背景技术
狂犬病是一种由狂犬病病毒导致的高死亡率的人畜共患性疾病。据世界卫生组织资料,全球每年约55000人死于狂犬病,这些死亡病例大部分来自亚洲和非洲等发展中国家的农村地区,中国是仅次于印度的狂犬病高发国家。因此,狂犬病是许多发展中国家严重的公共健康问题。
狂犬病病毒是一种嗜神经病毒,基因组为单链RNA,长度约12kb,编码五种蛋白:核蛋白(N),磷酸化蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)以及RNA依赖的RNA聚合酶(L)(A.R.Fooks,A.C.Banyard,D.L.Horton,N.Johnson,L.M.McElhinney,and A.C.Jackson,"Current status of rabies and prospects for elimination,"Lancet,vol.384,pp.1389-99,Oct 11 2014;M.J.Schnell,J.P.McGettigan,C.Wirblich,and A.Papaneri,"The cell biology of rabies virus:using stealth to reach the brain,"NatureReviews Microbiology,vol.8,pp.51-61,Jan 2010)。G蛋白是主要的病毒抗原,是中和抗体的主要作用靶标,可诱导产生特异性免疫保护反应。
接种狂犬病疫苗是目前唯一有效的狂犬病防治手段。然而现有疫苗在安全性、免疫效果、产效等方面存在不足,不能满足现代社会的需求。
目前临床上主要使用灭活狂犬病毒疫苗预防狂犬病的感染。然而化学试剂对病毒的灭活可能改变病毒抗原的结构而降低疫苗的免疫原性(H.C.J.Ertl,"Novel Vaccinesto Human Rabies,"Plos Neglected Tropical Diseases,vol.3,Sep 2009)。现有狂犬病疫苗的免疫原性不佳,用于暴露后免疫需要多次接种,极大地增加了免疫成本。
病毒样颗粒(virus like particles,VLP)是病毒蛋白自发组装形成的生物纳米颗粒。现有技术中,有些被成功制备的病毒样颗粒能够忠实模拟天然病毒粒子的结构,诱导B细胞和T细胞反应。此外,VLP不含有病原体的遗传物质,具有更佳的安全性。
相比仅包含单个表位的亚单位疫苗,VLP在其表面展示多种表位并忠实地模拟天然病毒粒子,能够同时诱导T细胞和B细胞反应并增强中和抗体的产生,有利于增强疫苗的免疫效果。对于狂犬病毒而言,狂犬病毒M蛋白在病毒颗粒的包装中扮演核心角色,同时狂犬病毒G蛋白可以促进病毒颗粒的包装。Diego等报道,在HEK293细胞中共表达HIV gag蛋白和狂犬病毒G蛋白可以包装获得重组狂犬病毒样颗粒(D.Fontana,R.Kratje,M.Etcheverrigaray,and C.Prieto,"Rabies virus-like particles expressed inHEK293cells,"Vaccine,vol.32,pp.2799-804,May 19 2014)。Yinglin等利用重组杆状病毒在Sf9细胞中共表达狂犬病毒M蛋白和G蛋白,获得了新的狂犬病毒样颗粒(Y.Qi,H.Kang,X.Zheng,H.Wang,Y.Gao,S.Yang,et al.,"Incorporation of membrane-anchoredflagellin or Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit enhances theimmunogenicity of rabies virus-like particles in mice and dogs,"FrontMicrobiol,vol.6,p.169,2015)。然而这些方法获得的VLP可能污染具有感染性的载体病毒(S.Sakuragi,T.Goto,K.Sano,and Y.Morikawa,"HIV type 1Gag virus-like particlebudding from spheroplasts of Saccharomyces cerevisiae,"Proc Natl Acad Sci U SA,vol.99,pp.7956-61,Jun 11 2002)。
