CN107709569A

CN107709569A - 净化用作腹膜透析的葡萄糖聚合物原料的淀粉的优化方法

Info

Publication number: CN107709569A
Application number: CN201680030446.6A
Authority: CN
Inventors: 皮埃尔·拉诺; 蒂埃里·杜邦; 法布里斯·阿兰; 马蒂厄·卡庞捷; 海拉·海瑟尼-盖尔毕; 艾格内斯·德尼斯
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: MX2017015429A; JP2018516086A; WO2016193634A1; EP3303409B1; PL3303409T3; TR201910239T4; ES2738699T3; FR3037063B1; EP3303409A1; FR3037063A1; JP6967972B2; CN107709569B; US20180148754A1

Abstract

本发明涉及一种用于净化淀粉的方法，所述淀粉用作制备旨在用于腹膜透析的葡萄糖聚合物的原料，该方法包括以下步骤：‑制备蜡质玉米淀粉；‑将以在20％与40％干物质之间的浓度处于悬浮液中的该蜡质淀粉置于pH在约5与约6之间、特别是约5.5的工艺用水中；‑用浓度等于或在100ppm与500ppm之间、优选为300ppm的过氧乙酸溶液处理该淀粉悬浮液；‑使该淀粉脱水，然后将其在调节至pH在约5与约6之间、特别是约5.5的脱矿质水中并且以在20％与40％干物质之间的浓度溶解；‑升高温度至约107℃，然后添加α‑淀粉酶持续15分钟；‑任选地，用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理；‑在硅藻床上过滤该悬浮液；‑用具有非常高的吸附能力、药用质量和“微孔的”孔隙率的活性碳进行处理；‑用具有“间隙孔的”孔隙率的第二活性碳进行处理；‑任选地，穿过具有大于100埃孔隙率的大孔吸附聚合树脂；‑任选地，进行连续的5000Da超滤；‑通过具有0.22μm孔隙率的无菌过滤器安全过滤。

Description

净化用作腹膜透析的葡萄糖聚合物原料的淀粉的优化方法

本发明涉及开发用于净化淀粉的优化方法，该淀粉用于生产葡萄糖聚合物的回路中，更具体地旨在用于医学领域的那些葡萄糖聚合物，仍更具体地针对腹膜透析的那些葡萄糖聚合物。

发明的技术背景

本申请人公司已经选择在如下领域中开发其发明，该领域因微生物来源污染物的危险性而为人所知，该微生物来源污染物能够在葡萄糖聚合物生产回路中发展并且是对人类健康非常有害的可能的炎性反应的来源。

因此在健康安全方法的背景下，重要的是通过所有适当的技术手段，尤其是通过以下各项来确保不存在处于活细胞形式和处于细胞碎片形式两者的微生物来源的污染物：

-用于有效鉴别和测定污染物的方法的限定，

-通过设置适当的纯化装置和技术限定安全生产回路。

在腹膜透析的情况下，必需在严格的净度条件下制备一定量的成分。

这是因为腹膜透析是一种类型的透析，其目的是除去肾不能处理或者不再能处理以从血浆纯化出的废物，例如尿素、肌酸酐、过量的钾或过剩的水。这种医学处理适用于终末期慢性肾衰竭的情况。

最常用的透析液由在酸性pH(5.2-5.5)或生理学pH(7.4)下的缓冲溶液(乳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液)组成，其中添加了：

-电解质类(钠、钙、镁、氯)并且最重要的是

-渗透剂，主要是葡萄糖聚合物，例如像存在于由巴克斯特(BAXTER)公司销售的非卧床腹膜透析液中的“艾考糊精”。

在使用旨在用于持续非卧床腹膜透析的葡萄糖聚合物的这一更具体的领域中，非常快地变得显而易见的是这些淀粉水解产物(葡萄糖的混合物和葡萄糖低聚物和聚合物的混合物)不能够按照原样使用。

欧洲专利申请EP 207 676传授在水中形成10％浓度的清澈和无色溶液的葡萄糖聚合物是优选的，所述葡萄糖聚合物具有5 000至100 000道尔顿的重均分子量(Mw)和小于8 000道尔顿的数均分子量(Mn)。

这类葡萄糖聚合物还优选地包含至少80％的葡萄糖聚合物，该葡萄糖聚合物的分子量在5 000和50 000道尔顿之间、很少或没有葡萄糖或葡萄糖聚合物的DP小于或等于3(分子量504)并且很少或没有葡萄糖聚合物的分子量大于100 000(DP为约600)。

