CN107807242A - 基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 - Google Patents

基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用。该选择性模拟酶为全氟溴辛烷PFOB增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶PFOB‑MIP，基于金纳米颗粒的类氧化酶特性，利用氨基苯硼酸实现对糖类分子的结合与亲和力提升，并进一步结合分子印迹技术构建针对底物分子的选择性壳层，同时采用全氟溴辛烷作为氧供给池，从而构建出能对糖类进行选择性识别催化并具有更强催化活性的模拟氧化酶，并将其应用于血糖及食品中糖类的检测。

Description

基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及应用
技术领域
本发明涉及基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及其在糖类检测中的应用，属于纳米材料及生物医学纳米技术领域。
背景技术
和天然酶相比，金纳米颗粒等金属模拟酶具有价格低、产量高、稳定性好等优点，但是其最大的缺陷之一就是缺乏选择性。自阎锡蕴提出Fe3O4具有类过氧化物酶活性后，越来越多的人被金属纳米材料的类酶特性吸引。而相比于其他纳米材料，AuNPs有着独特的优势，比如其催化活性可随粒径改变发生很大的变化。由于其在Glu酶解中的巨大潜力，AuNPs更是被广泛应用于工业生产、科学研究与生物医学检测中。一方面，当颗粒小到一定程度时，葡萄糖氧化酶与AuNPs能发生电子传递，进而增强葡萄糖氧化酶的催化能力。另一方面，AuNPs本身也可以表现出类酶活性，直接催化Glu氧化，和相同尺寸和剂量的铂、铜、银等金属纳米颗粒相比，AuNPs对Glu的催化能力强得多。
虽然金属纳米颗粒作为模拟酶，具有比天然酶稳定性好、来源充足等优势，但因为没有特异性结合位点，无法实现选择性，催化活性也大多有限。对于模拟酶的显著缺陷，鲜有工作能够解决。目前提出的一些解决方案，例如抗体酶等，普遍具有制备过程过于复杂、成本较高等明显的局限性，也大多无法在提升选择性和催化活性两方面同时得到改善。
虽然裸的AuNPs可以对Glu以及类似的糖类表现出类酶活性，但是缺乏选择性，催化活性方面也有提升空间。由于APBA可以在中性或碱性条件下能识别邻位羟基并与之结合，因而有望用于提升AuNPs在催化中对糖类分子的选择性，同时也能够通过增强对糖类分子的亲和力获得更高的催化效率。
分子印迹技术是构建选择性结构的优良手段，在解决模拟酶选择性方面有着可观的应用前景。其基本原理是选择合适的功能单体与印迹分子相结合形成分子印迹聚合物，然后洗脱掉印迹分子，再利用分子印迹聚合物上的结合位点选择、识别、记忆目标分子。利用分子印迹技术，有望在发挥金属模拟酶特有的优越性的基础上，改善其在选择性和催化效率上的缺陷。
发明内容
技术问题：为了发挥模拟酶的优势同时克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及其在糖类检测中的应用。该方法通过将金纳米颗粒与氨基苯硼酸与全氟溴辛烷结合，利用分子印迹技术，提高金纳米颗粒模拟酶的催化活性，并实现对底物的选择性。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，该选择性模拟酶为全氟溴辛烷PFOB增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶PFOB-MIP，该构建方法包括以下步骤：
1)将巯基或氨基末端磷脂溶于氯仿，80-100℃下与纯水混合，并滴入PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB；
2)将聚苯乙烯微球PS与牛血清白蛋白BSA混合，于中性或偏酸性体系中孵育后离心去除游离BSA；
3)加入金纳米颗粒AuNPs，孵育后离心去除多余AuNPs；
4)同时加入氨基苯硼酸APBA和巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置；
5)加入葡萄糖Glu，4-40℃震荡；
6)加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡；
7)加入过硫酸铵水溶液和磷酸缓冲液PBS，充氮后37-80℃震荡12-24h；
8)用PBS洗涤去除印迹分子，每次离心中间室温震荡，得到基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶。
其中；
所述步骤3)中的金纳米颗粒粒径为1-100nm。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶，粒径为10-5000nm。
步骤3)所述加入金纳米颗粒AuNPs，其方法是将金纳米颗粒AuNPs溶于超纯水，浓度为5-200μg/ml。
步骤7)中，所述过硫酸铵水溶液浓度为4-100mg/ml。
步骤7)中，所述磷酸缓冲液PBS浓度为0.01-0.2M，pH＝7-9。
本发明的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化氧化中的应用。
该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类检测中的应用包括以下步骤：将糖溶液与辣根过氧化物酶、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶混合，室温静置3-120min后读取405nm处吸光度。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在含糖食品检测中的应用。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖与尿糖检测中的应用。
有益效果：本发明构建了基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶，将其用于催化糖类分子氧化，同时得到了对底物的选择性和对催化活性的增强，并应用于含糖食品和血糖、尿糖的检测。
相对于现有技术，具有以下突出的优势：
(1)本发明利用APBA对糖类的特异性识别与结合功能，将APBA偶联到AuNPs表面有效提升了AuNPs对糖类分子的亲和力，初步实现了对糖类分子的选择性，并提高了催化活性。
(2)本发明在利用APBA对糖类分子的识别与结合的基础上，又结合了分子印迹技术构建了能对以Glu为例的单一分子进行选择识别的壳层，并在该多层复合物中加入具有载氧能力的PFOB以进一步促进氧化反应的进行，获得了对单一底物具有选择性且催化活性显著增强的增强型选择性模拟酶。
(3)本发明将基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶用于催化糖类分子氧化，在保留了金属模拟酶稳定、低价等优点的同时，改善了通常无底物选择性且活性较低的缺陷，并成功用于含糖食品及血糖、尿糖的检测。
附图说明
图1为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建原理图。
图2为全氟溴辛烷增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的扫描电镜照片。
图3为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶催化葡萄糖氧化催化动力学结果。
图4为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖的浓度依赖催化曲线比较。
图5为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖亲和力(Km)比较。
图6为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖催化效率(kcat/Km)比较。
图7为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶及增强的选择性模拟酶与金纳米颗粒对葡萄糖催化效率增强倍数比较。
图8为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶催化选择性结果，显著提升对模板分子的催化活性的情况下，对其他糖类催化活性无明显改变。
图9为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖检测中的应用。
图10为基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在常见饮料中糖分检测中的应用。