因此,本领域还需要进一步地研究开发具有足够的安全性,且能够适宜于工业化生产的狂犬病毒的病毒样颗粒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酵母细胞表达的狂犬病毒的病毒样颗粒及其制备方法。
在本发明的第一方面,提供一种制备狂犬病毒的病毒样颗粒的方法,所述方法包括:
(1)将狂犬病毒的糖蛋白(G蛋白)表达盒和基质蛋白(M蛋白)表达盒引入到酵母细胞中,培养该重组酵母细胞使之表达糖蛋白和基质蛋白;
(2)去除该重组酵母细胞的细胞壁,获得原生质体;和
(3)培养该原生质体,细胞内表达的糖蛋白和基质蛋白包装成病毒样颗粒。
在一个优选例中,所述的糖蛋白表达盒或基质蛋白表达盒通过酵母表达载体引入到酵母细胞中。所述的酵母表达载体例如pPICZ A。
在另一优选例中,步骤(1)中,培养该重组酵母细胞使之表达糖蛋白和基质蛋白的时间为10~40小时,较佳地15~35小时,更佳地为20~30小时,如22、24、26、28小时,最佳地为24小时,之后进行步骤(2)。
在另一优选例中,所述的糖蛋白表达盒是诱导型表达盒,所述的基质蛋白表达盒是诱导型表达盒;较佳地,所述的诱导型表达盒是以甲醇为诱导表达试剂的表达盒。
在另一优选例中,所述的表达盒中,以甲醇诱导型启动子作为启动子;较佳地为AOX启动子。
在另一优选例中,步骤(1)中,通过诱导,使所述重组酵母细胞表达糖蛋白和基质蛋白;较佳地,所述的诱导是以甲醇诱导。
在另一优选例中,甲醇在培养基中的浓度为按照体积比0.2~2%;较佳地为0.3~1.5%;更佳地为0.4~0.8%。
在另一优选例中,所述的酵母细胞选自:毕赤酵母,酿酒酵母,乳酸克鲁维酵母。
在另一优选例中,步骤(1)中,还包括将酪氨酸酶相关蛋白酶2(TRP2)整合元件引入到酵母细胞中,从而促进糖蛋白表达盒或基质蛋白表达盒整合到酵母基因组中。
在本发明的另一方面,提供一种狂犬病毒的病毒样颗粒,该病毒样颗粒由狂犬病毒的糖蛋白和基质蛋白包装而成,且该病毒样颗粒由前面任一所述的方法制备获得。
在一个优选例中,所述的狂犬病毒的病毒样颗粒的直径为120±20nm。
在本发明的另一方面,提供所述的狂犬病毒的病毒样颗粒的用途,用于制备防治狂犬病毒感染的疫苗。
在本发明的另一方面,提供一种用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的表达载体,所述的表达载体中包括:狂犬病毒的糖蛋白表达盒,狂犬病毒的基质蛋白表达盒。
在另一优选例中,所述的用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的表达载体中,还包括TRP2整合元件。
在本发明的另一方面,提供一种用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的重组酵母细胞,所述重组酵母细胞中包括狂犬病毒的糖蛋白表达盒,狂犬病毒的基质蛋白表达盒。
在另一优选例中,所述的用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的重组酵母细胞中,还包括TRP2整合元件。
在本发明的另一方面,提供一种用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的试剂盒,述的试剂盒中包括:用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的表达载体,所述的表达载体中包括:狂犬病毒的糖蛋白表达盒,狂犬病毒的基质蛋白表达盒,和酵母细胞;或所述的试剂盒中包括:用于制备狂犬病毒的病毒样颗粒的重组酵母细胞,所述重组酵母细胞中包括狂犬病毒的糖蛋白表达盒,狂犬病毒的基质蛋白表达盒;以及制备酵母细胞的原生质体的试剂。
在一个优选例中,所述的制备酵母细胞的原生质体的试剂包括:蜗牛酶,破壁酶;较佳地还包括:Tris,山梨醇,EDTA,DTT。
在本发明的另一方面,提供一种用于防治狂犬病毒感染的疫苗,所述的疫苗包括所述的狂犬病毒的病毒样颗粒,以及药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面,提供一种用于防治狂犬病毒感染的药盒,所述的药盒中包括所述的用于防治狂犬病毒感染的疫苗。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,基于酵母表达系统,通过表达方法的优化,制备得到一种新型的重组狂犬病病毒样颗粒(rabies virus like particles,RV-VLP)。所述的病毒样颗粒具有良好的免疫原性。
