CN107870241A - 辅助诊断向糖尿病性肾病2期往后发展风险的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供辅助对糖尿病性肾病1期的糖尿病患者向2期往后发展的风险进行诊断的方法。本发明通过测定糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度，当尿中ApoE浓度的值不足指定的阈值时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高来解决了上述的课题。

Description

辅助诊断向糖尿病性肾病2期往后发展风险的方法及装置
【技术领域】
本发明涉及辅助对从糖尿病性肾病1期向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的方法及装置。
【背景技术】
糖尿病性肾病是糖尿病的并发症之一，是经阶段发展的肾脏病。糖尿病性肾病的病期被分类为糖尿病性肾病1期～5期的5期。糖尿病性肾病发展，则成终究肾功能衰竭，透析治疗变得必要。透析治疗对于患者是大的负担。近年，以透析治疗作为必要的患者数增加，伴随其的医疗费的增加成为问题。
在糖尿病性肾病中，如果可在初期的阶段开始适合的治疗，就可恢复肾功能。但是，在更进一步阶段，即使可由治疗延迟疾病的发展，也难以维持恢复肾功能。从而，在期望肾功能的恢复的初期的阶段发现有糖尿病性肾病发展的风险的患者而进行积极治疗减轻患者的将来的负担。另外，对于医疗费的削减也有大贡献。
现在，进行对于糖尿病性肾病的诊断有用的生物标志物的探索。例如，在非专利文献1中公开了，在糖尿病II型患者中，巨噬细胞的载脂蛋白E(ApoE)的分泌量降低。另外，在非专利文献2中，显示ApoE的ε4等位基因的基因多型与糖尿病性肾病和糖尿病性肾病的风险关联。
【现有技术文献】
【非专利文献】
【非专利文献1】Yamato K.等人,Evaluation of apolipoprotein E secretionby macrophages in type 2diabetic patients：role of HDL and apolipoprotein A-I,Diabetes Res Clin Pract.,2005Aug；69(2):124-8.Epub 2004Dec 28
【非专利文献2】Ilhan N.等人,ApoE gene polymorphism on development ofdiabetic nephropathy,Cell Biochem Funct.2007Sep-Oct；25(5):527-32
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
非专利文献1及2均对于尿中ApoE浓度和糖尿病性肾病的关联性全无记载或提示。一方面，如上所述，早期发现发展风险高的患者而开始治疗是重要的。从而，期望使这样的风险的诊断成为可能的手段的开发。
【解决课题的技术方案】
本发明提供辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的方法，其包括对糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度进行测定的工序，及当尿中ApoE浓度的值不足指定的阈值时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高的工序。
另外，本发明提供辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的方法，其包括对糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度及尿中的其他肾病标志物浓度进行测定的工序，及基于尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比而判断向糖尿病性肾病2期往后发展的风险的工序。
另外，本发明提供适宜于辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的取得的装置，其具备含处理器及处于上述处理器的控制下的存储器的计算机，在上述存储器中记录有用于在上述计算机中执行下述的步骤的计算机程序：对糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度进行测定的步骤，及当尿中ApoE浓度的值不足指定的阈值时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高的步骤。
再者，本发明提供适宜于辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的取得的装置，其具备含处理器及处于上述处理器的控制下的存储器的计算机，在上述存储器中记录有用于在上述计算机中执行下述的步骤的计算机程序：对糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度及尿中的其他肾病标志物浓度进行测定的步骤，及基于尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比而判断向糖尿病性肾病2期往后发展的风险的步骤。
【发明效果】
由本发明使辅助糖尿病性肾病1期患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险的诊断变得可能。
【附图说明】
