CN107847644A - 非均质细丝和产生其的方法，支架和产生其的方法，微滴和产生其的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一个方面提供了产生非均质细丝的方法。该方法包括施加压力至多种细丝组分以将细丝组分移动至共同的出口通道内。本发明的另一方面提供了制造支架的方法。该方法包括根据本文所述的方法产生多种细丝。本发明的另一方面提供了根据本文所述的方法产生的支架。本发明的另一方面提供了包括多种相邻的细丝组分的非均质细丝。本发明的另一方面提供了产生微滴的方法。该方法包括：靠近交联液体定位打印尖端；施加压力至一种或多种液体以产生延伸到打印尖端的外侧之外的微滴；和使微滴与交联液体接触，从而产生微滴。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月27日提交的美国临时专利申请序列号62/197,329的优先权。该申请的全部内容在此通过引用被并入本文。
背景技术
动物和人模型的使用受测试方案的可行性、可利用性和伦理考虑的限制。因此，单层细胞培养用于研究潜在的抗癌剂。因为这些二维(2D)模型在微环境对肿瘤的化疗和非均质性的影响上给出非常少的反馈，单层研究是有限的。
发明内容
本发明的一个方面提供了产生非均质(heterogeneous)细丝(filament)的方法。该方法包括施加压力至多种细丝组分以将细丝组分移动至共同的出口通道内。
本发明的该方面可具有各种实施方式。多种细丝组分可以在共同的出口通道中彼此接触，但是保持基本上未混合。多种细丝组分可以在共同的出口通道中彼此接触并且混合。多种细丝组分可以在共同的出口通道中彼此接触并且混合以在相邻的细丝组分之间形成一个或多个浓度梯度。
多种细丝组分可选自：2、3、4、5、6、7、8、9和10种。
多种细丝组分可包括选自下述的一种或多种：聚合物、溶液、载细胞溶液、化学反应性溶液、水性溶液、藻酸钠溶液、牺牲支持材料、细胞、藻酸盐、交联剂、交联溶液、氯化钙溶液和水凝胶。
压力可以通过泵产生。泵可以是注射泵。
非均质细丝可以具有一维图案。非均质细丝可以具有二维图案。非均质细丝可以具有三维图案。
非均质细丝沿着纵轴可以是对称的。非均质细丝沿着纵轴可以是不对称的。
非均质细丝可以具有小于约1mm的最大横截面尺寸。非均质细丝可以具有小于约1μm的最大横截面尺寸。
本发明的另一方面提供了制造支架的方法。该方法包括根据本文所述的方法产生多种细丝。
本发明的另一方面提供了根据本文所述的方法产生的支架。
本发明的另一方面提供了包括多种相邻的细丝组分的非均质细丝。
本发明的该方面可具有各种实施方式。多种细丝组分可以在共同的出口通道中彼此接触，但是保持基本上未混合。多种细丝组分可以在共同的出口通道中彼此接触并且混合。多种细丝组分可以在共同的出口通道中彼此接触并且混合以在相邻的细丝组分之间形成一个或多个浓度梯度。
多种细丝组分可选自：2、3、4、5、6、7、8、9和10种。多种细丝组分可包括选自下述的一种或多种：聚合物、溶液、载细胞溶液、化学反应性溶液、水性溶液、藻酸钠溶液、牺牲支持材料、细胞、藻酸盐、交联剂、交联溶液、氯化钙溶液和水凝胶。
本发明的另一方面提供了产生微滴(droplet)的方法。该方法包括：靠近交联液体定位打印尖端；施加压力至一种或多种液体以产生延伸到打印尖端的外侧之外的微滴；和使微滴与交联液体接触，从而产生微滴。
本发明的该方面可以具有各种实施方式。微滴可以具有小于约1μL的体积。微滴可以具有小于约100nL的体积。
交联液体可以是氯化钙溶液。氯化钙溶液可以具有在约0.3g/L和约0.5g/L之间的浓度。氯化钙溶液可以具有在约0.5g/L和约1.0g/L之间的浓度。氯化钙溶液可以具有大于1.0g/L的浓度。
一种或多种液体可以包括选自下述的一种或多种：聚合物、溶液、载细胞溶液、化学反应性溶液、水性溶液、藻酸钠溶液、牺牲支持材料、细胞、藻酸盐、交联剂、交联溶液、氯化钙溶液和水凝胶。
定位步骤可包括将打印尖端定位在交联液体的表面的约100μm内。
微滴可以是非均质微滴并且施加压力步骤可以包括施加压力至多种液体。
微滴可以具有基本上球形形状。微滴可以具有基本上环形形状。微滴可以具有基本上平的和圆形形状。
附图说明
为了更完全地理解本发明的性质和期望的目的，参考以下结合附图的详细描述，其中贯穿几个视图中相同的参考字符表示相应的部件。
图1描绘了根据本发明的实施方式的至多三种材料的均质、非均质、轴对称和不对称的组合的微流体网络布局。
图2描绘了根据本发明的实施方式打印的纤维横截面的单位细胞设计。