如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为狂犬病毒的糖蛋白和基质蛋白)所需的所有必要元件的基因表达系统,通常其包括以下元件:启动子、编码多肽的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用,所述的“可操作性连接”或“操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
本领域目前应用的狂犬病疫苗为传统的灭活疫苗,在免疫原性、安全性、生产效率等方面都存在不足,不能满足现代社会的需求。病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLP)是病毒蛋白自发组装形成的生物纳米颗粒,能够忠实模拟天然病毒粒子的结构,诱导良好的B细胞和T细胞反应。此外,VLP不含有病原体的遗传物质,具有更佳的安全性。因此本发明人致力于开发新型的基于病毒样颗粒的狂犬病毒疫苗。
酵母表达系统,特别是毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,具有低成本、高表达量的优点,且能以接近高等真核细胞的方式进行糖基化修饰,是一种非常适宜于工业化生产的表达系统。然而本发明人在研究初期发现,应用酵母表达系统难以制备狂犬病毒的病毒样颗粒,需要寻找突破手段。
经过深入的研究,本发明人提出了一种基于酵母表达系统制备狂犬病毒的病毒样颗粒的方法,所述方法包括:(1)将狂犬病毒的糖蛋白(G蛋白)表达盒和基质蛋白(M蛋白)表达盒引入到酵母细胞中,培养该重组酵母细胞使之表达糖蛋白和基质蛋白;(2)去除该重组酵母细胞的细胞壁,获得原生质体;和(3)培养该原生质体,细胞内表达的糖蛋白和基质蛋白包装成病毒样颗粒。作为本发明的优选方式,所述方法还包括:(4)分离(纯化)所获得的病毒样颗粒。更佳地,可采用离心的方法来纯化这些病毒样颗粒。
本发明所述的酵母细胞可以包括:毕赤酵母,酿酒酵母,乳酸克鲁维酵母等。较佳地,所述的毕赤酵母可以选自GS115、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168或KM71;所述的酿酒酵母可以选自W303、CEN.PK2、S288c、FY834或S1949;所述的乳酸克鲁维酵母可以选自GG799。最佳的,所述的酵母细胞是毕赤酵母,毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能以接近哺乳动物细胞类型蛋白翻译后修饰的低成本高蛋白表达水平的真核表达系统,具备产量高、成本低、糖基化修饰适度、工艺成熟等特点。该系统是一种出色的蛋白表达平台。
本发明所述的糖蛋白表达盒或基质蛋白表达盒通过酵母表达载体引入到酵母细胞中。所述的酵母表达载体例如,但不限于,pPICZ A。所述的表达盒可藉由同一个表达载体引入到酵母细胞中,或者可藉由不同的表达载体引入到酵母细胞中。
作为本发明的优选方式,步骤(1)中,培养该重组酵母细胞使之表达糖蛋白和基质蛋白的时间为10~40小时,较佳地15~35小时,更佳地为20~30小时,如22、24、26、28小时,最佳地为24小时;之后进行步骤(2)。较佳地,步骤(1)中,还包括将TRP2整合元件引入到酵母细胞中,以促进目的基因的整合。
作为本发明的优选方式,所述的糖蛋白表达盒是诱导型表达盒,所述的基质蛋白表达盒是诱导型表达盒;较佳地,所述的诱导型表达盒是以甲醇为诱导表达试剂的表达盒。更佳地,所述的表达盒中,以甲醇诱导型启动子作为启动子。一种优选的启动子为AOX启动子。甲醇在培养基中的浓度可以为按照体积比0.2~2%;较佳地为0.3~1.5%;更佳地为0.4~0.8%。其中,0.5%甲醇诱导24h是最佳的诱导表达条件。
在本发明的具体实施例中,本发明人通过将目的蛋白诱导表达后,在酵母原生质体中完成病毒样颗粒的包装。之后,以超速离心纯化该病毒样颗粒,并通过透射电镜研究其结构。观察到成功包装获得重组的狂犬病毒的病毒样颗粒,该病毒样颗粒为直径120±20左右的椭圆形颗粒。进一步地,本发明人还尝试不同诱导表达条件,优化病毒样颗粒的表达纯化条件。经免疫小鼠、检测体液免疫反应验证该新型疫苗的免疫原性。结果发现,0.5%甲醇诱导24h是最佳的诱导表达条件,该重组狂犬病病毒颗粒疫苗可诱导良好的特异性免疫应答。