【图1A】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1B】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1C】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1D】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1E】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1F】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图2】是显示发展风险诊断辅助装置的一例的概略图。
【图3】是显示图2的发展风险诊断辅助装置的功能构成的框图。
【图4】是显示图2中所示的发展风险诊断辅助装置的硬件构成的框图。
【图5A】是用于使用图2中所示的发展风险诊断辅助装置取得辅助向糖尿病性肾病2期往后发展的风险诊断的数据的判断的流程图的一例。
【图5B】是用于使用图2中所示的发展风险诊断辅助装置取得辅助向糖尿病性肾病2期往后发展的风险诊断的数据的判断的流程图的一例。
【实施方式】
在本实施方式的诊断方法中，以糖尿病性肾病1期的糖尿病患者(以下，也称为“受试者”)作为诊断的对象。糖尿病性肾病1期是指在KDIGO(Kidney Disease：ImprovingGlobal Outcoms)2012Clinical Practice Guideline for the Evaluation andManagement of Chronic Kidney Disease中记载的慢性肾脏病(CKD)的重症度分类中的白蛋白尿区分是A1，并且GFR区分是G1、G2、G3a或G3b的病期。糖尿病性肾病1期的糖尿病患者是被诊断为糖尿病的患者，尿白蛋白/肌酸酐(Cr)比低于30mg/gCr，并且推算GFR是30mL/min/1.73m2以上的患者。糖尿病性肾病1期也称为肾病前期，确认不到肾病的医学见解，也无自觉症状。糖尿病的诊断法不特别限定，用公知的方法诊断即可。尿白蛋白及肌酸酐的测定法和推算GFR的算出法是在现有技术中公知的。
在本实施方式中，作为试样，使用从受试者采集的尿。从受试者采集的尿不由受试者的身体状况、就餐及服药的有无等特别限定。另外，尿的采集时期也不特别限定，也可使用早晨尿、随时尿及蓄尿的任何。在本实施方式的方法中，尿的量只要有100～500μL左右就充分。
也可根据需要，以适宜于ApoE浓度的测定的方式，对从受试者采集的尿进行预处理。作为这样的预处理，可举出稀释、pH的调整等。例如，通过将尿和指定的pH的缓冲液混合，可进行尿的稀释和pH的调整。缓冲液只要是在适宜于ApoE浓度的测定的pH范围有缓冲作用，就不特别限定。例如，可举出Tris、MES、PIPES、TES、HEPES等的Good的缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。在尿中存在无晶性盐类时，也可为了将其除去而将EDTA盐等的鳌合剂添加到尿中。以下，从受试者采集的尿及预处理的尿也称为“尿试样”。
在糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中，认为ApoE来源于被摄入巨噬细胞等的吞食细胞的脂蛋白或由巨噬细胞自身产生。在本实施方式中，作为尿的预处理，也可使ApoE从摄入ApoE的吞食细胞游离到尿中。使ApoE从细胞游离的方法不特别限定，例如，可举出由表面活性剂的增溶、超声波破碎、冷冻融解等。由表面活性剂导致的细胞的增溶，例如，可通过将从受试者采集的尿和含表面活性剂的缓冲液混合来进行。含表面活性剂的缓冲液的添加量可适宜设定，例如，也可添加尿量的1倍以上50倍以下的量、优选为尿量的1倍以上10倍以下的量。表面活性剂的种类只要是不妨碍ApoE的测定，就不特别限定。例如，可举出Triton X-100、Tween 20、辛基葡萄糖苷等。尿试样中的表面活性剂的终浓度可根据表面活性剂的种类适宜设定。例如，使用Triton X-100时，尿试样中的终浓度是0.001％(v/v)以上10％(v/v)以下，优选为0.01％(v/v)以上1％(v/v)以下。
尿中ApoE浓度可由可取得反映尿试样中所含的ApoE的浓度或量的值(以下，也称为“ApoE的测定值”)的方法测定。作为这样的方法，优选使用与ApoE特异性地结合的捕获体而捕获ApoE的方法。通过将由捕获体捕获的ApoE用公知的方法检测，可取得ApoE的测定值。作为与ApoE特异性地结合的捕获体，例如，可举出抗体、适体等。在它们之中，也特别优选抗体。抗体也可为单克隆抗体、多克隆抗体、及它们的片段(例如，Fab、F(ab')2等)之任何。与ApoE特异性地结合的抗体(以下，也称为“抗ApoE抗体”)本身是在现有技术中公知的，一般可得到的。
在本实施方式中，优选由使用抗ApoE抗体的免疫学测定法测定尿中ApoE浓度。作为免疫学测定法，例如，可举出酶联免疫吸附法(ELISA法)、免疫复合物转移测定方法(参照特开平1-254868号公报)、免疫比浊法、免疫层析法、乳胶凝集法等。也可使用ELISA试剂盒等的市售的测定用试剂盒。作为测定工序的一例，接下来对由夹心ELISA法测定尿中ApoE浓度的情况进行说明。
首先，在固相上形成含尿中的ApoE、用于捕获ApoE的抗体(以下，也称为“捕获用抗体”)和用于检测ApoE的抗体(以下，也称为“检测用抗体”)的复合物。此复合物可通过将尿试样、捕获用抗体和检测用抗体混合来形成。进而，通过使含复合物的溶液与可捕获捕获用抗体的固相接触，可在固相上形成上述的复合物。或者，也可使用预先固定捕获用抗体的固相。即，通过使固定捕获用抗体的固相、尿试样和检测用抗体接触，可在固相上形成上述的复合物。其中，当捕获用抗体及检测用抗体均为单克隆抗体时，优选表位互不同。