换言之，优选的葡萄糖聚合物是具有低多分散性指数(通过计算Mw/Mn比率所获得的值)的葡萄糖聚合物。

在专利申请EP 207 676中建议的用于从淀粉水解物获得这些具有低多分散性指数的葡萄糖聚合物的方法在于：

-借助于水混溶性溶剂进行麦芽糊精的分级沉淀，

-或者通过拥有适当的截止或排除阈值的各种膜对这一相同麦芽糊精进行分子过滤。

在这两种情况中，这些方法的目的在于除去非常高分子量的聚合物以及低分子量单体或寡聚物两者。

然而，从它们实现的角度来看并且从它们有可能获得的产品的产率和质量的角度来看，这些方法并不令人满意。

为了开发用于生产低多分散性指数优选地小于2.5、Mn优选地小于8 000道尔顿和Mw在12 000与20 000道尔顿之间的完全水溶性葡萄糖聚合物的方法，所述方法不存在现有技术的缺点，通过从水解淀粉而非麦芽糊精开始，本申请人公司在其专利EP 667 356中而努力解决此问题。

通过色谱分级所获得的葡萄糖聚合物则优选含有少于3％的葡萄糖和DP小于或等于3的葡萄糖聚合物，以及少于0.5％的具有大于600的DP的葡萄糖聚合物。

污染的风险

然而，应该注意的是，存在旨在用于腹膜透析的制剂的微生物污染的风险。

的确，已知葡萄糖聚合物生产回路可能受微生物或所述微生物中所含的促炎性物质污染。

在从淀粉开始制造葡萄糖聚合物的方法的情况下，通常描述为，在淀粉生产中，玉米(或小麦)淀粉的污染是由于酵母、霉菌和细菌类型的微生物，以及更具体地是由于酸热脂环酸芽孢杆菌类型的酸性耐热细菌(在回路的高温和酸性区域的极端微生物细菌)。

接受这些污染葡萄糖聚合物的患者的主要风险则是腹膜炎。

腹膜炎的这些发作是通过腹膜内细菌感染引起的，并且通过阳性透析液培养通常易于建立诊断。

“无菌性腹膜炎”，其被描述为无菌、化学或培养物阴性腹膜炎，就其本身来说一般由化学刺激物或异物引起。

自从引入艾考糊精用于制备腹膜透析溶液，已经报告了无菌性腹膜炎的孤立病例，这些病例可能与各种原因有联系，尤其是通过潜在存在的促炎性物质来诱导。

无菌炎性发作因此是注射透析液后所观察到的主要并发症。

虽然这些炎性发作的某些与化学性质关联(意外注射化学污染物或某些化合物的不正确剂量)，但是大部分病例与用来制备透析液的溶液中出现的微生物源污染物存在直接相连。

脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是具有甚至以痕量存在时引发炎症的高风险的主要微生物源污染物。

此外，本申请人公司荣幸在于还已经考虑到能够加重由这些污染物(例如PGN解聚产物(其仍有生物活性的最少结构是胞壁酰二肽(MDP))引起的炎性反应的分子的存在。

除PGN解聚产物之外，甲酰化微生物肽，其原型是f-MLP(甲酰基-Met-Leu-Phe三肽)，也具有实质性的协同活性。最初，这些肽因它们对白细胞的趋化剂活性而鉴定，尽管它们不能诱导细胞因子反应本身。

因此重要的不是忽略这些“小分子”，因为它们可以通过加重痕量PGN和/或LPS的作用间接地引起无菌炎性发作。

用于有效鉴别和测定所述污染物的方法的限定

因此本申请人公司致力于开发比现有技术中可获得的那些更有效的检测和测定方法。

在最近几年内，已经开发了使用原代细胞的许多测试，以便替代炎性反应测试中的动物模型。

然而，这些体外模型遭受巨大的个体间变异性，这可能是实验偏差的原因。

相反，单核细胞细胞系给出一致反应，由此解释了目前正在开发的试验为何日益使用培养的这种类型细胞。然而，这些测试具有对溶液中作为混合物存在的全部污染物给出总体炎性反应的缺点，并且因此使得不可能表征污染物的性质。