本发明还提供一种具有免疫原性的组合物(预防性或治疗性疫苗),所述的组合物包含:有效量的本发明所述的狂犬病毒的病毒样颗粒,以及药学上可接受的载体。本发明的疫苗具有安全性好、免疫原性高、制备简单、价格便易等优点。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、甘油和山梨醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂,如白蛋白等。
可将所述的组合物(疫苗)制成各种适合于哺乳动物给药的剂型,所述剂型包括但不限于:注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
在使用时,是将安全有效量的本发明所述的狂犬病毒的病毒样颗粒施用于哺乳动物(如人),其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重,较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1、菌株和表达载体
PichiaPinkTM Strain 1(ade2):购自Invitrogen。
pPinkα-HC质粒:购自Invitrogen。
pPICZ A质粒:购自Invitrogen。
2、pPICZ A-TRP2载体构建
使用引物BamH Ⅰ-TRP2-F和TRP2-Bgl Ⅱ-R,从pPinkα-HC载体上扩增出以两端以BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ(NEW ENGLAND BioLabs)酶切位点结尾的TRP2基因,使用这两个酶进行双酶切后回收带有粘性末端的片段。pPICZ A载体使用Bgl Ⅱ酶切、回收。使用T4连接酶(NEWENGLAND BioLabs),将TRP2基因连接在pPICZ A载体上。连接产物转化TOP10感受态菌株(Invitrogen),使用Zeocin抗生素(Invitrogen)LB平板筛选阳性克隆,挑取菌落以引物TRP-F测序选择顺时针朝向插入克隆,获得pPICZ A-TRP2载体。酪氨酸酶相关蛋白酶2(TRP2)可促进糖蛋白表达盒或基质蛋白表达盒整合到酵母基因组中。
BamH Ⅰ-TRP2-F:CGCGGATCCTGGCCAAACGGTTTCTCAATTA(SEQ ID NO:3);
TRP2-Bgl Ⅱ-R:GGAAGATCTATGGCCAAACCATAAATTCCTA(SEQ ID NO:4)。
TRP-F:GCTCTGCTGAAGCCAGTTAC(SEQ ID NO:5)。
3、狂犬病毒G、M蛋白基因共表达质粒构建
按照酵母细胞表达的偏好性结合优化实验比较结果,对狂犬病毒ERA株病毒G、M蛋白基因进行密码子优化,合成该优化后的序列,克隆到pUC57载体质粒上,分别获得pUC57-M质粒和pUC57-G质粒。
经密码子优化的G蛋白的编码序列(SEQ ID NO:1):
AAGTTTCCTATCTATACCATCCCAGACAAGCTGGGCCCCTGGAGCCCTATCGATATTCACCATCTGTCCTGCCCCAACAATCTGGTGGTCGAGGATGAAGGGTGTACCAACCTGAGCGGCTTCTCCTACATGGAGCTGAAAGTGGGATATATCCTGGCTATTAAGATGAACGGGTTCACATGCACTGGCGTGGTCACCGAGGCAGAAACCTACACAAATTTTGTGGGCTATGTCACCACAACTTTCAAGAGGAAACACTTTAGACCAACACCCGACGCCTGTCGCGCCGCTTACAACTGGAAAATGGCTGGCGATCCTCGATATGAGGAAAGCCTGCACAATCCTTACCCAGACTATAGATGGCTGCGGACTGTGAAGACCACAAAAGAGTCCCTGGTCATCATTTCCCCTTCTGTCGCAGACCTGGACCCATACGATCGATCTCTGCACAGTCGGGTGTTTCCATCCGGAAAGTGCTCTGGGGTGGCCGTCAGCTCCACTTACTGTTCTACCAACCATGATTATACAATCTGGATGCCAGAGAATCCCAGGCTGGGGATGAGTTGCGACATTTTCACAAATTCACGCGGCAAGCGAGCCTCAAAAGGAAGCGAGACTTGTGGGTTTGTGGACGAAAGGGGACTGTATAAGAGCCTGAAAGGGGCCTGCAAGCTGAAACTGTGTGGCGTGCTGGGACTGAGACTGATGGATGGCACCTGGGTCGCTATGCAGACATCTAACGAGACTAAGTGGTGCCCTCCCGACCAGCTGGTGAATCTGCACGACTTCAGAAGCGATGAGATCGAACATCTGGTGGTCGAGGAACTGGTGCGAAAAAGGGAGGAATGTCTGGATGCTCTGGAATCAATCATGACTACCAAGAGCGTGAGCTTCAGGAGACTGAGCCACCTGCGGAAGCTGGTCCCTGGGTTCGGCAAAGCATACACCATCTTTAACAAGACACTGATGGAGGCAGACGCCCATTATAAATCTGTGCGCACCTGGAATGAAATTCTGCCTAGTAAGGGATGCCTGCGAGTCGGCGGACGATGTCACCCACATGTGAACGGCGTCTTCTTTAATGGAATCATTCTGGGGCCCGACGGCAACGTGCTGATCCCTGAGATGCAGTCTAGTCTGCTGCAGCAGCACATGGAGCTGCTGGAATCAAGCGTGATTCCTCTGGTCCATCCACTGGCAGATCCCAGCACAGTGTTCAAAGACGGAGATGAGGCCGAAGACTTTGTGGAGGTCCACCTGCCTGATGTGCATAACCAGGTGAGTGGCGTCGACCTGGGACTGCCAAATTGGGGCAAGTACGTGCTGCTGTCCGCTGGAGCACTGACTGCTCTGATGCTGATCATTTTCCTGATGACCTGCTGTCGACGAGTGAACCGATCCGAGCCAACTCAGCACAATCTGCGAGGAACCGGGAGAGAAGTGTCTGTCACACCTCAGAGTGGAAAAATCATTAGCAGTTGGGAGTCACACAAATCTGGCGGCGAAACAAGGCTGTAA
经密码子优化的M蛋白的编码序列(SEQ ID NO:2):
ATGAACTTCCTTAGAAAGATTGTTAAAAATTGTAGAGATGAAGATACTCAAAAGCCTAGTCCTGTTTCCGCACCATTGGATGATGACGACTTGTGGCTTCCACCTCCAGAATACGTTCCTTTGAAAGAGCTTACCTCAAAGAAAAACATGAGAAACTTCTGTATCAGTGGTGGAGTTAAGGTCTGCTCACCAAACGGTTACAGTTTTAGAATTTTGAGACATATCCTTAAGTCTTTCGACGAAATCTACTCCGGTAATCACAGAATGATTGGATTGGTTAAGGTTGTCATCGGTTTGGCACTTTCTGGATCCCCTGTTCCAGAGGGAATGAACTGGGTCTACAAGTTGAGAAGAACTTTTATTTTCCAATGGGCTGATTCAAGAGGTCCTTTGGAAGGAGAAGAGCTTGAATATTCCCAAGAGATCACTTGGGATGACGATACAGAGTTCGTTGGTTTGCAGATTAGAGTCATCGCTAAGCAATGTCATATTCAGGGAAGAATTTGGTGCATCAACATGAATCCAAGAGCCTGTCAGTTGTGGTCTGATATGTCATTGCAGACCCAGAGAAGTGAGGAAGATAAAGATAGTTCATTGTTGTTGGAATAA
将pPICZ A-TRP2载体用EcoRI和KpnI(NEW ENGLAND BioLabs)酶切处理后回收,同时从pUC57-M质粒上用EcoRI和KpnI酶切获得带有粘性末端M基因片段。将M基因片段插入回收得到的pPICZ A-TRP2载体并转化TOP10感受态菌株,使用Zeocin抗生素平板筛选阳性克隆,挑取菌落以5AOX和3AOX为引物进行菌落PCR,抽取阳性菌落质粒DNA,测序确认正确,完成pPICZ A-TRP2-M载体构建。
5AOX:GACTGGTTCCAATTGACAAGC(SEQ ID NO:6);