捕获用抗体向固相的固定的实施方式不特别限定。例如，可使捕获用抗体和固相直接结合，也可使捕获用抗体和固相经别的物质间接结合。作为直接的结合，例如，可举出物理的吸附等。作为间接的结合，例如，可举出经生物素和亲和素或链霉亲和素(以下，也称为“亲和素类”)的组合的结合。此时，通过将捕获用抗体预先用生物素修饰，使亲和素类预先结合于固相，可经生物素和亲和素类的结合，使捕获用抗体和固相间接结合。
固相的原料不特别限定，例如，可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可使这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，例如，可举出粒子、膜、微平板、微管、试管等。
通过将在固相上形成的复合物用在现有技术中公知的方法检测，可取得在尿中的ApoE的测定值。例如，作为检测用抗体，当使用用标记物质标记的抗体时，通过检测由其标记物质发生的信号，可取得ApoE的测定值。或者，当使用对于检测用抗体的标记第二抗体时，也可同样地取得ApoE的测定值。
在本实施方式中，也可在复合物的形成工序和复合物的检测工序之间，进行除去未形成复合物的未反应的游离成分的B/F(结合/游离(Bound/Free))分离。未反应的游离成分是指不构成复合物的成分。例如，可举出不与ApoE结合的捕获用抗体及检测用抗体等。B/F分离的手段不特别限定，如果固相是粒子，可通过由离心分离仅回收捕获复合物的固相而进行B/F分离。如果固相是微平板或微管等的容器，可通过除去含未反应的游离成分的液而进行B/F分离。另外，当固相是磁性粒子时，可通过在将磁性粒子用磁铁磁约束的状态下，由喷嘴吸除含未反应的游离成分的液而进行B/F分离。除去未反应的游离成分之后，也可将捕获复合物的固相用PBS等的适合的水性介质清洗。
在本说明书中，“检测信号”含定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度以如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。
标记物质只要是发生能检测的信号，就不特别限定。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而使信号发生的物质。作为信号发生物质，例如，可举出荧光物质、放射性同位元素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例如，可举出酶等。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、AlexaFluor(注册商标)等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位元素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，作为标记物质，也优选酶，特别优选碱性磷酸酶及过氧化物酶。
检测信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中，适宜选择根据来源于上述的标记物质的信号的种类的测定方法即可。例如，标记物质是酶时，可通过使用分光光度计等的公知的装置测定通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号来进行。
酶的底物可根据该酶的种类从公知的底物适宜选择。例如，作为酶使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。另外，作为酶使用过氧化物酶时，作为底物，可举出亮氨醇及其衍生物等的化学发光底物、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色底物。
当标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。另外，当标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可根据使用的荧光物质的种类适宜决定。
信号的检测结果也可作为ApoE的测定值使用。例如，当定量检测信号的强度时，可将从信号强度值本身或该强度值取得的值作为ApoE的测定值使用。作为从信号强度值取得的值，例如，可举出从ApoE的信号强度值减去阴性对照试样的信号强度值或背景的值的值。阴性对照试样可适宜选择，例如，可举出从健康者得到的尿等。
在本实施方式中，也可对于已知ApoE浓度的多个标准试样而取得ApoE的测定值，制成显示ApoE浓度和ApoE的测定值的关系的标准曲线。向此标准曲线应用从尿试样取得的ApoE的测定值，可取得尿中ApoE浓度的值。另外，为了回避尿量导致的误差，优选将取得的尿中ApoE浓度的值由受试者的尿中肌酸酐浓度的值修正。具体而言，优选将尿中ApoE浓度的值换算为肌酸酐每1g的ApoE浓度(μg/gCr)。由此，可在受试体间比较尿中ApoE浓度的值。
在本实施方式中，也可由使用固定于磁性粒子的捕获用抗体和经标记物质标记的检测用抗体的夹心ELISA法测定尿中ApoE浓度。此时，测定也可使用HISCL系列(Sysmex株式会社制)等的市售的全自动免疫测定装置进行。