具体实施方式
本发明提供了一种基于金纳米颗粒类氧化酶特性的选择性模拟酶构建及其应用方法，该方法基于金纳米颗粒氧化酶特性，结合分子印迹技术和全氟溴辛烷供氧来制备具有选择性和高活性模拟酶的方法，包括以下步骤：
1)将10-100mg巯基或氨基末端磷脂溶于1-10ml氯仿，100℃下与10-100ml纯水混合，并滴入100-5000μl PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB。
2)将1-10mg PS与0.1-10mg BSA混合，于10ml中性或偏酸性体系中孵育10-24h后离心去除游离BSA。
3)加入10ml AuNPs(溶于超纯水，浓度为5-200μg/ml)，孵育0.5-12h后离心去除多余AuNPs。
4)同时加入1-25mgAPBA和1-20ml巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置1-12h。
5)加入1-20mg Glu，4-40℃震荡1-3h。
6)加入10-200mgN,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡1-3h。
7)加入0.1-2ml过硫酸铵水溶液(浓度为4-100mg/ml)和5-20ml PBS(浓度为0.02M，pH9)，充氮10min后60℃震荡12-24h。
8)用PBS(浓度为0.02M，pH5)洗涤3次去除印迹分子，每次离心中间室温震荡1-12h。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶中金纳米颗粒粒径为1-100nm。
所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶粒径为10-5000nm。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化氧化中的应用。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类检测中的应用，包括以下步骤：将糖溶液(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，1-20mg/ml)、ABTS(1μl，1-20mg/ml)和基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶混合，室温静置3-120min后读取405nm处吸光度。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在含糖食品检测中的应用。
所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖与尿糖检测中的应用。
本发明所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶可以用于构建对糖类分子具有选择性的模拟酶，包括但不限于葡萄糖。
本发明所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶可以用于检测混合物中的糖类成分，包括但不限于对含糖食品及血糖、尿糖的检测。
实施例1：全氟溴辛烷增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建
以蛋白作为偶联媒介将AuNPs包覆到PS上，通过静电吸附或化学吸附将APBA与氨基末端磷脂包被的PFOB偶联到AuNPs上，令APBA充分结合特定糖类印迹分子，在N,N-亚甲基双丙烯酰胺存在下由过硫酸铵引发APBA聚合成壳层，在酸性条件下离心洗脱印迹分子即得PFOB-MIP。
1.试剂及设备：
金纳米颗粒，聚苯乙烯微球，牛血清白蛋白，氨基苯硼酸，全氟溴辛烷，巯基或氨基末端磷脂，葡萄糖，过硫酸铵，氯仿，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾，封闭电炉，精密增力电动搅拌器，冷冻离心机。
2.实施方法：
将50mg氨基末端磷脂溶于2ml氯仿，100℃下与20ml纯水混合，并滴入500μl PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB。将10mg PS与10mg BSA混合，于10ml接近中性体系中孵育12h后离心去除游离BSA。加入10ml金纳米颗粒溶液(粒径为10nm，溶于超纯水，浓度为50μg/ml)，孵育12h后离心去除多余AuNPs。同时加入10mg APBA和10ml氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置2h。加入4mg葡萄糖，37℃震荡1h。加入40mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡2h。加入0.7ml过硫酸铵水溶液(浓度为10mg/ml)和10ml PBS(浓度为0.02M，pH9)，充氮10min后60℃震荡12h。用PBS(浓度为0.02M，pH5)洗涤3次去除印迹分子，前次离心前室温震荡1h，第三次离心前室温震荡12h，保存于PBS(浓度为0.02M，pH7.4)中。
3.实施结果：
如图1构建PFOB-MIP。如图2扫描电镜照片可见，APBA在聚苯乙烯微球表面形成粗糙壳层，该壳层上具有可选择性结合模板分子的孔洞，从而实现对Glu的选择性催化氧化。
实施例2：全氟溴辛烷增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化中的应用
将PFOB-MIP与待测样品混合，体系调整至中性或碱性条件，60℃催化反应3-120min，用ABTS显色，于相应波长下检测。
1.试剂及设备：
磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，辣根过氧化物酶，2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，葡萄糖，麦芽糖，果糖，半乳糖，酶标仪。
2.实施方法：
将糖溶液(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，10mg/ml)、ABTS(1μl，10mg/ml)、PBS(50μl，0.02M，pH7.4)和PFOB-MIP或未加入PFOB制备的模拟酶MIP(100μl)混合，室温静置30min后读取405nm处吸光度。
3.实施结果：
如图3-7所示，通过分子印迹技术构建的选择性模拟酶相比于AuNPs本身对Glu具有显著提升的催化活性，加入用于载氧的PFOB后催化效率得到进一步提升(图3及图4)，对底物的亲和力更强(图5)，进而可提升催化效率至约270倍(图6及图7)。如图8所示，通过分子印迹技术构建的选择性模拟酶表现出明显的底物选择性，在大幅提升对Glu的催化活性的同时，对其他糖类的催化活性没有显著改变。
实施例3：通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖检测中的应用
将MIP与待测样品混合，体系调整至中性或碱性条件，60℃催化反应3-120min，用ABTS显色，于相应波长下检测。
1.试剂及设备：
磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，辣根过氧化物酶，ABTS，血清样本，酶标仪。
2.实施方法：
将血清样本(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，10mg/ml)、ABTS(1μl，10mg/ml)、PBS(50μl，0.02M，pH7.4)和PFOB-MIP(100μl)混合，室温静置30min后读取405nm处吸光度。
3.实施结果：
如图9所示，PFOB-MIP用于血糖检测，可以获得良好的线性结果，能够达到和天然酶类似的检测效果。
实施例4：通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在食品分析中的应用
1.试剂及设备：
磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，辣根过氧化物酶，ABTS，血清样本，酶标仪。
2.实施方法：
将几种市面常见饮料(屈臣氏矿泉水、百威啤酒、可口可乐、七喜、瓶装雀巢咖啡、速溶立顿奶茶)、10％葡萄糖溶液和纯水(50μl)与辣根过氧化物酶(1μl，10mg/ml)、ABTS(1μl，10mg/ml)、PBS(50μl，0.02M，pH7.4)和PFOB-MIP及葡萄糖氧化酶溶液(100μl)混合，室温静置30min后读取405nm处吸光度。
3.实施结果：
如图10所示，将PFOB-MIP用于饮料中葡萄糖的检测，可以获得和天然酶一致的检测结果。