3AOX:GCAAATGGCATTCTGACATCC(SEQ ID NO:7)。
用G-forward primer和G-reverse primer为引物,以pUC57-G质粒为模板扩增得到首尾带有StuI(NEW ENGLAND BioLabs)和KpnI酶切位点的G基因片段,纯化回收后使用StuI和KpnI酶切获得带有粘性末端的G基因片段。pPink α-HC载体用StuI和KpnI酶切并回收获得带有粘性末端的载体。将有粘性末端的G基因片段插入载体并转化TOP10感受态菌株,使用氨苄抗生素平板筛选阳性克隆,挑取菌落用5AOX和CYC1引物进行菌落PCR,将阳性菌落抽取质粒DNA,测序确认正确,完成pPinkα-HC-G载体构建。
使用BamH Ⅰ将pPICZ A-TRP2-M载体切开,回收载体。通过BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切,切下pPinkα-HC-G载体的G蛋白表达框,电泳后回收G蛋白表达框。用T4连接酶连接回收的载体和片段并转化TOP10感受态菌株,使用Zeocin抗生素LB平板筛选阳性克隆。抽取质粒DNA后通过BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切根据酶切结果判断G蛋白表达框的插入方向,选择和M表达框相同方向的克隆,获得G/M蛋白共表达载体pPICZ A-TRP2-M-G。
G-forward primer:CGTCGAAGGCCTAAGTTTCCTATCTATACCATCC(SEQ ID NO:8);
G-reverse primer:TCAGGTACCTTACAGCCTTGTTTCGCCGC(SEQ ID NO:9);
CYC1:GCGTGAATGTAAGCGTGAC(SEQ ID NO:10)。
4、电击转化方法及菌株筛选方法
将待转化酵母单菌落PichiaPinkTM Strain 1接种到5ml YPD培养基中,过夜(30℃,250rpm)振荡培养。将菌液接种至50ml YPD培养基中使其终OD600为0.2,同样培养条件,使OD600达到1.0。离心(1500g,5min,4℃)收集菌体。10ml Buffer A(18ml YPD中加入2ml2M pH 8.0HEPES和0.5ml 1M DTT,混匀)重悬菌体并在30℃静置15min。之后用冷水补至45ml。离心(1500g,5min,4℃)收集菌体,使用冷的20ml 1M山梨醇重悬。再次离心收集菌体,使用200μl冷的1M山梨醇重悬。100μl菌液与15μg线性化(10μl)的表达质粒混合后装入预冷的0.2cm电转杯(BIO-RAD),冰上孵育10min。
使用BIO-RAD gene pulser进行电击转化。在电转杯中加入2ml冷的1M山梨醇,将菌液转移至15ml离心管,30℃静置培养2h。之后离心(1500g,5min,4℃)收集菌体,涂布在相应的筛选平板培养3-5天。
5、转化用菌株Pichia-HC构建
以Spe Ⅰ酶切线性化后的pPinkα-HC质粒电击转化PichiaPinkTM Strain 1,在PAD平板上筛选,获得用于后续转化的Pichia-HC毕赤酵母菌株。
6、G/M蛋白共表达菌株构建及筛选
以Spe Ⅰ酶切线性化后的pPICZ A-TRP2-M-G质粒电击转化Pichia-HC,在300μg/ml或800μg/ml Zeocin平板上筛选。将筛选获得的单菌落在5ml YPD培养基中过夜(30℃,250rpm)振荡培养。次日至OD600值达到10,离心(1500g,5min,20℃)收集菌体,置换为2mlBMMY诱导培养基(1%酵母提取物,2%蛋白胨,100mM PH6.0的磷酸缓,1.34%YNB,0.0004%生物素,0.5%甲醇),振荡培养24h(30℃,250rpm)。取1ml菌液,离心(1500g,5min,20℃)收集菌体,用200μl Breaking Buffer(50mM磷酸钠,pH 7.4,1mM PMSF,1mM EDTA,5%甘油)重悬,加入100μl酸洗玻璃珠。在组织破碎仪震荡破碎酵母细胞后,离心(12000rpm,1min),上清即为全蛋白提取液。等量细胞全蛋白提取液样品经过10%SDS-PAGE分离蛋白,转膜至PVDF膜上,PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入抗狂犬病毒G蛋白鼠多抗或抗狂犬病毒M蛋白豚鼠多抗4℃孵育过夜,TBST漂洗3次,HRP标记的相应IgG室温孵育1h,漂洗后显色分析。