在进一步的实施方式中，除了如上所述的尿中ApoE浓度的测定之外，也可测定尿中的其他肾病标志物浓度而取得尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比，在后述的向糖尿病性肾病2期往后发展的风险的判断中使用。上述的比可为尿中ApoE浓度的值相对于尿中的其他肾病标志物浓度的值的比，也可为尿中的其他肾病标志物浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值的比。其中，在本说明书中的“比”与比的值同义。例如，“A与B的比”是指“A/B”。
其他肾病标志物不特别限定，优选选自尿蛋白(uTP)、尿白蛋白(uALB)、α1-微球蛋白(α1M)、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、L型脂肪酸结合蛋白(LFABP)、脂质运载蛋白-2(NGAL)、肾损伤分子-1(KIM-1)、尿胆甾醇(uCHO)、IV型胶原、载脂蛋白A1(ApoA1)及载脂蛋白B(ApoB)，更优选选自uALB、NAG、NGAL、KIM-1、uCHO及ApoA1。
其他肾病标志物浓度可根据本领域技术人员公知的方法而测定，例如对于ApoE，可与上述同样地进行测定。另外，也可对于ApoE，与上述同样地，以适宜于其他肾病标志物浓度的测定的方式，对从受试者采集的尿进行预处理。
接下来，在本实施方式的方法中，基于尿中ApoE浓度的值而判断作为受试者的糖尿病性肾病1期的糖尿病患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高与否。具体而言，当尿中ApoE浓度的值不足指定的阈值时，可判断为受试者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高(即，可判断为是高风险组)。另外，当尿中ApoE浓度的值在指定的阈值以上时，可判断为受试者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险不高或低(即，可判断为是低风险组)。再者，糖尿病性肾病不仅被知是以1期、2期、3期、4期的顺序发展的病例，也被知是不经2期及3期而从1期向4期发展的病例。在前者的病例中，通过尿白蛋白/Cr比升高而从1期向2期往后发展。在后者的病例中，GFR区分恶化，从1期向4期发展。本实施方式的方法也可为从糖尿病性肾病1期向2期或4期发展的风险的判断方法。此时，在判断工序中，判断从糖尿病性肾病1期向2期或4期发展的风险。
当由本实施方式的方法判断为向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高时，如果受试者不受治疗，则也可预测为在指定的期间内病期向糖尿病性肾病2期往后发展，或者预测为采尿后半年至1年前肾功能降低。另外，当判断为向糖尿病性肾病2期往后发展的风险低时，即使受试者不受治疗，也可预测为在指定的期间内肾功能降低而病期不发展。作为指定的期间，例如可举出12个月、优选为6个月的期间。这样，本实施方式的方法能对于医师等提供辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的信息。再者，在“基于科学根据的糖尿病诊疗指南2013”(日本糖尿病学会)中，作为肾病的发病预防指导严格的血糖管理和血压管理。如果向显示微量白蛋白尿的糖尿病性肾病2期迁移，则指导由血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗药的治疗施用。在由本发明诊断为在糖尿病性肾病1期的阶段发展风险高的糖尿病患者中，可早期施用ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗药而预防向糖尿病性肾病2期往后发展。
上述的指定的阈值不特别限定，可适宜设定。例如，也可通过对于糖尿病性肾病1期的糖尿病患者而蓄积含尿中ApoE浓度的值的关于肾功能的数据，依经验设定指定的阈值。或者，也可如以下一样设定指定的阈值。首先，从多个糖尿病性肾病1期的糖尿病患者采集尿，对尿中ApoE浓度进行测定。从尿的采集起经过指定的期间后，对于这些患者而进行关于肾功能的检查，确认糖尿病性肾病的病期。将测定的尿中ApoE浓度的数据分类为肾功能降低的患者组的数据和肾功能不降低的患者组的数据。进而，求出能最高精度区别肾功能降低的患者组的尿中ApoE浓度和肾功能不降低的患者组的尿中ApoE浓度的值，以该值作为指定的阈值设定。在阈值的设定中，优选考虑灵敏度、特异性、阳性的中率、阴性的中率等。
在进一步的实施方式中，也可基于如上所述取得的尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比而判断向糖尿病性肾病2期往后发展的风险。在上述的比是尿中ApoE浓度的值相对于尿中的其他肾病标志物浓度的值的比时，在比不足指定的阈值之时，可判断为受试者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高，在比在指定的阈值以上之时，可判断为受试者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险不高或低。一方面，在上述的比是尿中的其他肾病标志物浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值的比时，在比在指定的阈值以上之时，可判断为受试者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高，在比不足指定的阈值之时，可判断为受试者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险不高或低。阈值的设定可对于基于尿中ApoE浓度的判断与上述同样地进行。
