O溶解。通过NanoDrop-2000分光光度计定量质控产品及荧光掺入效率是否符合标记效率在13-15pmol/μg；DNA标记合成产量在25-28μg质控范围，结果均在质控范围内。
实施例3、芯片杂交及扫描
标记产物质控合格后，NA04671和NA12891样本各取12μg标记产物，分别加入3×缓冲液Mix 15.0μL、Cot-1DNA 5.0μL、甲酰胺13.5μL、十二烷基硫酸锂2.25μL混合后，98℃变性10分钟后立即冰浴2min。将杂交混合液滴加在芯片表面，在杂交盖片的作用下平铺于芯片表面，与杂交盖片形成溶液腔，并放置于BioMixerTM II杂交炉内过夜杂交14小时。
3×缓冲液Mix：
Figure BDA0001348262260000082
实施例4、芯片清洗及扫描、数据分析
从杂交仪中取出芯片杂交盒，迅速打开杂交盒后取出芯片后，立即插入芯片清洗仪(SlideTMWasher8)中按照设置程序进行芯片清洗，清洗后的芯片在扫描仪LuxScan10K/A上设置激光强度及PMT参数进行芯片扫描。芯片扫描结束后，进行芯片杂交信号值提取，使用配套分析软件进行CNV分析。
实施例5、
采用NA04671和NA12891按照实施例2操作步骤，完成标记纯化后取等量合成产物混合后，分别采用实施例5所述现有技术的杂交缓冲液及本发明实施例3所述杂交缓冲液进行芯片杂交，芯片扫描分析后结果见图1-3。其中现有技术的杂交缓冲液的配方如表2所示。
表2现有技术的杂交缓冲液的配方
组分 终浓度
100％甲酰胺 50％甲酰胺
20×SSC 3×SSC
50×Denhardt's 5×Denhardt's
10％SDS 0.2％SDS
图1和2的结果显示，与现有技术的杂交缓冲液比，采用本发明所述杂交缓冲液进行芯片杂交可以明显改善芯片杂交漏液信号弱的问题，提高芯片杂交信号强度。
图2结果显示，与现有技术的杂交缓冲液比较，采用本发明所述杂交缓冲液进行芯片杂交可以明显提高芯片杂交信号2-3倍。
实施例6、
采用NA04671和NA12891按照实施例2操作步骤，完成标记纯化后取等量合成产物混合后，分别采用实施例5所述现有技术的杂交缓冲液及本发明实施例3所述杂交缓冲液进行芯片杂交，芯片扫描分析后结果见图4和5。
图4和5的结果显示，与现有技术的杂交缓冲液比较，采用本发明所述杂交缓冲液进行芯片杂交可以明显改善芯片杂交不均匀的问题，保证芯片杂交信号的均匀度。
进一步，在后续的批量芯片实验中，芯片杂交不均匀出现的概率由36％(18/50)降至0％(0/36)。
实施例7、
分别采用不同批次芯片，使用同管NA04671和NA12891按照实施例2操作步骤，完成标记纯化后取等量合成产物混合后，分别采用本发明实施例3所述杂交缓冲液进行不同批次芯片杂交，芯片扫描分析后结果见图6-8。
结果显示，采用本发明实施例3所述杂交缓冲液与相同NA04671和NA12891样品的荧光标记合成产物进行芯片杂交后，不同批次芯片杂交信号均较强，芯片杂交信号的均匀度高，表明本发明所述杂交缓冲液的杂交稳定性和兼容性好。
实施例8、
采用NA04671和NA12891按照实施例2操作步骤，完成标记纯化后取等量合成产物混合后，分别采用Agilent公司商品化杂交缓冲液及本发明实施例3所述杂交缓冲液进行芯片杂交，芯片扫描分析后结果见图9-11。
图9和10结果显示，商品化杂交缓冲液与本发明实施例3所述杂交缓冲液均可改善芯片杂交漏液，提高芯片杂交信号值。
图11和12结果显示，与已知染色体拷贝数变异(Copy number variation,CNV)结果比对，通过比较检出亚微观水平上的CNV(1Mb-2Mb)和微观水平上(5Mb-10Mb以上)CNV与已知变异CNV片段位置信息的一致率，评价本发明杂交缓冲液检出已知变异CNV的特异性，详见表3。
表3已知变异CNV检出结果比较
Figure BDA0001348262260000101
由表3结果可以看出，二者一致率均＞95.0％。本发明实施例3所述杂交缓冲液可检出100％已知变异，而商品化杂交缓冲液未能检出已知变异。表明本发明所述杂交缓冲液的杂交特异性高。

Claims (4)

1.一种杂交缓冲液的应用，其特征在于，由缓冲液Mix、40v/v%甲酰胺、1.5v/v%十二烷基硫酸锂和0.15μg/μL-0.25μg/μL Cot-1DNA组成；
所述缓冲液Mix由612.5 mM LiCl、150mM Li-MES、6mM EDTA、1.0v/v%Triton-100、1.5v/v %TEGO WET 260和水组成；
所述应用为用于高分子氨基化三维聚合物修饰的寡核苷酸aCGH芯片。
2.一种非疾病诊断目的的检测染色体拷贝数量变异的方法，其特征在于，经荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物与权利要求1中所述的杂交缓冲液混合后在杂交盖片的作用下平铺于寡核苷酸比较基因组杂交芯片表面，置于杂交炉内杂交12-14小时，取出芯片清洗后，在扫描仪上进行芯片扫描，根据杂交信号值进行CNV分析；所述芯片为高分子氨基化三维聚合物修饰的寡核苷酸aCGH芯片。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述荧光标记为待测样品和正常样品gDNA在12.5 mM 镁离子和98℃高温条件下片段化，然后与荧光修饰引物、dNTP及聚合酶混合进行合成反应。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述经荧光标记的待测样品和正常样品与所述杂交缓冲液混合的过程中杂交缓冲液中各组分的加样顺序依次为缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂、Cot-1 DNA、荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物。
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