还重要的是，注意到加重的炎性反应对于炎症的急性期的细胞因子而言是可见的，例如：

-TNF-α(肿瘤坏死因子α)，

-IL-1β(白细胞介素1β)以及

-趋化因子，例如CCL5(趋化因子(C-C基序)配体5)/RANTES(当活化时调节的、正常T细胞表达和分泌的)，

但是对于IL-6(白细胞介素6)而言，是不可见或勉强可见的。

因此，基于IL-6产生的方法(US 2009/0239819和US2007/0184496)不适合于检测溶液中作为混合物的污染物。

因此本申请人公司的荣幸在于，在其国际专利申请WO2012/143647中已经开发了用于检测具有促炎性作用的微生物污染物的灵敏且有效方法，所述微生物污染物低于目前使用和/或文献中描述的程序的灵敏度阈值，并且随后已经鉴定了在批次中以痕量存在的促炎性分子的家族或甚至其性质的灵敏且有效方法，其中所述促炎性分子源自生产回路。

确定单独纯化步骤的有效性

然后本申请人公司寻求更好地限定将在用于腹膜透析的葡萄糖聚合物上进行的关键纯化步骤。

为了这个目的，它致力于通过使用基于如在其国际专利申请WO2012/143647中呈现的单核细胞系的检测和测定方法，验证关键单独纯化步骤。

因此，在其国际专利申请WO 2013/178931中，本申请人公司分析了在用于腹膜透析的葡萄糖聚合物上进行的以下单独步骤的有效性：

-热处理，

-酸化，

-穿过活性碳，

-穿过吸附、超滤、或过滤树脂，

-化学水解或酶促水解。

在至今未经检验的最近专利申请中，本申请人公司则努力限定仔细挑选和整理的几个净化步骤的组合，为了其在消除可能存在于由制造方法产生的葡萄糖聚合物中的所有炎性分子的有效性，而不管污染的性质。本发明的方法因此涉及在用于腹膜透析的葡萄糖聚合物上进行的以下步骤的组合：

-用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理，

-用具有非常高的吸附能力和“微孔的”孔隙率的药用级活性碳进行处理，

-任选地，用具有“间隙孔的”孔隙率的第二活性碳进行处理，

-穿过具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附聚合树脂，并且

-进行连续的5kDa超滤。

虽然这项工作使得可能限定能够使用于腹膜透析的葡萄糖聚合物安全而不被所有的潜在污染物污染的最好组合，仍然存在对用于净化生产用于腹膜透析的葡萄糖聚合物(即进入葡萄糖聚合物制备的回路的蜡质玉米淀粉和粗淀粉水解产物)的回路的潜在污染物的实际来源的优化方法的上游开发的未满足的需要。

事实上，提供能够有效地处理被来自酵母、霉菌或细菌类型的微生物的细胞碎片自然污染的蜡质玉米淀粉的方法，则将使得可能简化对从其产生的葡萄糖聚合物的任何随后的处理。

这样一种在粗产物来源上的净化处理将有效地导致可能污染葡萄糖聚合物生产回路的污染物的负荷的减少，从而将有助于使它们安全，使得能够满足制药行业在用于腹膜透析的产物的纯化程度方面的先决条件。

发明详细说明

因此，本发明提供了仔细挑选和整理的几个净化步骤的组合，其证明在消除可能存在于用作制备用于腹膜透析的葡萄糖聚合物的原料的淀粉和淀粉水解产物中的所有炎性分子(而不管污染的性质)方面有效。

根据本发明的方法用于净化用作制备用于腹膜透析的葡萄糖聚合物的原料的淀粉，该方法包括以下步骤：

-制备蜡质玉米淀粉，

-将蜡质淀粉以在20％与40％干物质之间的浓度悬浮于pH值在约5与约6之间(特别是约5.5)的工艺用水中，

-用浓度在100ppm与500ppm之间(优选为300ppm)的过氧乙酸溶液处理淀粉的悬浮液。

-将过量的水从淀粉中除去，然后在调节至pH在约5与约6之间(特别是约5.5)的脱矿质水中并且以在20％与40％干物质之间的浓度吸收，

-升高温度至约100℃与110℃之间，优选至约107℃，然后添加α-淀粉酶持续约10至20分钟，优选约15分钟，

-任选地，用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理，

-经硅藻床过滤悬浮液，

-用具有“间隙孔的”孔隙率的第二活性碳进行处理，

-任选地，穿过具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附聚合树脂，并且

-任选地，进行连续的5kDa超滤，

-经孔隙率为0.22μm的无菌过滤器安全过滤。

该方法的步骤将按照它们出现的顺序进行。

在优选的实施例中，进行了该方法的所有步骤，包括任选的步骤。

在本发明背景下：

-“工艺用水”意指在湿淀粉生产回路中使用的、在其中循环的所有或部分水(尤其是参考文件EEC中谷物加工工业的能量平衡(Bilan énérgétique des industries detransformation des céréales dans la CEE[Energy balance of the cerealprocessing industries in the EEC])中的图5，可获得自因特网上的文件地址：///J:/CDNA10994FRC_001.pdf)

