CN107748143A - 一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,属于环境和生物分析技术领域。是将浓硫酸滴加到的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止20分钟~40分钟,得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;再将模拟酶分散液加入到NaAc‑HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入3,3',5,5'‑四甲基联苯胺乙醇溶液作为比色反应底物;再加入过氧化氢水溶液,得到过氧化氢终浓度为50μM~500μM的过氧化氢溶液,测定该溶液在紫外‑可见光区域的吸光光度值;然后建立浓度‑吸光光度值的标准曲线;最后配制未知过氧化氢浓度的溶液,测定该溶液的吸光光度值;通过上述标准曲线计算得到溶液中过氧化氢的浓度,从而实现基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感。
Description
技术领域
本发明属于环境和生物分析技术领域,具体涉及一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,该模拟酶对过氧化氢具有良好响应特性。
背景技术
随着工农业生产的发展和城市生活水平的提高,环境污染问题和人类身体健康问题越来越突出。过氧化氢作为一种典型的氧化剂,不仅在工农业生产过程中大量使用,还是有机合成、化工生产等工业过程中常用的氧化剂。尤其是过氧化氢具有强的氧化性,大规模的使用过氧化氢对人类的身体健康和生产生活环境带来了严重的危害。因此,对环境中的过氧化氢进行准确、连续地检测成为亟待解决的问题,这就为过氧化氢传感器的应用提供了广阔的空间。同时,过氧化氢又是生物体中许多蛋白酶反应的中间产物,对生物体内过氧化氢浓度的准确检测,可以实现对生物体内相关生理过程的监测,在生物医学领域具有重要的研究意义。过氧化氢传感器是生物/化学传感器中比较重要的一类传感器,在工农业生产、过程控制、环境监测与生物医学等领域有着广泛的应用。研制具有高灵敏度、低成本、小型化等优点的高性能过氧化氢传感器成为科研领域和产业界的研究热点。其中,基于蛋白酶特异性反应的比色检测方法具有制作简单、成本低廉、使用方便的优点,在过氧化氢检测方面具有巨大的应用前景。尽管基于蛋白酶的过氧化氢比色传感器展示出检测限低、响应快、选择性好等优点,但同时也存在一些不足,例如,受环境影响较大,稳定性较差,成本较高等。近年来,基于贵金属纳米粒子、碳纳米材料、无机多孔材料的新型模拟酶材料发展迅速,成为材料界研究的热点。但是,这些模拟酶材料制备过程复杂、成本较高、合成条件不易控制,限制其进一步广泛应用与推广。与无机纳米材料相比,有机聚合物材料具有合成简单、成本低、分散性好、结构易于调控等优点,这都为高性能过氧化氢传感器的设计与开发提供了有利的条件。因此,开发基于有机聚合物模拟酶的过氧化氢传感器成为环境和生物分析技术领域研究的重要方向之一,在工业过程、环境保护和生物医学监测等领域有着重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测技术的不足,提供一种快速、准确、低成本的一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法。
本发明所述的一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,其步骤如下:
(1)将0.1mL~2mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到0.1mL~5mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止20分钟~40分钟,得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为1mg/mL~10mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将10μL~100μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到500μL~900μL、pH=3.5~4.5的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入100μL~300μL、浓度为1mM~5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入3.25μL~65μL浓度为0.01M的过氧化氢水溶液,在35℃~45℃培养15分钟~60分钟,得到过氧化氢终浓度为50μM~500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度的溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,计算得到溶液中过氧化氢的浓度,从而实现基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感。
本发明的优点是:
1)本发明所制备的荧光聚合物模拟酶表面含有大量的亲水基团,在水溶液中具有良好的分散性,使得比色反应底物TMB和过氧化氢分子能够充分与荧光聚合物模拟酶接触,提高了模拟酶催化活性中心的利用效率,进一步提升传感性能。
2)荧光聚合物模拟酶具有有机骨架结构,在水溶液中具有良好的稳定性和抗氧化性强,使得模拟酶的使用寿命较长。
3)荧光聚合物模拟酶具有光学特性,对紫外光具有良好的吸收,同时具有荧光特性。可以通过调控外界入射光的波长和强度,优化模拟酶的催化活性。
4)采用湿化学法制备荧光聚合物模拟酶,方法简单,易于操作,成本低廉。而且可以通过控制反应时间以及反应前驱物的比例等实验参数,实现荧光聚合物模拟酶的组成、结构等性能的调控。
附图说明
图1是制备的荧光聚合物模拟酶的扫描电镜照片(a图和b图为材料在900倍和12000倍放大倍数下的扫描电镜照片)。
图2是制备的荧光聚合物模拟酶的X射线光电子能谱。
图3是荧光聚合物模拟酶分散液的紫外-可见吸收光谱(曲线1)和365nm激发波长下的荧光发射光谱(曲线2)。
图4是不同溶液的紫外-可见吸收光谱(曲线1:TMB+H2O2;曲线2:TMB+OSs;曲线3:OSs+H2O2;曲线4:TMB+H2O2+OSs,其中OSs为荧光聚合物模拟酶的缩写)。
图5是荧光聚合物模拟酶对过氧化氢的紫外-可见吸收吸光度值与过氧化氢浓度的标准曲线。
实施例1制备的荧光聚合物模拟酶的扫描电镜照片如图1所示,a图和b图为材料在900倍和12000倍放大倍数下的扫描电镜照片。可以看出,荧光聚合物模拟酶由尺寸较小的纳米粒子构成,粒子间存在着空隙,有利于比色反应底物TMB和过氧化氢分子与模拟酶材料充分接触。