在本发明的范围中，也含在上述的对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断辅助方法中使用的试剂盒。即，本发明提供对糖尿病性肾病1期的糖尿病患者中的向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断用的试剂盒(以下，也称为“试剂盒”),其含用于捕获ApoE的与ApoE特异性地结合的第1捕获体、用于检测ApoE的与ApoE特异性地结合的第2捕获体和标记物质。标记物质是酶时，本实施方式的试剂盒也可还含对于该酶的底物。
在本实施方式中，第1捕获体、第2捕获体、标记物质及底物的形态不特别限定，可为固体(例如，粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如，溶液、悬浮液、乳浊液等)。在本实施方式中，第1捕获体、第2捕获体、标记物质及底物优选各自保存在不同的容器中或个别地包装。再者，对于尿试样、第1捕获体、第2捕获体、标记物质及底物的详细与在上述的诊断辅助方法的说明中所述的同样。在本实施方式中，优选第1捕获体及第2捕获体均为抗ApoE抗体。当第1捕获体及第2捕获体均为单克隆抗体时，优选表位互不同。
在本实施方式中，也可将收容上述的各种试剂的容器捆包到箱中，提供于使用者。在此箱中，也可同装试剂盒的附带文书。在此附带文书中，优选记载了例如，试剂盒的构成、尿中ApoE浓度的测定流程等。图1A显示本实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，510表示试剂盒，511表示收容第1捕获体的第1容器，512表示收容第2捕获体的第2容器，513表示收容作为标记物质的酶的第3容器，514表示收容酶的底物的第4容器，515表示附带文书，516表示捆包箱。
本实施方式的试剂盒也可还含用于对从受试者采集的尿进行预处理的预处理液。作为预处理液，优选上述的缓冲液。预处理液也可含用于使摄入ApoE的细胞增溶的表面活性剂。对于缓冲液及表面活性剂的详细与在上述的诊断辅助方法的说明中所述的同样。在本实施方式中，第1捕获体、第2捕获体、标记物质、底物及预处理液优选各自储存到不同的容器中或个别地包装。图1B显示还含预处理液的试剂盒的外观的一例。再者，对于固相的详细与在上述的诊断辅助方法的说明中所述的同样。图中，520表示试剂盒，521表示收容第1捕获体的第1容器，522表示收容第2捕获体的第2容器，523表示收容作为标记物质的酶的第3容器，524表示收容酶的底物的第4容器，525表示收容预处理液的第5容器，526表示附带文书，527表示捆包箱。
本实施方式的试剂盒也可还含用于使第1捕获体固定化的固相。此时，第1捕获体、第2捕获体、标记物质、底物及固相优选各自储存到不同的容器中或个别地包装。图1C显示还含固相的试剂盒的外观的一例。对于固相的详细与在上述的诊断辅助方法的说明中所述的同样。图中，530表示试剂盒，531表示收容第1捕获体的第1容器，532表示收容第2捕获体的第2容器，533表示收容作为标记物质的酶的第3容器，534表示收容酶的底物的第4容器，535表示固相(96孔微平板)，536表示附带文书，537表示捆包箱。图1D显示还含预处理液的试剂盒的外观的一例。图中，540表示试剂盒，541表示收容第1捕获体的第1容器，542表示收容第2捕获体的第2容器，543表示收容作为标记物质的酶的第3容器，544表示收容酶的底物的第4容器，545表示收容预处理液的第5容器，546表示固相(96孔微平板)，547表示附带文书，548表示捆包箱。
在进一步的实施方式中，也可使第1捕获体预先固定化于固相。再者，也可为标记物质预先与第2捕获体结合。此时，试剂盒含使第1捕获体固定化的固相、使标记物质结合的第2捕获体、及底物。图1E显示所述试剂盒的外观的一例。图中，550表示试剂盒，551表示收容使作为标记物质的酶结合的第2捕获体的第1容器，552表示收容酶的底物的第2容器，553表示使第1捕获体固定化的固相(96孔微平板)，554表示附带文书，555表示捆包箱。图1F显示还含预处理液的试剂盒的外观的一例。图中，560表示试剂盒，561表示收容使作为标记物质的酶结合的第2捕获体的第1容器，562表示收容酶的底物的第2容器，563表示收容预处理液的第3容器，564表示使第1捕获体固定化的固相(96孔微平板)，565表示附带文书，566表示捆包箱。
本实施方式的试剂盒在基于尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的方法中使用时，也可还含用于捕获其他肾病标志物的与其他肾病标志物特异性地结合的第3捕获体和用于检测其他肾病标志物的与其他肾病标志物特异性地结合的第4捕获体。
另外，本实施方式的试剂盒除了上述的各种试剂之外，也可适宜含固相的清洗液、酶反应的停止剂、校准品等。
在本发明的范围中，也含将上述的试剂用于对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断用试剂盒的制造。即，本发明涉及用于捕获ApoE的与ApoE特异性地结合的第1捕获体、用于检测ApoE的与ApoE特异性地结合的第2捕获体、及标记物质用于对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断用试剂盒的制造的用途。
在本发明的范围中，也含作为尿中ApoE浓度的值和其他肾病标志物浓度的值的比的、用于辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的标志物。
