CN107760690B - 一种高通量全人源抗体的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程及抗体制备，具体公开了一种高通量全人源单克隆抗体的制备方法及应用。所述制备方法包括分离外周血单核细胞，分选浆细胞或抗原特异性记忆B淋巴细胞的单细胞，利用本发明人所提供的引物对单个B细胞抗体的重链和轻链基因可变区进行扩增，利用含重链片段或轻链片段恒定区的线性表达系统载体构建含抗体重链、轻链基因的表达系统，最终实现全人源单克隆抗体的分离纯化。其中，采用本发明所提供的引物组合扩增抗体重链和轻链可变区基因，可保留轻链、重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效价高、全人源、抗体亲和力好、特异性强、无异种血清反应、没有传播其他传染性疾病的危险等优势。

Description

一种高通量全人源抗体的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程及抗体制备，具体而言，涉及高通量全人源单克隆抗体的制备方法及应用。
背景技术
单克隆抗体(Monoclonal antibodies，MAbs)药物与传统小分子化学药物相比具有更高的靶向性和特异性，是近年来复合增长率最快的一类生物技术药物，已经迅速成为治疗各种传染性疾病，自身免疫病与肿瘤等人类疾病的重要工具。目前生产人源抗体的方法主要有各种抗体噬菌体展示库技术、EBV转化B细胞克隆技术和转基因小鼠技术。抗体噬菌体展示库技术的发展使得体外不经过免疫获得抗体成为可能，但由此所获得的抗体不是原生配对，效率低，未经过人体免疫监视/耐受选择，不是真正意义上的全人源抗体，具有潜在的自身免疫性反应和免疫原性，往往亲和力差；EBV转化B细胞克隆技术生产的全人源抗体，很难产生稳定的细胞系，抗体生产效率低；利用转基因小鼠生产的人源抗体是将人的抗体重链和轻链基因敲人小鼠，通过免疫小鼠后利用传统的小鼠单克隆抗体技术获得克隆抗体。但是，含有将人抗体重链和轻链基因的B细胞/抗体的内产生和成熟的过程是在小鼠体发生的，经过小鼠的免疫监视/耐受选择，因而也不是真正意义上的全人源抗体，具有潜在的自身免疫性反应和免疫原性。
CN102464717A公开了一种人源性抗核抗体的制备方法，其实质为一种噬菌体展示库技术，将所有得到的细胞混合在一起共同分离重链轻链基因，然后随机配对组合，无法确保得到与人体天然抗体完全相同的抗体。
CN101451134A公开了一种从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，其是用磁珠分选的方法获得B细胞，只用了一个细胞标记，没有流式分选仪使用数个细胞标记组合分选得到的细胞精确性好；另外该方法用10个B细胞进行共同基因扩增，将扩增出的几个重链和几个轻链基因随机配对，仍然无法确保得到与人体天然抗体完全相同的抗体。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高通量全人源抗体的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种高通量全人源抗体的制备方法，所述方法包括：
1、分离外周血单核细胞(PBMC)。
传染性疾病自愈患者的血液样本或者经传染性疾病、自身免疫性疾病或者肿瘤患者体内产生的自身抗体的血液样本，分离PBMC。
优选的，选择样本中抗体效价高且浆细胞比例高的时间点采集血液样本。
优选的，利用Ficoll密度梯度离心或HES离心沉淀法或血细胞分离机分离PBMC。
分别针对每种传染性疾病选择市面上已经商品化且已经证明有效的人用疫苗，注射正常人志愿者，并在不同时间点抽血，检测志愿者体内抗体产生情况及浆细胞比例变化情况；另外一种途径也可以与医院进行合作，在与患者签署《知情同意书》的情况下，获取符合条件的正常人或者自身免疫性疾病或肿瘤病人自愈患者或者产生自身抗体患者的全血样本。选择上述样本中抗体效价最高且浆细胞比例最高的时间点，抽取人志愿者血液，利用密度梯度离心的方法分离PBMC。
优选的PBMC分离方法为：新鲜获得的血样，常温2400rpm离心7min，取另一离心管，加入等体积Ficoll备用；离心后，将上层血浆转移至一新的离心管-80℃保存，中层白细胞吸取至另一离心管中，加入等体积含5％FBS的PBS稀释，吹打均匀，小心慢慢加入Ficoll中，保持液面清楚；常温20℃2200rpm离心30min，吸取中间层，即PBMC细胞。
2、分选单细胞
2.1分选含全人源单克隆抗体基因的浆细胞。
鉴于人体在接受免疫接种后抗原特异性浆细胞显著增加，因此，对有明确免疫接种及适当采样时间的样本，将采用流式细胞仪分选单个浆细胞。
优选的，分选含全人源单克隆抗体基因的浆细胞采用的浆细胞荧光标记选自以下三个组合：
组合一：AqVD-Amycan-/CD19-BV605+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PerCP-/IgD-PE-/CD138-FITC-/CD38-AF647+/CD27-BV421+；
组合二：AqVD-Amycan-/CD19-PE+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PerCP-/IgD-BB515-/CD138-PE-CF594-/CD38-AF647+/CD27-BV421+；
组合三：AqVD-Amycan-/CD19-PerCP+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PE-Cy7-/IgD-PE-/CD138-FITC-/CD38-BV605+/CD27-BV421+。
2.2分选含全人源单克隆抗体基因的抗原特异性记忆B淋巴细胞。
由于免疫接种数周后浆细胞将恢复到基础水平，利用浆细胞分离特异性全人源单克隆抗体基因的效率将大大降低。还有一些情况我们无法分析体内浆细胞水平，就利用记忆B淋巴细胞有细胞表面抗体的特点，采用荧光标记的特异性抗原作为探针诱饵，利用流式细胞仪分选抗原特异性单个记忆B淋巴细胞。
优选的，分选含全人源单克隆抗体基因的抗原特异性记忆B淋巴细胞采用的荧光标记选自以下三个组合：