-“具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂”意指甘露聚糖酶类型(例如由诺维信公司(Novozymes)销售的)的酶活性；

-“具有非常高的吸附能力和‘微孔的’孔隙率的药用级活性碳”意指具有等于Norit C Extra USP活性碳的孔隙率的活性碳；

-“具有‘间隙孔的’孔隙率的活性碳”意指具有等于ENO-PC活性碳的孔隙率的活性碳；

-“具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附聚合树脂”意指DOWEX OPTIDORE SD2型的树脂。

-“约”意指所述值加或减10％，优选加或减5％。例如，“约100”意指在90与110之间、优选地在95与105之间。其也指代准确的值。

这些促炎性污染物首先是细菌来源的分子。

具体地，它们可以是：

-PGN，

-LPS，

-脂肽，

-PGN解聚产物，尤其是MDP，

-甲酰化微生物肽，例如f-MLP，

-β-葡聚糖,

-等等。

用于测量体外炎性反应(该体外炎性反应在本发明的背景下用于监测制备用于人类中的治疗用途(例如，腹膜透析溶液)的葡萄糖聚合物的方法的净化步骤的效力)的方法是基于使用单核细胞/巨噬细胞类型细胞系(THP-1、和/或Raw-Blue^TM)以及表达特异性天然免疫受体的、经转染的细胞系(HEK-Blue^TM)的细胞测试(“生物测定”)，该细胞测试是由本申请人公司从商业细胞系开发而来，并且在其在先专利申请中进行了详细描述。

优选使用五个细胞系：

-Raw-Blue^TM细胞系：这一细胞系源自于小鼠巨噬细胞，响应于可以存在于葡萄糖聚合物基质和衍生物中的大部分促炎性污染物(PGN、脂肽、LPS、酵母聚糖、LTA)。因此，其使用使得可能估计存在于样品中的促炎性分子的整体负荷。

-HEK-Blue^TM hTLR2细胞系：这一细胞系表达hTLR2受体，特异地响应于TLR2激动剂(尤其是PGN和脂肽)。因此其使用使得可能确定在触发炎性反应中的这些污染物的水平。

-HEK-Blue^TM hTLR4细胞系：这一细胞系表达hTLR4受体，特异地响应于LPS。因此其使用使得可能确定在触发炎性反应中的这些污染物的水平。

-HEK-Blue^TM hNOD2细胞系：这一细胞系表达hNOD2受体，特异地响应于NOD2激动剂。因此其使用使得可能确定在炎性反应触发中的MDP和相关分子的水平。

-HEK-Blue^TM Null2细胞系：这是未用免疫受体转染的对照细胞系。其使用对于验证葡萄糖聚合物的或其水解产物的溶液不经由毒性机制诱导SEAP产生是必需的。

然而，应注意的是，本领域技术人员还可以使用其他商业细胞系(IMGENEX)或者他们可制备这些细胞系。

在一个优选的实施例中，以0.5与1×10⁶个细胞/mL培养基之间的密度使用这些细胞系，并且使得葡萄糖聚合物或其水解产物的制剂与这些细胞接触持续约16h至24h。

可以使用剂量-反应曲线量化污染物。这种剂量-反应曲线可以尤其是用相同的细胞在相同条件下随着污染物的剂量递增产生。这些剂量-反应曲线具体地用LPS、PGN、脂肽和MDP标准品产生。

优选地，这样一种剂量-反应曲线可以针对以下各项而产生：表达TLR4的细胞(例如，THP-1、HEK-Blue^TM hTLR4和Raw-Blue^TM)，用递增剂量的LPS；表达TLR2的细胞(例如，THP-1、HEK-Blue^TM hTLR2和Raw-Blue^TM)，用递增剂量的PGN；以及经由NOD2反应的细胞(例如，HEK-Blue^TM hNOD2)，用递增剂量的MDP。