实施例1制备的荧光聚合物模拟酶的X射线光电子能谱见图2。可以看出,荧光聚合物模拟酶是由碳、氮、硫和氧四种元素构成,与制备荧光聚合物模拟酶用的前驱物二乙烯三胺和浓硫酸的元素组成相同。
实施例1制备的荧光聚合物模拟酶分散液的紫外-可见吸收光谱(曲线1)和荧光发射光谱(曲线2)见图3。可以看出,荧光聚合物模拟酶分散液在340nm处有一个强的紫外吸收峰。在365nm紫外光的激发下,荧光聚合物模拟酶分散液在454nm处给出强的荧光发射光谱。同时,荧光聚合物模拟酶分散液在365nm紫外光的激发下表现出明显的蓝色荧光。
实施例1制备的荧光聚合物模拟酶分散液在不同溶液中紫外-可见吸收光谱见图4。可以看出,荧光聚合物模拟酶在比色反应底物TMB和过氧化氢同时存在条件下,溶液给出几个归属于反应底物氧化产物的吸收峰(曲线4);而当三种物质不同时存在时,其他溶液均没有明显的吸收峰(曲线1~3),说明荧光聚合物模拟酶具有明显的模拟酶催化活性。光学照片也进一步证明,荧光聚合物模拟酶确实具有模拟酶催化性能,溶液显示出明显的蓝色。
实施例1制备的荧光聚合物模拟酶催化活性相关数据见图5。可以看出,随着过氧化氢浓度的增加,溶液在652nm处的吸光度值逐渐增加,而且在50μM~500μM之间,溶液的吸光度值与过氧化氢浓度呈现良好的线性关系。
具体实施方式
实施例1
(1)将0.1mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到5mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止20分钟,反应结束后无需处理即可得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为1mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将10μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到500μL、pH=3.5的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入100μL、浓度为1mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入3.25μL、6.5μL、9.75μL、13μL、16.25μL、26μL、32.5μL浓度为0.01M的过氧化氢溶液,在35℃培养15分钟,得到过氧化氢浓度为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、400μM、500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值,得到该浓度下溶液的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
实施例2
(1)将0.5mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到4mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止20分钟,反应结束后无需处理即可得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为2.5mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将25μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到600μL、pH=3.5的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入100μL、浓度为2mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入3.63μL、6.5μL、10.87μL、14.5μL、18.13μL、29μL、36.25μL浓度为0.01M的过氧化氢溶液,在35℃培养15分钟,得到过氧化氢浓度为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、400μM、500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值,得到该浓度下溶液的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
实施例3
(1)将1mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到3mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止30分钟,反应结束后无需处理即可得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为5mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将50μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到700μL、pH=4.0的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入200μL、浓度为3mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入4.75μL、9.5μL、14.25μL、19μL、23.75μL、38μL、47.5μL浓度为0.01M的过氧化氢溶液,在40℃培养30分钟,得到过氧化氢溶液为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、400μM、500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值,得到该浓度下溶液的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
实施例4
(1)将1mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到2mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止320分钟,反应结束后无需处理即可得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为5mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将50μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到800μL、pH=4.0的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入200μL、浓度为4mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入5.25μL、10.5μL、15.75μL、21μL、26.25μL、42μL、52.5μL浓度为0.01M的过氧化氢溶液,在40℃培养30分钟,得到过氧化氢浓度为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、400μM、500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值,得到该浓度下溶液的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