组合一：AqVD-AmCyan-/CD16-PE-Cy7-/CD14-BV570-/CD3-PerCP5.5-/CD20-FITC-/IgD-PE-/CD27+/特异性抗原-AF647+/特异性抗原-BV421+；
组合二：AqVD-AmCyan-/CD3/CD16/CD235a-PE-Cy5-/CD14-FITC-/IgD-PE-/IgM-APC-/CD20-BV605+/CD27-APC-H7+/特异性抗原-PE-Cy7+/特异性抗原-BV421+；
组合三：AqVD-AmCyan-/CD3/CD16/CD235a-PE-Cy5-/CD14-PerCP-/IgD-PE-/IgM-FITC-/CD20-PE-CF594+/CD27-APC-H7+/特异性抗原-AF647+/特异性抗原-BV421+。
3、单个B细胞基因扩增与分析
首先对单个B细胞进行反转录合成cDNA，引物如表1所示；然后扩增抗体重链和轻链基因；并且对分离克隆免疫球蛋白重链和轻链的可变区基因进行分析。
优选的，通过巢式PCR扩增抗体重链和轻链基因，优选第一轮巢式PCR扩增重链、轻链λ、轻链κ全长基因，第二轮巢式PCR分别扩增重链、轻链λ、轻链κ可变区基因。
优选的，重链可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分重链的恒定区序列重合；轻链λ可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合；轻链κ可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分轻链κ的恒定区序列重合。
进一步，与部分Ig引导区序列重合的序列为CTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC。
进一步，与部分重链的恒定区序列重合的序列为GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG。
进一步，与部分轻链λ的恒定区序列重合的序列为AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG。
进一步，与部分轻链κ的恒定区序列重合的序列为CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTG。
第一轮巢式PCR扩增所用引物如表2、3和4所示；第二轮巢式PCR扩增所用引物如表5、6、7所示。
表1RT-PCR引物
Direction PRIMER ID 5’-3’SEQUENCE Tm(℃) GC％
Reverse IgG114RT GCGCCTGAGTTCCACGACACC 67.2 66.7
Reverse IgA99RT TGTCCGCTTTCGCTCCAGGTC 65.2 61.9
Reverse IgE93_RT GGCTCCGGGAAGTAGCCCGTG 69.1 71.4
Reverse IgM93_RT GGCTCCGGGAAGTAGCCCGTG 69.1 71.4
Reverse IgD92_RT ACGGACGTTGGGTGGTACCCAG 67.7 63.6
Reverse KC93RT CTTTGGCCTCTCTGGGATAGAAG 64.6 52.2
Reverse LC92RT ACGGCTCCCGGGTAGAAGTCAC 67.7 63.6
表2第一轮巢式PCR重链PCR引物
表3第一轮巢式PCR轻链κPCR引物
Direction PRIMER ID 5’-3’SEQUENCE Tm(℃) GC％
Forward VK0.1EXT GTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCT 73.6 73.9
Forward VK0.2EXT CAGCTCCTGGGGCTGCTAATGC 67.7 63.6
Forward VK0.3EXT CAGCTTCTCTTCCTCCTGCTAC 64 54.5
Forward VK0.4EXT GTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCT 71.8 69.6
Forward VK0.5EXT ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG 70 65.2
Reverse KC59.EXT CACACAACAGAGGCAGTTCCAG 64 54.5
表4第一轮巢式PCR轻链λPCR引物
Direction PRIMER ID 5’-3’SEQUENCE Tm(℃) GC％
Forward VL1.1EXT TCCTCACCCTCATCACTCACTG 64 54.5
Forward VLL1.2EXT TCCTCACCCTCCTCACTCACTG 65.9 59.1
Forward VLL2.EXT CTCCTCACTCAGGGCACAG 61.6 63.2
Forward VL3.EXT GCCTCCTCACTCTCTGCACAG 65.2 61.9
Forward VL4.1EXT CTGCCCTTCATTTTCTCCACAG 62.1 50
Forward VL4.2EXT CCTCTCCTCCTCCACTGGACAG 67.7 63.6
Forward VL5.EXT TGCTCCTCTCTCACTGCACAG 63.3 57.1
Forward VL6.EXT CCCTCCTCGCTCACTGCACAG 67.2 66.7
Forward VL7.EXT TCCTCCTCACTTGCTGCCCAG 65.2 61.9
Forward VL8.EXT GACTCCTTGCTTATGGATCAG 59.4 47.6
Forward VL9.EXT CCCTCCTCAGTCTCCTCACAG 65.2 61.9
Forward VL10.EXT CCCTCCTCACTCACTCTGCAG 65.2 61.9
Reverse LC70.EXT CTTATGAGACACACCAGTGTGGC 64.6 52.2
表5第二轮巢式PCR重链可变区PCR引物
表6第二轮巢式PCR轻链κ可变区PCR引物