可以如在本申请人的专利申请：WO2012/143647和WO2013/178931中所述，进行细胞测试。

在pH值为约5和约6之间(特别是约5.5)的工艺用水中制备浓度为20％与40％干物质的蜡质淀粉的，悬浮液后，根据本发明的方法的第一实际净化步骤在于用过氧乙酸处理。能以在100ppm与500ppm之间的浓度使用过氧乙酸。优选地，将采取用300ppm的过氧乙酸处理的水。接触时间是约2小时，温度在约5℃与约15℃之间，优选约10℃。这种用过氧乙酸对淀粉的处理已证实在本方法的任何后续步骤中减少污染物的有效性，特别是对于PGN型污染物。当使用工艺用水来制备淀粉的悬浮液时，这种效果就更加明显了。

将过量的水从淀粉中除去，然后在调节至pH在约5与约6之间(特别是约5.5)的脱矿质水中并且以在20％与40％干物质之间的浓度吸收后者之后，以下步骤为淀粉的液化。在约100℃与110℃之间的温度下(优选在约107℃下)放置悬浮液并添加α-淀粉酶来将淀粉液化。酶水解持续约10至20分钟，优选约15分钟。

以下步骤可任选地包括用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理。

甘露聚糖酶型的这种酶活性，例如由诺维信公司(Novozymes)销售的酶制剂已经证明对于解离大复合体，例如细菌碎片和高分子量PGN是有效的。

因此，如果对液化和水解淀粉的分析揭示了高水平的PGN型污染物，就可以实现。

当在50℃，在用NaOH调节至pH 10的32％(重量/体积)葡萄糖聚合物溶液中以0.4％(体积/体积)的终浓度使用它持续24h的处理时间时，该酶制剂的活性是最佳的。

处理后，溶液经硅藻床过滤，如下所例示的。

然后以下步骤在于处理串联在一起两个活性碳：

1)具有非常高的吸附能力和“微孔的”孔隙率的第一药用级活性碳，

本申请人公司推荐使用Norit C Extra USP型的活性碳。这是因为C Extra USP碳在消除PGN及其降解产物时被证明有效。

在用HCl调节至pH 4.5的32％(重量/体积)葡萄糖聚合物溶液中以0.5％(重量/体积)的终浓度添加它时，活性是最佳的。

伴随在80℃下搅拌1h进行该处理。

2)具有“间隙孔的”孔隙率的第二活性碳，

在此，ENO-PC型活性碳是优选的。这一质量的活性碳具有广谱的作用，并且使得可能优先消除具有<100kDa的分子量的分子(例如，LPS、和PGN的降解产物)。

还在80℃温度下，在pH 4.5，按0.5％的含量，在此使用它持续1h。

通过这两个活性碳后获得的溶液最终经孔隙率阈值为3μm的过滤膜过滤。

任选的如下步骤在于在具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附聚合树脂上进行的处理。

选择Dowex SD2树脂，该树脂具有与其他相同家族的树脂相比，污染分子(除了PGN外)的更广谱的消除。

如下所例示的，在包含20ml的这种树脂的柱上，洗脱32％(250ml)葡萄糖聚合物溶液。

这一步骤是推荐给含有大量LPS的原料和/或用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂处理的原料。

还可任选地，如下步骤包括在具有截止阈值为5kDa的膜上的连续的超滤。

这一步骤是推荐给含有大量PGN解聚产物的原料。

最后步骤包括经具有截止阈值为0.22μm的膜的安全过滤。

从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。

实例

实例1：用于炎性反应测试的细胞系的特征

用标准的激动剂分子产生剂量-反应曲线：根据本申请人公司的国际专利申请WO2013/178931的教导，LPS、PGN和MDP，溶解于无污染的麦芽糊精(PGN<1ng/g、LPS<0.5ng/g、MDP<0.2ng/g)以32％(重量/体积)在不致热的水(用于注射)中的溶液中。

使用递增浓度的激动剂孵育Raw-Blue^TM和HEK-Blue^TM hTLR2、hTLR4、hNOD2以及Null2细胞并且通过定量SEAP活性测量细胞应答：

-Raw-Blue^TM细胞系：细胞响应于易存在于葡萄糖聚合物基质和衍生物(PGN和LPS)中的主要炎性分子；它们特别是对于PGN具有高反应性，但不响应于其解聚产物(MDP)。