图3描绘了根据本发明的实施方式将多种材料组合在1-维阵列中的示例性通道网络。
图4描绘了根据本发明的实施方式将用于控制非均质挤出的沉积头与多喷嘴沉积(MND)系统集成的同步多材料生物打印机(SMMB)的示例性方框图。
图5是根据本发明的实施方式为了可视化目的用三种不同材料灌注的制造的SMMB沉积头的照片。
图6描绘了根据本发明的实施方式使用精密挤出沉积(PED)和复制成型工艺制造SMMB沉积头的方法。
图7描绘了根据本发明的实施方式与使用SMMB沉积头打印非均质载细胞构造相关的各种设计因素。
图8呈现了根据本发明的实施方式的三种材料沉积头的照片。
图9呈现了根据本发明的实施方式在体积分数调整期间SMMB沉积通道的照片。
图10提供了根据本发明的实施方式沿着工具路径挤出以构建独立的支架(左)和在受控的构建循环内挤出以打印微滴(右)的照片。
图11提供了根据本发明的实施方式安装在运动系统上的同步多材料沉积头的示意图，该运动系统利用每种材料的体积分数的过程控制打印非均质线。
图12描绘了根据本发明的实施方式使用生物打印机和具有红色和绿色溶液的两个入口通道的多材料沉积头打印的方波图案中非均质打印的细丝。
图13是根据本发明的实施方式的微滴形成工艺阶段的示意图。
图14A和14B是根据本发明的实施方式分配微滴的照片。
图15A和15B提供了根据本发明的实施方式作为纳升微滴在沉积头的尖端上聚集的红色和绿色藻酸盐的照片。照片是彩色界定的以呈现分开的红色和绿色的流。
图16A和16B描绘了根据本发明的实施方式分配在0.2g/mL氯化钙内的藻酸盐。
图17提供了根据本发明的实施方式用于打印非均质纳升微滴的分析模型。
定义
参考下述定义最清楚地理解本发明。
如本文所使用，除非上下文以其他方式明确指示，单数形式“一个(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数参考对象。
除非专门陈述或者从上下文显而易见，如本文所使用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以被理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非由上下文以其他方式明确，本文提供的所有数值由术语约修饰。
如在说明书和权利要求书中所使用的，术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等等可以具有专利法中赋予它们的含义，并且可以意指“包括(include)”、“包括(including)”等等。
除非专门陈述或者从上下文显而易见，如本文所使用的术语“或”被理解为包含性的。
本文提供的范围应当理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括选自如下的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(以及其分数，除非上下文以其他方式明确指示)。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了多输入微流体打印头以通过将多个表型包装在单个细丝中改善生物打印机的分辨率。多输入微流体打印头可以被独立地使用或除了现有的分配系统以外独立地使用以挤出分层细丝，可能实现更高的分辨率和细胞接种控制。
由于微尺度横截面通道中的低惯性力，微流体技术将多个材料入口组合在单个出口通道中而不混合。沉积头的实施方式可以利用不混合的微流体流以在沉积之前将多种材料组合在非均质阵列中。本发明的实施方式提高了在多喷嘴沉积(MND)上的打印分辨率，并且使得在沉积之前能够发生物质转移和化学反应，比如部分交联。
本发明的实施方式可以通过下述过程产生诸如支架的结构。首先，可以基于目标材料的组成、功能组织、支持材料和交联溶液的要求选择组分材料。第二，可以基于细胞与细胞的体内接触和构建要求限定材料的排列。每种构成组分的体积分数可以在构建循环期间动态变化，并且不受沉积头中的通道网络的限制。第三，可以限定通道网络的布局以如图1中所描绘的以非均质或轴对称式样装配材料。
图2描绘了使用本发明的实施方式打印的纤维横截面的单位细胞设计。细丝可以由各种液体——包括溶液(例如，载细胞的、化学反应性的等等)——和牺牲支持材料组成，以产生空隙空间。每种溶液的体积分数可以使用由可编程注射泵控制的流速来调节。溶液的装配可以通过微流体系统控制。二维微流体系统可以产生溶液的1-维阵列。更复杂的三维微流体系统可以产生溶液的2-维阵列。在图3中描绘了将多种材料组合在1-维阵列中的示例性通道网络。
