CN107753470B - 一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用 - Google Patents

一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用。本发明首次发现了乙醇胺作为一种小分子抑制剂可以抑制多粘菌素的耐药性、抑制MCR‑1蛋白活性、抑制与MCR‑1结构类似的磷酸转移酶活性，将乙醇胺作为小分子抑制剂与多粘菌素联合用药，可以使得多粘菌素能够更好地发挥作用，为多粘菌素的应用提供了更为有效的应用空间，在制药领域和动物养殖领域具有十分重要的应用价值，对于耐药性广泛存在的今天具有重大意义。

Description

一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用。
背景技术
多粘菌素发现于上世纪60年代，是一种抗革兰氏阴性菌的多肽类抗生素，最早发现于多黏类芽孢杆菌培养液中。多粘菌素在结构上主要由一个阳离子多肽环和一条亲脂的脂肪酸侧链组成，有A、B、C、D、E五种，A、C和D三种毒性较大，B和E毒性较小，故临床上用的是B和E两种，其中B和E仅有一个氨基酸的区别，但具有基本相同的生物活性与功能。临床上多粘菌素的使用不多，也正因此，细菌对它才没有产生足够的耐药性，在碳青霉烯类抗生素耐药性越来越强的今天，多粘菌素被认为是抵抗病原菌的最后一道防线。
目前，已经有几例针对多粘菌素耐药机制的报道，深入到结构水平研究的有脑膜炎奈氏球菌的LptA蛋白和空肠弯曲杆菌中的EptC蛋白。但这两者属于在进化机制上都属于细菌产生的随机突变，该机制不会进行转移，故危害性相对较小。2015年，《LancetInfectious Diseases》在中国首次发现和报道了能通过质粒介导的多粘菌素抗性转移机制即mobilized colistin resistance(MCR-1)，引起广泛关注。
该研究组从野生动物、食用猪肉，包括住院病人中分离到的肠杆菌中，均能检测到MCR-1基因mcr-1的存在，表明MCR-1的广泛分布。该基因通过接合的方式能在不同的菌属中转移，如报道的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌。随后，科学家们在丹麦、越南和德国均鉴定出mcr-1基因的存在，表明MCR-1的出现已成为世界性的现象。
由于多粘菌素以前广泛使用在畜牧业和农业上，临床上出现对多粘菌素的耐药性的报道并不多，使得多粘菌素被认为是对抗这些“超级细菌”的最后一道防线，然而MCR-1的出现，特别是其细菌间高效的转移率，大大降低了多粘菌素的效力。在专一性抑制剂和有效的替代药物出现之前，我们不得不重新审视和规划多粘菌素药物的使用，并且尽量控制MCR-1的扩散。
综上所述，设计并合成有效的MCR-1抑制剂，将其运用于对抗多粘菌素耐药性，这对多粘菌素的推广使用有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供乙醇胺作为小分子抑制剂在抑制多粘菌素耐药性上的应用。
本发明的另一目的在于提供乙醇胺作为小分子抑制剂在抑制MCR-1蛋白活性上的应用、以及乙醇胺作为小分子抑制剂在抑制与MCR-1结构类似的磷酸转移酶活性上的应用。
本发明的第三个目的在于提供乙醇胺作为小分子抑制剂与多粘菌素联合用药在制备治疗由多粘菌素敏感菌或耐药菌感染所致疾病的药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供乙醇胺作为小分子抑制剂在制备动物用饲料添加剂中的应用。
本发明中涉及的小分子抑制剂乙醇胺的结构式如下：
Figure BDA0001428834220000021
本发明提供药物组合物，包含小分子抑制剂乙醇胺和多粘菌素。
本发明中所述多粘菌素选自aladdin公司Polymyxin B sulfate。
本发明的有益效果如下：本发明首次发现了乙醇胺作为一种小分子抑制剂可以抑制多粘菌素的耐药性、抑制MCR-1蛋白活性、抑制与MCR-1结构类似的磷酸转移酶活性，将乙醇胺作为小分子抑制剂与多粘菌素联合用药，可以使得多粘菌素能够更好地发挥作用，为多粘菌素的应用提供了更为有效的应用空间，在制药领域和动物养殖领域具有十分重要的应用价值，对于耐药性广泛存在的今天具有重大意义。
附图说明
图1为实施例1中小分子抑制剂对MCR-1阳性菌的抑制效果。
图2为实施例2中小分子抑制剂对MCR-1蛋白活性的抑制效果，其中反应的底物被标记为Acyl 12:0NBD-glycerol-3-PEA，产物被标记为Acyl 12:0NBD-glycerol。
图3为实施例2中小分子抑制剂与MCR-1蛋白结合的结构模型图，其中H395是MCR-1蛋白的第395号组氨酸，Wat1-8是水分子，ETA是小分子抑制剂。
图4为实施例3中阳性阴性对照及各突变的多粘菌素最低抑菌浓度测定结果。
图5为实施例3中8个MCR-1蛋白抑制位点与小分子抑制剂结合的结构模型图。(TPO285表示磷酸化的第285位苏氨酸)
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
检测乙醇胺小分子抑制剂对MCR-1阳性菌的抑制作用，包括如下步骤：
1)根据实验设计，先将不同浓度的多粘菌素B(polymyxin B)加入已加热溶解，并在45～50℃水浴中平衡的MH(Muller Hinton)琼脂中，再将已倍比稀释的不同浓度的小分子抑制剂乙醇胺(ETA)溶液分别加入上述琼脂中，混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3～4mm；