选择目的蛋白表达量高的菌株,命名为pPICZ A-TRP2-M-G,进行后续的研究。
7、毕赤酵母原生质体制备方法
离心(1500g,5min,20℃)收集菌体,称量菌体湿重。每2.5g菌体用20ml Buffer A(50mM pH 8.0Tris,1M山梨醇,25mM EDTA)重悬后离心收集菌体。每2.5g菌体再次用20mlBuffer A重悬,加入终浓度50mM DTT,30℃处理20min。离心收集菌体,每2.5g菌体用溶解了0.3g蜗牛酶的25ml Buffer B(50mM pH 7.5Tris,1M山梨醇,1mM EDTA)重悬并加入终浓度3mM DTT,30℃处理25min之后离心(1100g,4min,20℃)收集菌体。每2.5g菌体用25ml 1M山梨醇重悬,再次离心(1100g,4min,20℃),收集原生质体。
8、重组的狂犬病毒的病毒样颗粒包装条件
Pichia-MG在200ml BMGY培养基培养至OD为10左右,置换为100ml BMMY含有0.5%(v/v)或1%(v/v)甲醇的诱导培养基,诱导目的蛋白表达24h后制备原生质体。将毕赤酵母原生质体用YPDS培养基(配方:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖,1M山梨醇)重悬后,震荡培养6h(30℃,100rpm)。之后离心(1500g,5min,4℃),收集上清。再将上清离心(8000g,10min,4℃),除去未沉淀的细胞或细胞碎片,上清用于进一步的VLP纯化。
9、重组的狂犬病毒的病毒样颗粒纯化
含有狂犬病毒病毒样颗粒(RV-VLP)的YPDS培养基在5ml 20%蔗糖溶液上离心(25000rpm,2h,4℃,SW28转子)。离心的沉淀在PBS中溶解,用0.45um滤器过滤。使用SephacryTM-S-300HR(GE)柱子,进行分子筛层析。
10、负染色透射电镜制片方法
吸取10μl待观察样品滴在铜网正面,1min后用擦镜纸在铜网边缘吸走样品。再吸取10μl 2%乙酸双氧铀染液滴在铜网正面,染色1min后用擦镜纸在铜网边缘吸走染液。红外灯下烘烤使铜网干燥后用于透射电子显微镜观察。
11、免疫电镜染色
吸取10μl待观察样品滴在铜网正面,1min后用擦镜纸在铜网边缘吸走样品。抗狂犬病毒G蛋白鼠多抗孵育2h,PBS洗涤三次。胶体金标记的抗鼠的二抗,孵育1h。PBS洗三次。10μl 2%乙酸双氧铀染液滴在铜网正面,染色1min后用擦镜纸在铜网边缘吸走染液。红外灯下烘烤使铜网干燥后用于透射电子显微镜观察。
12、重组的狂犬病毒的病毒样颗粒免疫原性测定
狂犬病毒病毒样颗粒(RV-VLP)与铝佐剂等体积混合,以不同剂量肌肉免疫4-6周龄雌性BalB/C小鼠。实验组根据免疫剂量分为高剂量组(免疫20μg)和低剂量组(免疫10μg),以免疫HPV VLP的小鼠为对照组,每组数量5只。免疫10天后采血,测定小鼠免疫应答。
13、ELISA检测针对狂犬病毒的免疫应答
灭活狂犬病毒作为包被抗原,用包被液(25mM磷酸盐缓冲液)稀释抗原至100μg/ml,每孔加入100μl,包被96孔板。4℃过夜后,PBST洗三次,37℃下5%脱脂牛奶封闭1h,PBST洗三次。小鼠血清半比稀释(最低稀释倍数1:20),每孔加入100μl,37℃孵育3h,PBST洗三次。HRP标记的羊抗鼠IgG以1:10000稀释,或HRP标记的羊抗鼠IgG1/IgG2a以1:5000稀释,每孔加入100μl,37℃孵育1h,PBST洗三次,加入TMB显色液每孔50μl,显色10min。加入2M硫酸50μl终止反应,酶标仪测定OD450。
II.实施例
实施例1、重组毕赤酵母菌株Pichia-MG
G/M蛋白毕赤酵母共表达载体pPICZ A-TRP2-M-G构建如前文所述,图1A为载体质粒图谱构建方法示意图,图1B为载体质粒图谱。
Spe Ⅰ酶切线性化后的pPICZ A-TRP2-M-G质粒经电击转化后的酵母涂布在含有300μg/ml和800μg/ml两种浓度的Zeocin抗生素的YPDSZ平板筛选阳性克隆。在30℃培养4天后,挑取阳性菌落,进行诱导表达,通过Western Blot检测蛋白表达水平,如图1C。选择G/M蛋白表达水平最高的菌株,命名为pPICZ A-TRP2-M-G,用于后续的研究。