Direction PRIMER ID 5’-3’SEQUENCE Tm(℃) GC％
Forward VK1_int GACATCCAGATGACCCAGTCTCC 66.4 56.5
Forward VK2.1_int GATATTGTGATGACCCAGACTCC 62.9 47.8
Forward VK2.2_int GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC 62.9 47.8
Forward VK3.1_int GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC 62.9 47.8
Forward VK3.2_int GAAATTGTAATGACACAGTCTCC 59.3 39.1
Forward VK4_int GACATCGTGATGACCCAGTCTCC 66.4 56.5
Forward VK5_int GAAACGACACTCACGCAGTCTCC 66.4 56.5
Forward VK6_int GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC 62.9 47.8
Reverse KC30int CTGCTCATCAGATGGCGGGAAG 65.9 59.1
表7第二轮巢式PCR轻链λ可变区PCR引物
需要说明的是，IgL64Ftag将被加在表2～表7所有引物的5’端。
反转录合成cDNA，优选方法：在96-孔PCR板中以20μl反应体系合成cDNA，50ng/μl的Random hexamer Primers，1.5μl的25mMdNTPs，及50U Superscript III反转录酶，65℃在PCR仪上反应1小时；
巢式PCR扩增抗体IgH、Igλ及Igκ可变区基因，优选方法：第一轮PCR：50μl体系中含有5μl的RT反应产物，5个单位的HotStarTaq Plus酶，0.2mM dNTPs，及0.5μM的IgH(VH1-VH6)、Igκ(VK1-VK7)or Igλ(VL1-VL10)可变区引物，IgM、IgG、IgD、IgA1和IgA2，或者Igκ或Igλ抗体恒定区引物。反应条件：预变性95℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃×30sec，55℃(VH与Vκ)或者50℃(Vλ×60sec，72℃×90sec，最后用72℃延伸7min。第二轮PCR：50μl体系中含有3μl的第一轮PCR反应产物作为模版，5个单位的HotStarTaq Plus酶，0.2mM dNTPs，及0.5μM的IgH(VH1-VH6)、Igκ(VK1-VK7)or Igλ(VL1-VL10)可变区引物，IgM、IgG、IgD、IgA1与IgA2，或者Igκ或者Igλ抗体可变区引物，反应条件：预变性95℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃×30sec，58℃(VH)，60℃(Vκ)或者64℃(Vλ)×60sec，72℃×90sec，最后用72℃延伸7min。
4、构建含抗体重链、轻链基因线性表达系统
通过overlapping PCR的方法将分离得到的抗体重链、轻链可变区基因分别连入线性载体表达载体中。
分离得到的抗体重链与轻链可变区基因，构建载体并用于表达抗体时，如采用传统的质粒载体，则耗时长、效率低、不适合高通量的应用。
线性表达系统载体由两部分组成，第一部分由启动子和Ig引导区组成，第二部分由重链片段或轻链片段恒定区和BGH polyA信号肽片段组成。
线性载体优选线性Ig表达载体，由CMV启动子、Ig引导区、重链片段或轻链片段恒定区和BGH poly(A)信号肽片段(B-H，B-K，B-L)组成。
优选的，重链线性表达载体由两部分组成，第一部分由CMV启动子、Ig引导区组成，第二部分由重链恒定区和BGH poly(A)信号肽片段组成。overlapping PCR将分离得到的抗体重链可变区基因连入第一部分和第二部分中间，从而形成CMV启动子、Ig引导区、重链可变区、重链恒定区和BGH poly(A)信号肽片段组成的抗体重链线性表达系统。
优选的，轻链λ线性表达载体由两部分组成，第一部分由CMV启动子、Ig引导区组成，第二部分由轻链λ恒定区和BGH poly(A)信号肽片段组成。overlapping PCR将分离得到的抗体轻链λ可变区基因连入第一部分和第二部分中间，从而形成CMV启动子、Ig引导区、轻链λ可变区、轻链λ恒定区和BGH poly(A)信号肽片段组成的抗体轻链λ线性表达系统。
优选的，轻链κ线性表达载体由两部分组成，第一部分由CMV启动子、Ig引导区组成，第二部分由轻链κ恒定区和BGH poly(A)信号肽片段组成。overlapping PCR将分离得到的抗体轻链κ可变区基因连入第一部分和第二部分中间，从而形成CMV启动子、Ig引导区、轻链κ可变区、轻链κ恒定区和BGH poly(A)信号肽片段组成的抗体轻链κ线性表达系统。
进一步，Ig引导区(Ig L)序列为：
MKVRGIQRNYPQWWIWSMLGLWMLMICNG。
CMV启动子序列如SEQ ID NO.95所示。
本发明利用overlapping PCR的方法将分离得到的抗体重链、轻链可变区基因与线性载体表达系统组合，利用一步PCR的方法形成全长线性抗体基因，表达重组抗体用于抗体的筛选与鉴定。我们针对HCV的几株抗体，对比线性基因和质粒基因的表达量比较图，显示线性表达系统比传统的质粒克隆基因表达重组抗体效率高。
5、抗体生产和纯化
将重组后的表达载体导入宿主细胞进行表达，收集表达的上清，纯化抗体。
将重组后的表达载体可以通过任何已知的方法导入宿主细胞；配对的重链与轻链基因表达载体可在真核细胞或原核细胞中表达；收集表达上清，离心弃去细胞碎片，使用常用的抗体纯化技术纯化抗体。
将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法为本领域所熟知，包括右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染、原生质体融合法、电穿孔法、多核苷酸的脂质体包封、生物枪注射以及把DNA直接显微注射进细胞内。