图4提供了将用于控制非均质挤出的沉积头与多喷嘴沉积(MND)系统集成的同步多材料生物打印机(SMMB)的示例性方框图。
通过SMMB挤出的非均质细丝的设计可以被沉积头中的通道网络控制。图5是为了可视化目的用三种不同材料灌注的制造的SMMB沉积头的照片。
图6描绘了根据本发明的实施方式使用精密挤出沉积(PED)和复制成型工艺制造SMMB沉积头的方法。
图7描绘了与使用SMMB沉积头打印非均质载细胞构造相关的各种设计因素。
基于SMMB沉积头通道网络的设计和工艺参数设定的选择可以构建非均质阵列的内部特征。因为可以在制造期间调整工艺参数，所以内部特征的设计变量也可以在构建循环中被动态调整。相邻材料的单个或集合的宽度是一个这样的可控制的设计变量。参数研究扫过一组流动速率以减小在轴对称组合出口通道中两种材料的组合宽度。图8呈现了三种材料沉积头的照片。从左到右，红色材料的流动速率增加，而绿色和黄色的流动速率保持不变。绿色和黄色的组合宽度从左到右减小。因为流动速率相等，所以绿色到黄色的体积分数保持不变。
可以调节溶液的体积分数，同时维持两种溶液的组合宽度不变。图9呈现了在体积分数调整期间SMMB沉积通道的照片。在第二参数研究中，红色流动速率保持不变，并且黄色和绿色的组合流动速率保持不变，但是调节黄色到绿色的体积分数。从左到右，通过增加绿色与黄色流动速率的比例使绿色的体积分数增加。黄色和绿色总的流动速率是不变的。在整个研究中，因为红色与总流动速率的比例是不变的，所以红色的体积分数是不变的。
本文描述的SMMB系统的实施方式将多种材料组合在非均质阵列中并沿着预先编程的三维工具路径沉积那些材料。该工艺的自动化为图10中描绘的可成形性提供了至少两次不同的机会。
首先，非均质细丝使能够进行独立的支架的逐层制造或者在沿工具路径沉积的微流体装置的通道中进行受控的细胞接种。多个沉积头可以同时集成在单个SMMB系统中。多个集成的沉积头提供与多喷嘴打印相同的益处，其包括补充的交联溶液或二次非均质材料组。
其次，可以如本文所述产生非均质纳升微滴。微滴体积是可控制的工艺参数。
打印细丝
SMMB的自动化材料输送系统和运动系统可以产生细丝和微滴二者。SMMB支架打印提高了多喷嘴沉积(MND)打印的分辨率，并且提供了组合出口通道，作为在受控的时间间隔内化学反应或物质种类转移的机会。部分或完整的交联是利用组合的出口通道的一种方法。SMMB微滴打印产生比支架打印更简单的产品。然而，打印的微滴是更易于接受和能适应的技术。微滴更易于设计、制造，并确保足够的营养扩散到载细胞核心。微滴也可以用在许多现有的生物反应器平台中。在一个实施方式中，打印的共培养纳升微滴是人肝脏的模型，以使用旋转细胞培养系统研究微重力对细胞形态和药物摄取的影响。
同步多材料生物打印机(SMMB)分配系统可以与现有的多喷嘴沉积(MND)系统集成以沿着工具路径连续地挤出非均质细丝。可以通过一组几何设计变量来限定沿着工具路径对非均质长丝构图的SMMB系统性能，以控制出口通道中的打印的细丝横截面宽度/高度，反应时间。设计变量ΨSMMB,D可以通过微滴体积VD和材料i与材料j的体积分数，γij来定义。
图11提供了安装在运动系统上的同步多材料沉积头的示意图，该运动系统利用每种材料的体积分数的过程控制打印非均质线。图11还描绘了示例性打印的细丝的内部架构。
图12描绘了使用生物打印机和具有红色和绿色溶液的两个入口通道的多材料沉积头打印的方波图案中非均质打印的细丝。在多材料沉积头中的微流体网络的示意图描绘了在单个出口通道中组合的红色和绿色流。生物打印机的运动系统将沉积头运载在固定基底上以产生方波图案。显示了以方波图案(A)打印的藻酸盐细丝以及绿色(B)和红色(C)藻酸盐的二元对比度增强的照片。
打印微滴
溶液可以被制备并装载至SMMB材料输送系统注射泵中，用于在构建循环期间受控的挤出。在这项工作中，分别由蒸馏水制备来自褐藻的藻酸钠盐的藻酸钠水溶液和ACS级氯化钙的交联溶液。将藻酸盐溶液装载到SMMB材料输送系统中，并且交联溶液充满位于打印尖端下方的储液池。SMMB沉积头出口尖端降低到交联池上方小于100μm。可编程注射泵通过沉积头挤出藻酸盐。藻酸盐聚集在尖端上，直到与交联储液池接触。在接触时，微滴从尖端释放并在交联储液器中凝胶化以形成藻酸盐池。可以使用工艺参数来调节构建循环周期或打印一个微滴的时间以制造可变尺寸的微滴。图13是工艺阶段的示意图。图14A和14B是分配微滴的照片。