实施例2、重组毕赤酵母共表达G/M蛋白包装狂犬病毒的病毒样颗粒
在动物细胞中,狂犬病毒M蛋白包裹核糖核蛋白(RNP)并浓缩细胞膜表面的G蛋白以出芽方式包装形成成熟的病毒颗粒。本发明人发现,酵母细胞壁对VLP包装存在阻碍,无法获得狂犬病毒的病毒样颗粒。本发明人经过多种尝试和反复实验论证,发现可通过制备酵母细胞原生质体来消除酵母细胞壁对VLP包装的阻碍。
Pichia-MG经甲醇培养基诱导目的蛋白表达24h后制备原生质体。酵母原生质体在YPDS培养基中培养以完成VLP包装。通过蔗糖垫和分子筛层析,将含VLP的培养基进行纯化,如图2A。
纯化后的VLP负染色电镜样品用于透射电子显微镜观察,如图2B。射电镜结果显示VLP直径120(±20)nm左右的颗粒。
Western Blotting结果证明,颗粒中含有G蛋白和M蛋白,如图2C。
免疫电镜的结果也表明,G蛋白存在于颗粒的表面,如图2D。
以上结果说明,在毕赤酵母中共表达狂犬病毒G蛋白和M蛋白,并以原生质体为基础,可以成功包装出重组的狂犬病毒的病毒样颗粒。
实施例3、重组的狂犬病毒的病毒样颗粒制备条件优化
进一步地,本发明人研究了诱导表达时间以及诱导剂浓度对于VLP产量的影响。
pPICZ A-TRP2-M-G在200ml BMGY培养基培养至OD600为10,置换为100ml BMMY含有0.5%或1%甲醇的诱导培养基,诱导目的蛋白表达24h(Day1)、48h(Day2)、72h(Day3)后制备原生质体。
按照前文中的方法进行RV-VLP纯化并进行Western Blot检测。结果显示,24h是最佳诱导表达时间,0.5%的诱导剂浓度最合适,如图3。
实施例4、重组的狂犬病毒的病毒样颗粒免疫原性研究
本发明人以不同剂量的前述制备的狂犬病毒病毒样颗粒(RV-VLP)肌肉免疫4-6周龄雌性BalB/C小鼠,测定所制备的狂犬病毒病毒样颗粒(RV-VLP)在动物体内的免疫原性。
结果如图4A所示,免疫小鼠10天后,高剂量实验组(免疫20μg)和低剂量实验组(免疫10μg)中均产生了针对狂犬病毒的总IgG,与对照组存在显著差异(T-test,p<0.05),且产生的IgG水平存在剂量效应。
为进一步探索该VLP诱导的免疫类型,本发明人测定了小鼠血清中的分型IgG。结果如图4B和图4C所示,包括IgG1(图4B)和IgG2a(图4C)。
免疫组血清中检测到较高水平的IgG1抗体,表明其主要诱导的免疫反应为Th2免疫应答。
讨论
毕赤酵母拥有低成本、高表达量的优点,且能以接近高等真核细胞的方式进行糖基化修饰,是一种非常适宜于工业化生产的表达系统,然而本发明人在研究初期发现,其难以制备狂犬病毒的病毒样颗粒。
对于非包膜病毒,子代病毒的包装发生在细胞质中,并伴随宿主细胞的裂解而释放。非包膜病毒的重组病毒样颗粒在酵母细胞中的包装与病毒的生活史一致,人们通过破碎酵母细胞来纯化非包膜病毒VLP(P.Valenzuela,A.Medina,and W.J.Rutter,"Synthesisand Assembly of Hepatitis-B Virus Surface-Antigen Particles in Yeast,"Nature,vol.298,pp.347-350,1982)。然而这一方法对于从细胞膜获取包膜的病毒VLP是不适用的,酵母细胞壁可能作为物理屏障或影响细胞膜流动性而阻碍VLP的包装。因此,本发明人基于毕赤酵母表达系统,进行了反复研究和方法改进,最终获得了重组的狂犬病毒的病毒样颗粒。
在本发明中,本发明人在毕赤酵母中共表达狂犬病毒G蛋白和M蛋白。通过培养经过蛋白诱导表达后的酵母原生质体,在培养基中纯化得到RV-VLP。透射电镜观察结果显示,该VLP直径约120nm,为近圆形颗粒。这种与天然病毒的差别是因为G蛋白和M蛋白表达比例的不同所致。此外,本发明人还优化了RV-VLP纯化的条件。免疫原性研究结果显示,该VLP可以诱导较强的体液免疫反应且主要为Th2免疫应答。RV-VLP具有良好的免疫原性,具有进一步开发为新狂犬病疫苗的潜力。本发明人的这一表达系统还可以用于VLP出芽包装所需宿主因子的研究。该系统具有替代现有方法用于生产不受载体病毒污染的含包膜病毒VLP的潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。