作为表达的宿主细胞为本领域所熟知的哺乳动物细胞，包括许多可从美国菌种典藏中心(ATCC)获得的永生细胞系。这些细胞系主要包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、A549细胞、3T3细胞、293细胞、以及许多其他细胞系。通过测定哪株细胞系具有高表达水平而选出特别优选的细胞系。其他可用的细胞系包括昆虫细胞系、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞以及真菌细胞。
当把编码重链或其抗原结合部位、轻链和/或其抗原结合部位的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养此宿主细胞持续足以使抗体能够在宿主细胞中表达的一段时间而产生此抗体。优选地，使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。
可根据抗体的特性进行分离纯化，如根据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法将抗体与其他蛋白分开，根据抗体带有电荷的不同，用离子交换，电泳等技术分离。分离纯化方法包括沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。优选的采用蛋白A或蛋白G亲和层析方法纯化抗体。
本发明的目的在于提供上述高通量全人源抗体制备方法在制备抗体中的应用。
优选的，制备的抗体为治疗肿瘤的抗肿瘤抗体或治疗由微生物引起的传染病的抗体。
肿瘤优选自下列的组：包括血液恶性肿瘤如淋巴瘤，白血病，骨髓瘤；癌症如腺癌，其原发部位在食道，肺，乳房，卵巢，肝脏，子宫内膜，子宫颈，结肠，胰腺，前列腺，胃，小肠，直肠，以及子宫；鳞状细胞癌，其原发部位在口腔，舌头，喉咙，食道，肺，皮肤，膀胧，子宫颈，眼睑，眼结膜，阴道等。其它可治疗肿瘤包括:肉细胞瘤，如纤维肉瘤，肌源性肉瘤，神经细胞瘤，黑色素瘤，滋养层细胞瘤，生殖细胞瘤，神经内分泌细胞瘤，神经外胚层细胞瘤。特别地，肿瘤选自下列的组，包括:转移性乳腺癌，非霍奇金淋巴细胞瘤，慢性淋巴细胞白血病，急性骨髓白血病。
微生物优选自下列的组：HIV，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，人嗜T淋巴细胞病毒1和2，细小病毒，人疱疹病毒包括单纯疱疹病毒(HSV)1和2，EBV病毒，)，细胞肥大病毒(CMV)，人乳头瘤病毒(HPV)，带状水痘病毒(VZV)以及人疱疹病毒6(HHV-6)，都可以用本发明提供的方法制备抗体预防、治疗或者缓解。能在细胞内复制的其他病原感染例如致病原生体如锥形体，疟疾，弓形体；细菌如分支杆菌，沙门氏菌，沙眼衣原体，利斯特氏衣原体，真菌如念珠菌，也都可以发展成为慢性疾病，因此，他们也是本发明提供的方法制备抗体预防治疗的理想候选物。
本发明还提供了通过使用上述方法制备的全人源抗体。
本发明还提供了根据本发明的核酸构建体用于产生根据本发明的单价抗体的用途。
本发明还提供了含有根据本发明的核酸的宿主细胞，所述宿主细胞为不具备分化全能性。
本发明还提供了根据本发明的宿主细胞用于产生根据本发明的单价、二价或多价抗体的用途。
本发明还提供了用作药物的根据本发明的单体抗体。
本发明还提供了根据本发明的单价抗体作为药物的用途。
本发明还提供了使用根据本发明的抗体制备用于治疗疾病或病症的药物组合物。
本发明还提供了根据本发明的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途。
本发明还提供了用于治疗疾病或病症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据本发明的单价抗体、包含所述抗体的药物组合物、包含所述抗体的免疫偶联物、或者根据本发明的核酸构建体，借此对疾病或病症进行治疗。
本发明还提供了药物组合物，其包含根据本发明的单价抗体以及一种或多种药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明的目的是提供一套用于全人源抗体单细胞克隆的扩增引物，扩增引物包含重链可变区基因扩增引物组、轻链λ可变区基因扩增引物组、轻链κ可变区基因扩增引物组、重链恒定区基因扩增引物组、轻链λ恒定区基因扩增引物组、轻链κ恒定区基因扩增引物组。
重链可变区基因扩增引物组具体见表5。
轻链κ可变区基因扩增引物组具体见表6。
轻链λ可变区基因扩增引物组具体见表7。
进一步，扩增引物还包含反转录合成cDNA引物组，具体见表1。
优选的，扩增引物还包含重链全长基因扩增引物组、轻链λ全长基因扩增引物组、轻链κ全长基因扩增引物组。
重链全长基因扩增引物组具体见表2。
轻链κ全长基因扩增引物组具体见表3。
轻链λ全长基因扩增引物组具体见表4。
本发明涉及到的部分名词定义：
恒定区(CR)是指抗体的轻链恒定区(LCCR)或重链恒定区(HCCR)。一般CR包括以二硫键稳定的环结构为特征的1至4个免疫球蛋白结构域。优选的CR为免疫球蛋白的CR，优选人免疫球蛋白的CR，其中进一步优选所述免疫球蛋白，优选所述人免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD。特别优选的CR为包括可从公共数据库获得的氨基酸序列或由从公共数据库获得的氨基酸序列组成的人CR。
轻链恒定区(LCCR)具体地κLCCR或λLCCR，一般代表天然抗体的天然κ或λ轻链C-末端半段。LCCR一般包括代表一个免疫球蛋白结构域的约110个氨基酸。
重链恒定区(HCCR)包括抗体重链的约四分之三或更多，并且位于它的C-末端。一般地，HCCR包括三个或四个免疫球蛋白结构域。优选的HCCR选自γHCCR、αHCCR、εHCCR、myHCCR和δHCCR。
可变区(VR)是指抗体的可变区或可变结构域，具体指重链可变区(HCVR)或指轻链可变区(LCVR)。优选地，VR包括单一的免疫球蛋白结构域。优选的VR为免疫球蛋白的VR，优选人免疫球蛋白的VR，其中进一步优选所述免疫球蛋白，优选所述人免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD。