在本发明中，含适宜于辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的取得的装置。另外，在本发明中，也含计算机程序制品，其用于使计算机执行辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的取得。再者，该计算机程序制品所具备的介质非暂时记录计算机程序，并且，也可为计算机能读取的介质。
接下来，参照附图说明对于实施上述的本实施方式的方法适宜的装置的一例。但是，本发明不仅限定于此例中所示的形态。图2是用于取得辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的，发展风险诊断辅助装置的概略图。图2中所示的发展风险诊断辅助装置11含测定装置22和与该测定装置22连接的判断装置33。
在本实施方式中，测定装置的种类不特别限定，可根据ApoE的测定方法适宜选择。在图2中所示的例中，测定装置22是由使用标记抗体的ELISA法能检测发生的信号的板读取器。板读取器只要是使基于在标志物的测定中使用的标记物质的信号的检测成为可能，就不特别限定，可根据标记物质的种类适宜选择。在接下来说明的例中，信号是化学发光信号或荧光信号等的光学信息。
在测定装置22设置进行抗原抗体反应的板，则测定装置22取得基于与ApoE特异性地结合的标记抗体的光学信息，将得到的光学信息发送到判断装置33。再者，在测定装置22中取得的光学信息中，也含用于尿中ApoE浓度的值等的算出的浓度已知的受试体的信息。
判断装置33含计算机本体33a、输入部33b和显示受试体信息或判断结果等的显示部33c。判断装置33从测定装置22接收光学信息。进而，判断装置33的处理器执行取得基于光学信息而辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的程序。
图3是以功能块显示发展风险诊断辅助装置11的计算机本体33a的软件的框图。如图3所示，判断装置33具备接收部301、存储部302、算出部303、判断部304和输出部305。接收部301与测定装置22经网络能通信地连接。
接收部301接收从测定装置22发送的信息。存储部302存储用于算出对于判断必要的阈值及各标志物的浓度值的式或处理程序等。算出部303使用在接收部301中取得的信息，根据存储部302中存储的式而算出尿中ApoE浓度的值或尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比。判断部304判断由算出部303算出的尿中ApoE浓度的值或尿中ApoE浓度的值和尿中的其他肾病标志物浓度的值的比在存储到存储部302中的阈值以上或不足所述阈值。输出部305以由判断部304的判断结果作为辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据输出。
图4是显示图3中所示的计算机本体33a的硬件构成的框图。如图4所示，计算机本体33a具备CPU(中央处理单元(Central Processing Unit))330、ROM(只读存储器(ReadOnly Memory))331、RAM(随机访问存储器(Random Access Memory))332、硬盘333、输入输出接口334、读取装置335、通信接口336和图像输出接口337。CPU330、ROM331、RAM332、硬盘333、输入输出接口334、读取装置335、通信接口336及图像输出接口337由总线338能数据通信地连接。
CPU330能执行存储到ROM331的计算机程序及加载到RAM332上的计算机程序。CPU330通过执行应用程序，执行图3中所示的各功能。由此，判断装置33作为用于取得辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的装置发挥功能。
ROM331由掩模型ROM、PROM、EPROM、EEPROM等构成。在ROM331中，记录由CPU330执行的计算机程序及在其中使用的数据。
RAM332由SRAM、DRAM等构成。RAM332在ROM331及硬盘333中记录的计算机程序的读取中使用。RAM332是，另外在执行这些计算机程序之时，作为CPU330的作业区域利用。
硬盘333上安装有用于使CPU330执行的操作系统、应用程序(用于取得辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据的计算机程序)等的计算机程序及在所述计算机程序的执行中使用的数据。
读取装置335由软盘驱动器、CD-ROM驱动器、DVD-ROM驱动器等构成。读取装置335可读取在可移动型记录介质340中记录的计算机程序或数据。
输入输出接口334，例如，由USB、IEEE1394、RS-232C等的串行接口，SCSI、IDE、IEEE1284等的并行接口和由D/A变换器、A/D变换器等构成的模拟接口构成。在输入输出接口334上连接键盘、鼠标等的输入部33b。操作者能由所述输入部33b向计算机本体33a输入各种指令或数据。
通信接口336是例如，Ethernet(注册商标)接口等。计算机本体33a能由通信接口336向打印机等发送打印数据。测定装置22能由通信接口336向判断装置33发送测定数据(光学信息)。
图像输出接口337与由LCD、CRT等构成的显示部33c连接。由此，显示部33c可输出根据从CPU330给出的图像数据的影像信号。显示部33c根据输入的影像信号而显示图像(画面)。
接下来，对由发展风险诊断辅助装置11辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据取得的处理顺序进行说明。图5A是发展风险诊断的辅助数据取得的流程图的一例。其中，作为例举从基于与ApoE特异性地结合的标记抗体的光学信息等取得尿中ApoE浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值或尿中的其他肾病标志物浓度的值的比，使用得到的值或比进行判断的情况而进行说明。但是，本实施方式不仅限定于此例。