现在参照图15A和15B，材料作为纳升微滴聚集在沉积头的尖端上。可以分析聚集的微滴的照片，用于混合。均质的微滴呈现红色。非均质的微滴呈现红色和绿色两种。两种颜色呈现在微滴的离散侧上。
由于打印过程的惯性力，微滴可成形性的成功要求藻酸盐在分配到交联池中之前在交联池中凝胶化。如果交联浓度低，则流动的流体的惯性力在凝胶化之前使微滴的球形结构降解。藻酸盐水溶液将流动直到与交联溶液接触引起凝胶化的足够时间。此外，通过控制交联时间产生打印的微滴坚固性(例如圆环或球形)。交联时间是藻酸盐和氯化钙浓度的函数。氯化钙在蒸馏水中的交联浓度可以控制在约0.2g/mL和1.0g/mL之间。整个研究中藻酸盐浓度可以为恒定的0.5％(w/v)。对于给定浓度的藻酸盐，交联所需的时间长度可以与交联溶液的浓度逆相关。分配到交联池中的微滴的定时间隔照片呈现了交联溶液浓度对微滴可成形性和产生圆环结构的能力的影响。图16A和16B描绘了分配在0.2g/mL氯化钙内的藻酸盐。打印的材料从沉积点流走并降解任何打印的结构。交联储液池的进一步扰动将引起微滴扭曲并失去所有可识别的形状。
图17提供了用于打印非均质纳升微滴的分析模型。
备注
新型的同步多材料生物打印机将微流体技术与三维细胞打印集成以沿着工具路径或作为纳升微滴包装多种载细胞材料和交联溶液。体外支持细胞活性的仿生装配和在细胞之间征求旁分泌/自分泌信号传递呈现了方法学进展，以引导细胞团块执行组织水平功能；以及应用于组织工程学和通常构建的生物构造。生物打印是工程构建生物系统的促成技术。使构建生物系统中的生物学和架构与可重复性和工程过程控制联系需要先进的制造。生物打印是计算机辅助制造方法，其具有在成分和内部特征的(1)宏观尺度(10-3-10- 1m)架构和(2)微观尺度(10-4-10-5m)非均质包装上的过程控制。如果构建的生物系统被设计为物理上适合于更大的系统，则宏观架构是关键的。生物体和支持人工制品的微观非均质包装对于构建的生物系统的功能是关键的。在打印过程中，与生物非均质地包装的另外的人工制品在空间-时间上影响所构建系统的力学、物理学和化学。人工制品候选物包括承载结构元件、用于扩散的开放多孔网络、功能化或磁性纳米颗粒以及压电/导电组件。
在计算机可读介质和/或硬件中的实施
本文描述的方法可以容易地在可存储在计算机可读介质中用于被计算机处理器执行的软件中实施。例如，计算机可读介质可以是易失性存储器(例如，随机存取存储器等)、非易失性存储器(例如，只读存储器、硬盘、软盘、磁带、光盘、纸带、穿孔卡片等)。
另外地或可选地，本文描述的方法可以在计算机硬件诸如专用集成电路(ASIC)中实施。
等价形式
虽然已经使用特定术语描述了本发明的优选实施方式，但是这样的描述仅用于说明性目的，并且应当理解，可以做出改变和变型，而不背离所附权利要求的精神或范围。
通过引用并入
本文引用的所有专利、公开的专利申请和其他参考文献的全部内容在此通过引用以其整体被明确地并入本文。
此外，申请人注意到，并由此通过引用将申请人描述3D打印设备的以下出版物并入本文：美国专利号8,639,484和美国专利申请公开号2006/195179、2008/020049、2008/145639、2009/263849、2011/136162、2011/165646、2011/177590和2012/080814。
Claims (36)
1.一种产生非均质细丝的方法，所述方法包括：
施加压力至多种细丝组分以将所述细丝组分移动至共同的出口通道内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种细丝组分在所述共同的出口通道中彼此接触，但是保持基本上未混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种细丝组分在所述共同的出口通道中彼此接触并且混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种细丝组分在所述共同的出口通道中彼此接触并且混合以在相邻的细丝组分之间形成一个或多个浓度梯度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种细丝组分选自：2、3、4、5、6、7、8、9和10种。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种细丝组分包括选自下述的一种或多种：聚合物、溶液、载细胞溶液、化学反应性溶液、水性溶液、藻酸钠溶液、牺牲支持材料、细胞、藻酸盐、交联剂、交联溶液、氯化钙溶液和水凝胶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述压力通过泵产生。