各VR包括决定抗体的结合特征并且嵌入所谓框架的所谓互补决定区(CDR)。优选地，VR包括嵌入框架(FR1-4)的三种CDR，优选CDR1、CDR2和CDR3。因而，在优选的实施方案中，VR包括按以下N-末端至C-末端顺序的下列元件：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。通常VR包括多肽或优选由多肽组成，其中所述多肽是V-基因片段家族成员与另外的基因片段，如诸如D和J基因片段(HCVR)或J基因片段(LCDR)组合的产物。
轻链可变区由重排的核酸分子编码，并且为κLCVR或λLCVR。人源性κLCVR包括多肽，其中所述多肽是人源性κV-基因片段的第1至7个家族成员的产物。人源性λLCVR包括多肽，其中所述多肽是人源性λV-基因片段的地1至11个家族成员的产物。优选的λLCVR为人源性λLCVR，优选由从人B细胞扩增的DNA编码的人源性λLCVR。
重链可变区(HCVR)由重排的核酸分子编码的重链可变区。人源性HCVR包括多肽，其中所述多肽是人源性hV-基因片段第1至7个家族成员的产物。优选的HCVR为人源性HCVR，优选由人B细胞扩增的DNA编码的人源性HCVR。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了基于基因克隆技术提供了从单个B淋巴细胞分离抗体基因的方法，并制备高通量全人源抗体。该方法保留了轻链重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效价高、全人源、抗体亲和力好、特异性强、无异种血清反应、没有传播其他传染性疾病的危险等优势，为研制传染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤的全人源单克隆抗体的预防与治疗性药物提供了一条广阔的途径。
附图说明
图1是本发明特异性浆细胞分选图；
图2是本发明特异性记忆B细胞分选图；
图3是本发明免疫球蛋白重链和轻链的可变区基因片段电泳图；
图4是本发明实施例4中线性Ig表达载体示意图；
图5是本发明线性载体和质粒基因的表达量比较图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1样本采集与PBMC的分离
针对不同的实验目的先通过文献调研，了解引起这些传染性疾病、自身免疫性疾病或者肿瘤的病原体信息、发病机理、疾病的转归过程、机体的免疫反应、主要的抗原结构及中和表位及相应的治疗与疫苗研发的情况。然后抽取中和抗体滴度最高时间点的血液5-10ml进行PBMC分离。
PBMC分离和冻存：新鲜获得的血样，常温2400rpm离心7min，取另一离心管，加入等体积Ficoll(GE)备用；离心后，将上层血浆转移至一新的离心管-80℃保存，中层白细胞吸取至另一离心管中，加入等体积含5％FBS的1640培养基(Gibco)稀释，吹打均匀，小心慢慢加入Ficoll中，保持液面清楚；常温20℃2200rpm离心30min，吸取中间层，即PBMC细胞，加入含5％FBS的1640培养基至50ml，1800rpm离心8min，洗两遍；轻弹试管底部使细胞分布均匀，检测细胞数目和活率；用细胞冻存液(新鲜血清：DMEM＝9:1)悬起细胞，液氮冻存。
实施例2
1、分选浆细胞
鉴于人体在接受免疫接种后抗原特异性浆细胞显著增加，因此，对有明确免疫接种及适当采样时间的样本，将采用流式细胞仪分选单个浆细胞。PBMC染色：按照染色方案标记流式管，设置单染阳性对照、阴性对照和Isotype对照；浆细胞染色方案为：
组合一：AqVD-Amycan-/CD19-BV605+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PerCP-/IgD-PE-/CD138-FITC-/CD38-AF647+/CD27-BV421+；
组合二：AqVD-Amycan-/CD19-PE+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PerCP-/IgD-BB515-/CD138-PE-CF594-/CD38-AF647+/CD27-BV421+；
组合三：AqVD-Amycan-/CD19-PerCP+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PE-Cy7-/IgD-PE-/CD138-FITC-/CD38-BV605+/CD27-BV421+。
浆细胞分选如图1所示。
2、分选记忆B淋巴细胞
由于免疫接种数周后浆细胞将恢复到基础水平，此时利用记忆B淋巴细胞有细胞表面抗体的特点，采用荧光标记的特定抗原作为诱饵，利用流式细胞仪分选含全人源单克隆抗体基因的抗原特异性记忆B淋巴细胞，采用的荧光标记：
组合一：AqVD-AmCyan-/CD16-PE-Cy7-/CD14-BV570-/CD3-PerCP5.5-/CD20-FITC-/IgD-PE-/CD27+/特异性抗原-AF647+/特异性抗原-BV421+；
组合二：AqVD-AmCyan-/CD3/CD16/CD235a-PE-Cy5-/CD14-FITC-/IgD-PE-/IgM-APC-/CD20-BV605+/CD27-APC-H7+/特异性抗原-PE-Cy7+/特异性抗原-BV421+；
组合三：AqVD-AmCyan-/CD3/CD16/CD235a-PE-Cy5-/CD14-PerCP-/IgD-PE-/IgM-FITC-/CD20-PE-CF594+/CD27-APC-H7+/特异性抗原-AF647+/特异性抗原-BV421+。
特异性记忆B细胞分选如图2所示。
实验方法：复苏的细胞，加入2mlPBS/1％BSA，混匀，22℃450g离心5min。弃上清，重复两次，移入流式管中，200μl/管；避光加入相应的抗体(BD，Biolegend)，4℃放置45min；加入2mlPBS/1％BSA，轻混匀，4℃450g离心5min，重复洗3次；用200-1000μlPBS/1％BSA重悬，0.22μm滤膜过滤后上机分选。使单个B细胞分选入96孔板(Eppendorf)。96孔板中含20μl缓冲体系：5μl 5x PCR Buffer，1.25μl DTT，0.5μl RNAase out，13.25μl水(Invitrogen)。一块96孔板分选完成后迅速封膜(Axygen)，放入-80℃冰箱保存。