首先，在步骤S1-1中，发展风险诊断辅助装置11的接收部301从测定装置22接收光学信息。接下来，在步骤S1-2中，算出部303从接收部301接收的光学信息，根据存储部302中存储的用于算出尿中ApoE浓度的值等的式而算出尿中ApoE浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值或尿中的其他肾病标志物浓度的值的比。
其后，在步骤S1-3中，判断部304判断在步骤S1-3中算出的值或比不足存储到存储部302中的阈值，还是在其以上。其中，算出的值或比不足阈值时，程序进到步骤S1-4，判断部304将显示向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高的判断结果发送到输出部305。另外，算出的值或比是阈值以上之时，程序进到步骤S1-5，判断部304将显示向糖尿病性肾病2期往后发展的风险不高的判断结果发送到输出部305。
进而，在步骤S1-6中，输出部305输出判断结果，显示于显示部33c。由此，发展风险诊断辅助装置11可将辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的数据提供于医师等。
再者，在取得尿中的其他肾病标志物浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值的比，使用得到的比进行判断时，除了在关于上述的步骤S1-1～S1-6的记载中，将“尿中ApoE浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值或尿中的其他肾病标志物浓度的值的比”的词句换作“尿中的其他肾病标志物浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值的比”，将“不足”的词句换作“以上”，将“以上”的词句换作“不足”之外，可如上述的记载进行。此时的发展风险诊断的辅助数据取得的流程图的一例示于图5B。
接下来，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。
【实施例】
从作为糖尿病性肾病1期(第1期)的糖尿病患者的受试者采集血液及尿，在6个月后，将这些受试者分为糖尿病性肾病发展的组和未发展的组。对各组的受试者的血中及尿中的ApoE浓度进行比较。
(1)来自受试者的试样的采集
从尿白蛋白/Cr比低于30mg/gCr，并且GFR区分是30mL/min/1.73m2以上的糖尿病患者(n＝17)，作为试样采集血液及尿。
(2)生物标志物的测定
(2.1)血清中的肌酸酐的浓度的测定
使用L系统·CRE(Sysmex株式会社)及CRE标准液(Sysmex株式会社)，从受试者的血液测定血清肌酸酐(sCR)的浓度。具体性的操作根据试剂的附带文书。
(2.2)尿中的ApoE及肌酸酐的浓度的测定
将在上述(1)中得到的各受试者的尿和后述的试剂盒附带的Triton-X100/PBS等量混合之后，用受试体稀释液稀释25倍。使用Human Apolipoprotein E ELISA Pro Kit(CELL BIORAB,Inc公司)，从稀释的尿测定尿中的ApoE的浓度。具体性的操作除了代替血清而使用稀释的尿之外，根据试剂盒的附带文书。使用L系统·CRE(Sysmex株式会社)及CRE标准液(Sysmex株式会社)，从受试者的尿测定尿中肌酸酐的浓度。具体性的操作根据试剂的附带文书。为了修正尿量导致的误差，使用尿中肌酸酐的浓度，将测定的尿中ApoE浓度换算为肌酸酐每1g的浓度(μg/gCr)。
(2-3)此外的尿中标志物
作为肾脏病的其他尿中生物标志物，对肾损伤分子-1(KIM-1)、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿胆甾醇(uCHO)及脂质运载蛋白-2(NGAL)的尿中浓度进行测定。KIM-1浓度是根据附带文书使用KIM-1(人)Elisa Kit(Enzo life sciences Inc.)而测定。NAG浓度是根据附带文书使用L类型WAKONAG(和光纯药株式会社)及NAG校准品(和光纯药株式会社)而测定。uCHO浓度基于专利第4527925号中记载的方法而测定。NGAL浓度，除了将尿用试剂盒附带的受试体稀释液稀释50倍之外，根据附带文书使用NGAL(人)Elisa Kit(Enzo lifesciences Inc.)而进行测定。为了修正尿量导致的误差，使用尿中肌酸酐的浓度，将测定的各生物标志物的浓度换算为肌酸酐每1g的浓度(μg/gCr)。
(3)受试者的分类
从上述(1)的试样采集起6个月之间、从受试者定期采集血液，得到多个血液受试体(每个受试者3～6个受试体)。对各血液受试体的sCR浓度进行测定。从得到的sCR的测定值，根据下述的式而算出推算肾小球过滤量(eGFR)。式中，“Age”是受试者的年龄。
eGFR(mL/min/1.73m2)＝194×sCr-1.094×Age-0.287(当受试者是女性时，eGFR＝194×sCr-0.739×Age-0.287)
以试样采集时的eGFR值作为100％，除以其后6个月间的各采血日的eGFR，采尿日起每经过天数而进行标绘。以对于各标绘而通过起点(第0天,100％)的点的回归式的斜率作为发展性指标。将得到的发展性指标是0以上的受试者分类为eGFR未降低的组(以下，也称为“非发展组”(n＝8))，将发展性指标不足0的受试者分类为eGFR降低的组(以下，也称为“发展组”(n＝9))。