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述泵是注射泵。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝具有一维图案。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝具有二维图案。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝具有三维图案。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝沿着纵轴是对称的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝沿着纵轴是不对称的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝具有小于约1mm的最大横截面尺寸。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述非均质细丝具有小于约1μm的最大横截面尺寸。
16.一种制造支架的方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的方法产生多种细丝。
17.根据权利要求21所述的方法产生的支架。
18.一种非均质细丝，其包括：
多种相邻的细丝组分。
19.根据权利要求18所述的非均质细丝，其中所述多种细丝组分在共同的出口通道中彼此接触，但是保持基本上未混合。
20.根据权利要求18所述的非均质细丝，其中所述多种细丝组分在共同的出口通道中彼此接触并且混合。
21.根据权利要求18所述的非均质细丝，其中所述多种细丝组分在共同的出口通道中彼此接触并且混合以在相邻的细丝组分之间形成一个或多个浓度梯度。
22.根据权利要求18所述的非均质细丝，其中所述多种细丝组分选自：2、3、4、5、6、7、8、9和10种。
23.根据权利要求18所述的非均质细丝，其中所述多种细丝组分包括选自下述的一种或多种：聚合物、溶液、载细胞溶液、化学反应性溶液、水性溶液、藻酸钠溶液、牺牲支持材料、细胞、藻酸盐、交联剂、交联溶液、氯化钙溶液和水凝胶。
24.一种产生微滴的方法，所述方法包括：
靠近交联液体定位打印尖端；
施加压力至一种或多种液体以产生延伸到所述打印尖端的外侧之外的微滴；和
使所述微滴与所述交联液体接触；
从而产生微滴。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述微滴具有小于约1μL的体积。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述微滴具有小于约100nL的体积。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述交联液体是氯化钙溶液。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述氯化钙溶液具有在约0.3g/L和约0.5g/L之间的浓度。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述氯化钙溶液具有在约0.5g/L和约1.0g/L之间的浓度。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述氯化钙溶液具有大于1.0g/L的浓度。
31.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种液体包括选自下述的一种或多种：聚合物、溶液、载细胞溶液、化学反应性溶液、水性溶液、藻酸钠溶液、牺牲支持材料、细胞、藻酸盐、交联剂、交联溶液、氯化钙溶液和水凝胶。
32.根据权利要求24所述的方法，其中所述定位步骤包括将所述打印尖端定位在所述交联液体的表面的约100μm内。
33.根据权利要求24所述的方法，其中所述微滴是非均质微滴并且所述施加压力步骤包括施加压力至多种液体。
34.根据权利要求24所述的方法，其中所述微滴具有基本上球形形状。
35.根据权利要求24所述的方法，其中所述微滴具有基本上环形形状。
36.根据权利要求24所述的方法，其中所述微滴具有基本上平的和圆形形状。
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