实施例3单个B淋巴细胞基因扩增
分离得到的单个外周核细胞进行免疫球蛋白重链和轻链的可变区基因克隆。
1、反转录合成cDNA：
在96-孔PCR板中以20μl反应体系合成cDNA，50ng/μl的Random hexamer Primers，1.5μl的25mMdNTPs，及50U Superscript III反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，65℃在PCR仪上反应1小时；
2、巢式PCR扩增抗体可变区基因：
利用本发明所提供的巢式PCR引物进行抗体可变区基因。PCR反应在96孔板中以50μl反应体系分别合成IgH、Igλ及Igκ可变区基因，第一轮PCR：50μl体系中含有5μl的RT反应产物，5个单位的HotStarTaq Plus酶(QIAGEN)，0.2mM dNTPs，及0.5μM的IgH(VH1.1-VH7.1)、Igκ(VK0.1-VK0.5)or Igλ(VL1.1-VL10)可变区引物，IgM、IgG、IgD、IgA1和IgA2，或者Igκ或Igλ抗体恒定区引物，反应条件：预变性95℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃×30sec，55℃(VH与Vκ)或者50℃(Vλ×60sec，72℃×90sec，最后用72℃延伸7min。
第二轮PCR：50μl体系中含有3μl的第一轮PCR反应产物作为模版，5个单位的HotStarTaq Plus酶((QIAGEN))，0.2mM dNTPs，及0.5μM的IgH(VH1-VH7)、Igκ(VK1-VK6)orIgλ(VL1-VL10)可变区引物，IgM、IgG、IgD、IgA1与IgA2，或者Igκ或者Igλ抗体可变区引物，反应条件：预变性95℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃×30sec，58℃(VH)，60℃(Vκ)或者64℃(Vλ)×60sec，72℃×90sec，最后用72℃延伸7min。扩增的VH，Vκ与Vλ的可变区PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。所有的反应用从PBMC中提取的总RNA作为PCR反应质量控制的阳性对照，用不加模版的PCR反应体系做为阴性对照。
分离克隆免疫球蛋白重链和轻链的可变区基因电泳检测，见图3。
3、免疫球蛋白重链和轻链可变区基因序列分析
1)扩增的免疫球蛋白重链和轻链可变区基因产物用Sequcher5.0进行原始测序序列清理，拼接，输出fasta格式保存。用Trime ends自动清理测序质量不好的部分，可以排除多条带双峰序列。多条引物测序结果需要进行拼接后并逐一排除、将读码框正确的序列视为阳性序列，最后以fasta格式文件输出并保存。
2)抗体序列V区基因分析。用IMGT数据库(http://www.imgt.org/)完成。用IMGT/VQUEST下的“Analyse your immunoglobμlin(IG)or antibody nucleotide sequences”功能来完成。可对抗体重链及轻链的V区亚型及identity，CDR1/CDR2/CDR3长度等进行分析，并能确认序列的读码框及序列翻译是否有功能。根据数据库分析的结果，挑取来源于同一cDNA的H/K或H/L的functional(productive)序列，进行组合配对，用于后续overlappingPCR。
作为对比，将本发明所述引物替换为已发表引物(Liao,H.X.,Levesque,M.C.,Nagel,A.,Dixon,A.,Zhang,R.,Walter,E.,Parks,R.,Whitesides,J.,Marshall,D.J.,Hwang,K.K.,et al.(2009).High-throughput isolation of immunoglobulin genesfrom single human B cells and expression as monoclonalantibodies.J.Virol.Methods 158,171–179)，比较扩增差异。
结果如下：
由于重链较长，扩增难度比轻链大，所以一般我们统计重链扩增阳性率。单个B细胞的PCR结果中，I组引物重链的平均阳性率为36，50％，II组引物重链的平均阳性率为53.20％。I组引物配率为34.65％，II组引物配率为52.31％。II组引物比I组引物在重链扩增阳性率和最后重链轻链配对率方面都有显著提高。
I组引物重链的平均阳性率＝(30.47％+32.14％+46.88％)/3＝36.50％；
II组引物重链的平均阳性率＝(54.17％+54.64％+50.78％)/3＝53.20％；
I组引物配率＝(41+48+69)/(128+168+160)＝34.65％；
II组引物配率＝(129+98+67)/(240+194+128)＝52.31％。
由此可见，使用本发明提供的引物组，引物配率具有明显优势，扩增出的重链平均阳性率较现有技术公开的引物组显著提高。
实施例4构建抗体重链、轻链基因线性表达系统
序列分析阳性的可变区基因放到线性表达载体上表达。
一、线性Ig表达载体构成(见图4)：
1、重链线性Ig表达载体构成：CMV启动子，Ig引导区，重链可变区，重链恒定区和BGH poly(A)信号肽片段。
2、轻链kappa(κ)线性Ig表达载体构成：CMV启动子，Ig引导区，轻链κ可变区，轻链κ恒定区和BGH poly(A)信号肽片段。
3、轻链lambda(λ)线性Ig表达载体构成：CMV启动子，Ig引导区，轻链λ可变区，轻链λ恒定区和BGH poly(A)信号肽片段。