(4)统计学解析
从尿中生物标志物的值，将可预测6个月后的发展指标的值(6个月间的eGFR值的变化的斜率)与否用单回归分析评价。
(5)结果
解析结果示于表1。表中，“无比”表示各生物标志物的单独浓度的单回归分析的结果，“ApoE比”表示已知的肾病标志物浓度的值相对于ApoE浓度的值的比的单回归分析的结果。在表1中，当危险率P值低于0.05时称为有显著差异。
【表1】
无比 ApoE比
测定项目 危险率(P) 危险率(P)
NAG 0.688 0.003
NGAL 0.186 0.007
KIM-1 0.934 0.017
uCHO 0.380 0.00022
ApoE 0.024
如从表1明了，显示可从尿中ApoE浓度预测6个月后的eGFR的变化量，可高精度预测发展风险。另外显示，通过使用其他肾病标志物浓度的值相对于尿中ApoE浓度的值的比，可更高精度预测发展风险。
【符号的说明】
11：发展风险诊断辅助装置
22：测定装置
33：判断装置
33a：计算机本体
33b：输入部
33c：显示部
301：接收部
302：存储部
303：算出部
304：判断部
305：输出部
330：CPU
331：ROM
332：RAM
333：硬盘
334：输入输出接口
335：读取装置
336：通信接口
337：图像输出接口
338：总线
340：记录介质
510、520、530、540、550、560：试剂盒
511、521、531、541、551、561：第1容器
512、522、532、542、552、562：第2容器
513、523、533、543、563：第3容器
514、524、534、544：第4容器
525、545：第5容器
515、526、536、547、554、565：附带文书
516、527、537、548、555、566：捆包箱
535、546、553、564：固相

Claims (10)

1.诊断辅助装置，其为辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的装置，
所述装置具备含处理器及处于上述处理器的控制下的存储器的计算机，
在上述存储器中记录有用于在上述计算机中执行下述的步骤的计算机程序：
接收糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度的测定值的步骤，及
当尿中ApoE浓度的测定值不足指定的阈值时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高的步骤。
2.权利要求1所述的装置，其中在上述判断步骤中，当上述尿中ApoE浓度的测定值在指定的阈值以上时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险低。
3.权利要求1所述的装置，其中上述接收步骤接收上述患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度的测定值及尿中的其他肾病标志物浓度的测定值，
在上述判断步骤中，基于尿中ApoE浓度的测定值和尿中的其他肾病标志物浓度的测定值的比而判断向糖尿病性肾病2期往后发展的风险。
4.权利要求3所述的装置，其中在上述判断步骤中，
当尿中ApoE浓度的测定值相对于尿中的其他肾病标志物浓度的测定值的比不足指定的阈值时，或者
当尿中的其他肾病标志物浓度的测定值相对于尿中ApoE浓度的测定值的比在指定的阈值以上时，
判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高。
5.权利要求3或4所述的装置，其中在上述判断步骤中，
当尿中ApoE浓度的测定值相对于尿中的其他肾病标志物浓度的测定值的比在指定的阈值以上时，或者
当尿中的其他肾病标志物浓度的测定值相对于尿中ApoE浓度的测定值的比不足指定的阈值时，
判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险低。
6.权利要求3所述的装置，其中上述其他肾病标志物选自：uTP、uALB、α1-M、NAG、L-FABP、NGAL、KIM-1、uCHO、IV型胶原、ApoA1及ApoB。
7.权利要求3所述的装置，其中上述其他肾病标志物选自：uALB、NAG、NGAL、KIM-1、uCHO及ApoA1。
8.诊断辅助装置，其为辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的装置，
所述装置具备含处理器及处于上述处理器的控制下的存储器的计算机，
在上述存储器中记录有用于在上述计算机中执行下述的步骤的计算机程序：
接收糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度及尿中的其他肾病标志物浓度的测定值的步骤，及
基于尿中ApoE浓度的测定值和尿中的其他肾病标志物浓度的测定值的比而判断向糖尿病性肾病2期往后发展的风险的步骤。
9.辅助对向糖尿病性肾病2期往后发展的风险进行诊断的方法，其包括：
测定糖尿病性肾病1期的糖尿病患者的尿中载脂蛋白E(ApoE)浓度的工序，及
当尿中ApoE浓度的值不足指定的阈值时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险高的工序。
10.权利要求9所述的方法，其中在上述判断工序中，当上述尿中ApoE浓度的值在指定的阈值以上时，判断为上述患者向糖尿病性肾病2期往后发展的风险低。
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