2)制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的MCR-1阳性菌(wide type，WT)和MCR-1阴性菌(nagtive cotrol，NC)菌悬液，并梯度稀释为母液的10-2，10-3……10-7浓度；
3)将稀释后的菌液依次接种到步骤1)中的MH琼脂平板上，37℃培养12小时；观察结果。
按照上述方法得到的乙醇胺小分子抑制剂的抑制效果如图1所示，在乙醇胺的浓度大于100μmol时，乙醇胺小分子抑制剂均能表现出一定的抑制能力，而浓度为10mM的乙醇胺小分子抑制剂起到了非常明显的抑制作用，使得MCR-1阳性菌的多粘菌素耐药性完全丧失。
实施例2
检测小分子抑制剂对MCR-1蛋白活性的抑制作用，包括如下步骤：
1)MCR-1蛋白原核表达质粒的构建：将MCR-1的基因序列，通过NcoI和XhoI酶切位点，插入到pET28a质粒中，构建出pET28a-MCR质粒，经DNA测序验证；MCR-1的基因序列如SEQID NO.1所示；
2)MCR-1蛋白的表达：将上述pET28a-MCR质粒通过CaCl2法，转化到大肠杆菌Roseta菌株中，通过卡那霉素和氯霉素进行筛选，将在含有卡那霉素和氯霉素的LB(Luria-Bertani)培养平板上生长的菌株，接种至含有卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至对数生长期，然后添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至0.5mM，在20℃诱导20小时。最后离心收集细菌；
3)MCR-1蛋白的纯化：将上述收集的细菌用PBS(磷酸盐缓冲液，pH≈7.4)溶液重悬混匀后使用超高压均质机进行破碎，由于MCR-1为膜蛋白，所以将裂解液经6000g离心后取上清，然后使用超高速离心机80000g离心，收集沉淀；将沉淀用含20mM DDM(十二烷基-β-D-麦芽糖苷)的PBS溶液重悬，过夜溶解细胞膜；然后再次使用超高速离心机80000g离心，取上清；将上清利用Ni-NTA His标签蛋白结合填料进行结合和纯化，MCR-1蛋白的洗脱缓冲液为PBS中添加200mM imidazole(咪唑)及20mM DDM；最后将MCR-1蛋白使用截留量100kd的浓缩管换液至PBS-20mM DDM中；
4)MCR-1的酶活检测：在三个1.5mL的EP管中，加入0.5μL的带有荧光基团NBD的底物类似物
1-acyl-2-{12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoyl}-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，简称NBD-PEA，在1号管加入2mg/mL的步骤3)中的MCR-1蛋白25μL，2号管加入25μL PBS-20mM DDM，3号管加入2mg/mL的步骤3)中的MCR-1蛋白25μL和0.5μL 500mM ETA溶液(终浓度10mM)，室温上下颠倒混匀反应24小时，将反应产物分别取0.5μL并排点在硅胶板上，在乙酸乙酯：甲醇：纯水＝7:2:1的层析液中进行薄层层析；约5分钟后使用蓝光观测底物上所带荧光情况。
按照上述方法的得到的乙醇胺小分子抑制剂抑制效果如图2所示，可以看到MCR-1蛋白对底物的切割作用能被10mM的ETA溶液完全抑制。
上述乙醇胺小分子抑制剂与MCR-1蛋白结合的模型图见图3，从图中可以看出，小分子药物嵌合在MCR-1在第395位组氨酸附近的催化口袋中，可以和蛋白质与水形成较为稳定的复合物，阻挡了MCR-1与其行使正常功能的底物的结合，从而抑制MCR-1蛋白的活性。
实施例3
以测定突变菌株的多粘菌素最低抑菌浓度的方法检测MCR-1抑制位点的抑制效果，包括如下步骤：
1)利用实施例2中得到的pET28a-MCR质粒，将8个可能的MCR-1抑制位点：第246位谷氨酸(E246)，第285位苏氨酸(T285)，第329位天冬酰胺(N329)，第333位赖氨酸(K333)，第395位组氨酸(H395)，第465位天冬氨酸(D465)，第466位组氨酸(H466)和第478位组氨酸(H478)分别进行定点突变，突变为丙氨酸。
2)将上述8种突变后的pET28a-MCR质粒通过CaCl2法，转化到大肠杆菌Roseta菌株中，通过卡那霉素和氯霉素进行筛选，并对筛选出的菌种进行DNA测序验证。
3)将不同浓度的多粘菌素B(polymyxin B)加入已加热溶解，并在45～50℃水浴中平衡的MH(Muller Hinton)琼脂中，混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3～4mm；
4)制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的MCR-1阳性菌(wide type，WT)、MCR-1阴性菌(nagtive cotrol，NC)和8种突变E246，T285，N329，K333，H395，D465，H466，H478的菌悬液，并梯度稀释为母液的10-2，10-3……10-7浓度；
5)将稀释后的菌液依次接种到步骤1)中的MH琼脂平板上，37℃培养12小时；观察结果。