Claims (10)

1.一种基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：该选择性模拟酶为全氟溴辛烷PFOB增强的通过分子印迹技术构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶PFOB-MIP，该构建方法包括以下步骤：
1)将巯基或氨基末端磷脂溶于氯仿，80-100℃下与纯水混合，并滴入PFOB，冷却后超声分散获得巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB；
2)将聚苯乙烯微球PS与牛血清白蛋白BSA混合，于中性或偏酸性体系中孵育后离心去除游离BSA；
3)加入金纳米颗粒AuNPs，孵育后离心去除多余AuNPs；
4)同时加入氨基苯硼酸APBA和巯基或氨基末端磷脂包覆的PFOB，室温静置；
5)加入葡萄糖Glu，4-40℃震荡；
6)加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，室温震荡；
7)加入过硫酸铵水溶液和磷酸缓冲液PBS，充氮后37-80℃震荡12-24h；
8)用PBS洗涤去除印迹分子，每次离心中间室温震荡，得到基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶。
2.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中的金纳米颗粒粒径为1-100nm。
3.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶，粒径为10-5000nm。
4.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：步骤3)所述加入金纳米颗粒AuNPs，其方法是将金纳米颗粒AuNPs溶于超纯水，浓度为5-200μg/ml。
5.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：步骤7)中，所述过硫酸铵水溶液浓度为4-100mg/ml。
6.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的构建方法，其特征在于：步骤7)中，所述磷酸缓冲液PBS浓度为0.01-0.2M，pH＝7-9。
7.一种如权利要求1所述方法构建的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类催化氧化中的应用。
8.如权利要求7所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：该基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在糖类检测中的应用包括以下步骤：将糖溶液与辣根过氧化物酶、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶混合，室温静置3-120min后读取405nm处吸光度。
9.如权利要求7所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：所述基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在含糖食品检测中的应用。
10.如权利要求7所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶的应用，其特征在于：所述的基于金纳米颗粒氧化酶特性的选择性模拟酶在血糖与尿糖检测中的应用。
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CN110836971A (zh) * 2019-11-21 2020-02-25 电子科技大学 用于血糖检测纳米标志物、基于其的动态近红外光谱无损血糖仪及其制备方法
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