4、分别用OverlappingPCR把以上片段组装到一起，Pyrobest DNA聚合酶(Takara)，50μl体系，含PCR产物1μl，正向和反向引物各1μl，C-H重链，C-K轻链kappa，C-L轻链lambda和B-H，B-K，B-L各1μl，10×Buffer 5μl，dNTPs 1μl，其余用ddH2O补足。反应条件：预变性94℃3min，然后进行30个PCR循环，每个循环为：94℃×30sec，63℃(VH)或者55℃(Vκ和Vλ)×30sec，72℃×120sec，最后用72℃延伸10min。然后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后进行转染。
5、将配对的重链与轻链基因表达载体用FuGENE(promega E2692)PolyFect(Qiagen，Valencia，CA)转染试剂共转染人胚胎肾细胞HEK 293i或者293F细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％CO2培养箱中培养72-96小时收集细胞上清。
二、ELISA检测
1、包被：准备ELISA板(costar)，用包被缓冲液稀释抗原，每孔加入100μl抗原稀释液。4℃过夜。
2、封闭：使用洗板机(PBST)洗5次，加入封闭液每孔250μl，37℃孵育1小时。
3、加一抗：使用洗板机(PBST)洗5次，加入细胞培养上清，每孔100μl，37℃孵育1小时。
4、加二抗：使用洗板机(PBST)洗5次，加入二抗(HRP标记的羊抗人IgG)每孔100μl，37℃孵育1小时。
5、显色：使用洗板机(PBST)洗5次，加入显色液(显色液A和显色液B1:1混匀，现用现配)每孔100μl。
6、终止：室温放置5分钟，加入终止液，每孔50μl。
7、酶标仪读数，双波长450-630nm。
ELISA检测阳性的Overlapping PCR产物酶切，连接到抗体专用表达载体pcDNATM3.3-TAKit(InvitrogenTM货号：K830001)。
实施例5抗体生产和纯化
转染将配对的重链与轻链基因表达载体用磷酸钙沉淀法或者PolyFect(Qiagen，Valencia，CA)转染试剂共转染HEK 293或者293T细胞，转染后8-12小时更换新鲜培养基，培养基DMEM(Gibco)加入热灭活10％胎牛血清(Gibco)和青霉素100U/ml，并在37℃5％CO2培养箱中培养48-72小时。
纯化收集表达上清，离心弃去细胞碎片，加入1mL pH 8.0，0.1moL/L磷酸缓冲液并用pH 9.0，1moL/L TRIS-HCL调整pH至9.0。把细胞上清加入已经用0.1moL/L磷酸缓冲液pH8.0平衡好的Protein G或者Protein A Sepharose CL 4B蛋白柱中(GE Healthcare)，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用pH 3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1moL/L pH 8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH 7.2，0.01M PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280，计算蛋白质含量，然后置于4℃保存，
抗体表达检测：
1、样品准备：取20μl抗体溶液，加入5×样品缓冲液5μl，沸水浴中煮5min以使蛋白变性。
2、在电泳槽中加入TGS缓冲液，将制好的蛋白胶(4％-15％)安装在架子上放好到电泳槽中，在内槽中加入新鲜的TGS至淹没加样孔位置，拔掉梳子。
3、按照顺序依次点样，MARKER要用预染蛋白MARKER(BIO-RAD)。然后在200V跑30min以使蛋白条带充分分开。
4、跑胶结束后，做SDS的胶切掉右上角放到染色液中，摇床上室温染色2h，然后脱色液中过夜或直至胶底色脱至能够看清楚条带，拍照。
5、做Western的胶切掉右上角，依次把的NC膜，胶，导电片，滤纸放到转膜仪上，注意把胶右上角对应的膜角剪掉，使三明治层间无气泡。转膜30min。然后取下膜放到封闭液中置于摇床上室温封闭2h或4℃过夜。封闭结束用PBST冲洗两次，每次5分钟。加一抗(AP标记的羊抗人IgG H+K)置于摇床上室温孵育2h。用PBST冲洗两次，每次5分钟。加显色底物，置于黑暗处显色20分钟，拍照。
通过excel标准曲线法计算线性表达载体和质粒基因的载体抗体表达量比较图(见图5)。
实施例6全人源抗丙型肝炎病毒中和抗体的制备
丙型肝炎病毒(HCV)是已知除逆转录病毒外惟一能造成慢性感染的RNA病毒。控制HCV复制和免疫清除的关键因素是产生广谱中和抗体，利用本发明提供的上述方法，制备了一种结合HCV表面包膜蛋白E2的全人源抗HCV的单克隆中和抗体，该抗体可以用于防治丙肝、并且还可以用于鉴定HCV。
制备方法：
(1)检测发现HCV感染患者；
(2)分离HCV感染患者静脉血中的单核细胞，之后利用流式细胞术进行记忆B细胞分选，使用荧光标记组合一分选出含有E2抗体的记忆B细胞进入96孔PCR板中，使每孔含一个B细胞；
(3)利用单细胞RT-PCR扩增步骤(2)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；
(4)将步骤(3)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；
(5)抗体筛选平台筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的全人源抗HCV的单克隆中和抗体。
制备的抗体结合活性检测实验结果显示，把表达纯化的抗体进行大于2000倍稀释后抗体依然可以与抗原结合，具有极强的结合活性。亲和活性检测结果显示，抗体的亲和力达2.03*10-8mol。抗体与不同的HCV病毒株的中和活性检测结果显示，与H77、JFH1、S52、ED43、SA13病毒株的中和效率分别是0.5117μg/mL、0.01038μg/mL、0.002745μg/mL、0.08102μg/mL和0.8507μg/mL。
实施例7全人源抗狂犬病毒中和抗体的制备
制备方法：
(1)分离注射了狂犬疫苗的志愿者静脉血中的单核细胞，之后利用流式细胞术进行单个浆细胞分选，使用浆细胞荧光标记组合一，PBMC分选获得单个浆细胞进入96孔PCR板中；
(2)利用单细胞RT－PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；