按照上述方法得到的实验结果如图4所示，突变过的菌株的最低抑菌浓度均在8mg左右低于阳性对照的16mg，说明氨基酸位点E246，T285，N329，K333，H395，D465，H466，H478均是蛋白行使正常功能的重要位点。结合图5的结构模型，乙醇胺与MCR-1蛋白结合后，这些位点均被不同程度地阻挡，从而使MCR-1蛋白丧失了活性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110>武汉大学
<120>一种多粘菌素耐药蛋白的小分子抑制剂及其应用
<160> 1
<210> 1
<211>1626 bp
<212> DNA
<213> MCR-1的基因序列
<400> 1
atgatgcagc atacttctgt gtggtaccga cgctcggtca gtccgtttgt tcttgtggcg 60
agtgttgccg ttttcttgac cgcgaccgcc aatcttacct tttttgataa aatcagccaa 120
acctatccca tcgcggacaa tctcggcttt gtgctgacga tcgctgtcgt gctctttggc 180
gcgatgctac tgatcaccac gctgttatca tcgtatcgct atgtgctaaa gcctgtgttg 240
attttgctat taatcatggg cgcggtgacc agttatttta ctgacactta tggcacggtc 300
tatgatacga ccatgctcca aaatgcccta cagaccgacc aagccgagac caaggatcta 360
ttaaacgcag cgtttatcat gcgtatcatt ggtttgggtg tgctaccaag tttgcttgtg 420
gcttttgtta aggtggatta tccgacttgg ggcaagggtt tgatgcgccg attgggcttg 480
atcgtggcaa gtcttgcgct gattttactg cctgtggtgg cgttcagcag tcattatgcc 540
agtttctttc gcgtgcataa gccgctgcgt agctatgtca atccgatcat gccaatctac 600
tcggtgggta agcttgccag tattgagtat aaaaaagcca gtgcgccaaa agataccatt 660
tatcacgcca aagacgcggt acaagcaacc aagcctgata tgcgtaagcc acgcctagtg 720
gtgttcgtcg tcggtgagac ggcacgcgcc gatcatgtca gcttcaatgg ctatgagcgc 780
gatactttcc cacagcttgc caagatcgat ggcgtgacca attttagcaa tgtcacatcg 840
tgcggcacat cgacggcgta ttctgtgccg tgtatgttca gctatctggg cgcggatgag 900
tatgatgtcg ataccgccaa ataccaagaa aatgtgctgg atacgctgga tcgcttgggc 960
gtaagtatct tgtggcgtga taataattcg gactcaaaag gcgtgatgga taagctgcca 1020
aaagcgcaat ttgccgatta taaatccgcg accaacaacg ccatctgcaa caccaatcct 1080
tataacgaat gccgcgatgt cggtatgctc gttggcttag atgactttgt cgctgccaat 1140
aacggcaaag atatgctgat catgctgcac caaatgggca atcacgggcc tgcgtatttt 1200
aagcgatatg atgaaaagtt tgccaaattc acgccagtgt gtgaaggtaa tgagcttgcc 1260
aagtgcgaac atcagtcctt gatcaatgct tatgacaatg ccttgcttgc caccgatgat 1320
ttcatcgctc aaagtatcca gtggctgcag acgcacagca atgcctatga tgtctcaatg 1380
ctgtatgtca gcgatcatgg cgaaagtctg ggtgagaacg gtgtctatct acatggtatg 1440
ccaaatgcct ttgcaccaaa agaacagcgc agtgtgcctg catttttctg gacggataag 1500
caaactggca tcacgccaat ggcaaccgat accgtcctga cccatgacgc gatcacgccg 1560
acattattaa agctgtttga tgtcaccgcg gacaaagtca aagaccgcac cgcattcatc 1620
cgctga 1626

Claims (1)

1.乙醇胺作为小分子抑制剂在制备用于抑制由MCR-1导致的多粘菌素耐药性的药物中的应用。
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