实施例5
(1)将1.5mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到1mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止40分钟,反应结束后无需处理即可得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为7.5mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将75μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到900μL、pH=4.5的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入300μL、浓度为5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入6.37μL、12.75μL、19.12μL、25.5μL、31.87μL、51μL、63.75μL浓度为0.01M的过氧化氢溶液,在45℃培养45分钟,得到过氧化氢浓度为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、400μM、500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值,得到该浓度下溶液的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
实施例6
(1)将2mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到0.1mL的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止40分钟,反应结束后无需处理即可得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得浓度为10mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将100μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到900μL、pH=4.5的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入300μL、浓度为5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液作为比色反应底物;再加入6.5μL、13μL、19.5μL、26μL、32.5μL、52μL、65μL浓度为0.01M的过氧化氢溶液,在45℃培养60分钟,得到过氧化氢浓度为50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、400μM、500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值,得到该浓度下溶液的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
Claims (4)
1.一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,其步骤如下:
(1)将浓硫酸滴加到的二乙烯三胺中,冰水浴条件下静止20分钟~40分钟,得到乳白色的荧光聚合物模拟酶;
(2)将步骤(1)得到的荧光聚合物模拟酶分散到水中,制得荧光聚合物模拟酶分散液;
(3)将步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺乙醇溶液作为比色反应底物;再加入过氧化氢水溶液,在35℃~45℃培养15分钟~60分钟,得到过氧化氢终浓度为50μM~500μM的过氧化氢溶液;
(4)测定步骤(3)得到的已知过氧化氢浓度的溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值;
(5)根据步骤(3)中过氧化氢的浓度和步骤(4)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值,建立浓度-吸光光度值的标准曲线;
(6)按照步骤(3)中的方法,配制未知过氧化氢浓度的溶液,同时测定该溶液的吸光光度值;将该吸光光度值代入步骤(4)得到的浓度-吸光光度值标准曲线,计算得到溶液中过氧化氢的浓度,从而实现基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,其特征在于:步骤(1)中是将0.1mL~2mL的浓硫酸(质量分数为98%)滴加到0.1mL~5mL的二乙烯三胺中。
3.如权利要求1所述的一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,其特征在于:步骤(2)中是制得浓度为1mg/mL~10mg/mL的荧光聚合物模拟酶分散液。
4.如权利要求1所述的一种基于荧光聚合物模拟酶的过氧化氢比色传感方法,其特征在于:步骤(3)中是将10μL~100μL步骤(2)制备的荧光聚合物模拟酶分散液加入到500μL~900μL、pH=3.5~4.5的NaAc-HAc缓冲溶液中;然后向该反应体系中加入100μL~300μL、浓度为1mM~5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺乙醇溶液作为比色反应底物;再加入3.25μL~65μL浓度为0.01M的过氧化氢水溶液,在35℃~45℃培养15分钟~60分钟,得到过氧化氢终浓度为50μM~500μM的过氧化氢溶液。
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2017
- 2017-10-30 CN CN201711032147.9A patent/CN107748143B/zh active Active
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