(3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；
(4)抗体筛选平台筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体。
制备的抗体结合活性检测实验结果显示，把表达纯化的抗体进行大于50000倍稀释后抗体依然可以与抗原结合，具有极强的结合活性。抗体与中和活性检测结果显示，抗体保护效价约为1700IU/ml，说明表达的重组抗体是高纯度的具有狂犬病毒中和活性的全人源单克隆抗体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种高通量全人源抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分离外周血单个核细胞：传染性疾病自愈患者的血液样本或者自身免疫性疾病或者肿瘤患者产生自身抗体的血液样本，分离PBMC；
(2)分选单个B细胞：所述单个B细胞为抗原特异性浆细胞和/或抗原特异性记忆B淋巴细胞；
分选抗原特异性浆细胞采用的荧光标记选自以下三个组合中的一种：
组合一：AqVD-Amycan-/CD19-BV605+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PerCP-/IgD-PE-/CD138-FITC-/CD38-AF647+/CD27-BV421+；
组合二：AqVD-Amycan-/CD19-PE+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PerCP-/IgD-BB515-/CD138-PE-CF594-/CD38-AF647+/CD27-BV421+；
组合三：AqVD-Amycan-/CD19-PerCP+/CD3/14/16/235a-PE-Cy5-/CD20-PE-Cy7-/IgD-PE-/CD138-FITC-/CD38-BV605+/CD27-BV421+；
分选抗原特异性记忆B淋巴细胞采用的荧光标记选自以下三个组合中的一种：
组合一：AqVD-AmCyan-/CD16-PE-Cy7-/CD14-BV570-/CD3-PerCP5.5-/CD20-FITC-/IgD-PE-/CD27+/特异性抗原-AF647+/特异性抗原-BV421+；
组合二：AqVD-AmCyan-/CD3/CD16/CD235a-PE-Cy5-/CD14-FITC-/IgD-PE-/IgM-APC-/CD20-BV605+/CD27-APC-H7+/特异性抗原-PE-Cy7+/特异性抗原-BV421+；
组合三：AqVD-AmCyan-/CD3/CD16/CD235a-PE-Cy5-/CD14-PerCP-/IgD-PE-/IgM-FITC-/CD20-PE-CF594+/CD27-APC-H7+/特异性抗原-AF647+/特异性抗原-BV421+；
(3)单个B细胞基因扩增与分析：对单个B细胞进行反转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链可变区基因；
(4)构建含抗体重链、轻链基因的线性表达系统：通过overlapping PCR的方法将步骤(3)分离得到的抗体重链、轻链可变区基因分别连入线性载体表达系统中；
(5)抗体的分离纯化：将步骤(4)得到的线性载体表达系统导入宿主细胞进行表达，收集表达的上清，纯化抗体；
其中，步骤(3)通过巢式PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因：第一轮巢式PCR扩增重链、轻链λ和轻链κ全长基因，所用引物如表2、表3、表4所示；第二轮巢式PCR分别扩增重链、轻链λ和轻链κ可变区基因，所用引物表5、表6、表7所示；重链可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分重链的恒定区序列重合；轻链λ可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合；轻链κ可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分轻链κ的恒定区序列重合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，与部分Ig引导区序列重合的序列为CTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC；
与部分重链的恒定区序列重合的序列为GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG；
与部分轻链λ的恒定区序列重合的序列为AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG；
与部分轻链κ的恒定区序列重合的序列为CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTG。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述线性表达系统载体由两部分组成，第一部分由启动子和Ig引导区组成，第二部分由重链片段或轻链片段恒定区和BGHpolyA信号肽片段组成。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述启动子为CMV启动子，所述Ig引导区序列为序列为：MKVRGIQRNYPQWWIWSMLGLWMLMICNG。
5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法制备的高通量全人源抗体为抗病毒抗体或免疫治疗抗体。
6.巢式PCR扩增抗体重链和轻链基因的引物组合，其特征在于，包括第一轮巢式PCR引物，如表2、表3、表4所示，和第二轮巢式PCR引物，如表5、表6、表7所示，分别扩增重链、轻链λ和轻链κ可变区基因。
7.含有权利要求6所述引物组合的试剂或试剂盒。
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