-HEK-Blue^TM hTLR2细胞系：对于PGN具有高反应性；细胞显示对于LPS和MDP无反应性，

-HEK-Blue^TM hTLR4细胞系：对于LPS具有高反应性；细胞显示对于PGN和MDP无反应性，

-HEK-Blue^TM hNOD2细胞系：对于MDP具有高反应性；细胞显示对于PGN和LPS无反应性，

-HEK-Blue^TM Null2细胞系：不存在细胞毒性的对照；细胞显示对于PGN、LPS和MDP无反应性。

实例2：葡萄糖聚合物原料的制备

原料制备步骤都是在中试规模上进行的。

原料由浓度为20％与40％干物质(重量/体积)之间悬浮的蜡质淀粉制备。

处于悬浮液中的淀粉在4℃下静置过夜，从其中除去过量的水，然后以在20％与40％之间的浓度重悬浮于调节至pH 5.5的水中。然后将悬浮液加热至107℃，然后在α-淀粉酶的存在下处理15min。液化后，通过添加1N HCl(pH 4)停止酶反应，在硅藻床(40μm)上过滤液化产物。

取决于测试，淀粉溶解于脱矿质水或工艺用水中，以便估计这种常用的水对原料造成的污染比例。

为了减少在该方法开始时的污染物负荷，可以用0.03％的过氧乙酸溶液处理淀粉悬浮液。在这种情况下，以20％与40％之间(w/v)的浓度悬浮蜡质淀粉，在4℃下静置过夜，从其中除去过量的水，将其重悬浮，然后在过氧乙酸(300ppm)的存在下进行处理。在另一次除去过量的水后，在20％与40％(w/v)之间的浓度下，将淀粉重悬浮于脱矿质水中。如前所述，加热溶液，添加α-淀粉酶持续15min。通过添加1N HCl(pH 4)停止反应，然后过滤。

本申请人公司的国际专利申请WO 2013/178931的教导已经显示酶制剂在解离最终葡萄糖聚合物制剂中的大复合体例如细菌碎片和高分子量PGN是有效的。当在用NaOH调节至pH 8的32％(重量/体积)葡萄糖聚合物溶液中以0.4％(体积/体积)的终浓度，在50℃下持续24小时的处理时间时其活性最优。处理后，溶液用HCl中和，通过在85℃下加热10min灭活酶。然而，酶制剂被痕量的LPS污染。此外，在治疗后还可以保留痕量的酶。为了将这些外源污染物考虑在内，酶处理步骤被放在过滤前的原料的制备结束时，因此在净化程序开始之前。

在每一个步骤后，取样以分析总体炎性负荷(用Raw-Blue^TM细胞测试)，以及PGN、LPS和MDP污染物的量(HEK-Blue^TM细胞反应)。

实例3：在净化前对由原料引起的炎性反应进行比较。

这些测试的目的是确定原料的促炎性反应性，鉴定生物污染物的性质，并测试使得能够在实施净化程序前减少它们的炎性反应的手段。借助于五个细胞类型，分析在各种原料中生物污染物的存在，以便具有对某些污染物特异的炎性反应的概述：

-Raw-Blue^TM细胞系：对于PGN具有高反应性的任何污染物，

-HEK-Blue^TM hTLR2细胞系：对于PGN和脂肽具有高反应性，

-HEK-Blue^TM hTLR4细胞系：对于LPS具有高反应性，

-HEK-Blue^TM hNOD2细胞系：MDP和PGN解聚产物，

-HEK-Blue^TM Null2细胞系：对于细胞毒性不存在的对照。

对于这些细胞测试，在细胞培养基中稀释原料以获得等于3.2％(w/v)的终浓度。结果表示为相对于最大细胞应答的活性(SEAP应答)。

测试1：蜡质淀粉以20％吸收在pH 5.5的水中，然后在α-淀粉酶存在下进行处理。测试了两种制剂：

-制剂1：蜡质淀粉+脱矿质水(WD)

-制剂2：蜡质淀粉+工艺用水(WR)

在该方法的每个阶段后取样：将淀粉悬浮在水中，添加α-淀粉酶(E)，液化(DE)。细胞测试的结果在图1中给出。

淀粉在脱矿质水中的悬浮液(WD)释放少量的PGN和LPS至上清液中(在HEK-TLR2、HEK-TLR4和Raw细胞中的中等应答)。酶的添加(WD+E)不导致污染。另一方面，液化释放大量的污染物，如用HEK-TLR2和HEK-TLR4测量、通过DEWD样品的强应答所证明的。这些结果表明PGN和LPS与淀粉粒相关，且液化导致其释放。

与脱矿质水相比，工艺用水含有大量的PGN，因为TLR2应答是饱和的。观察到HEK-TRL4细胞应答的较小增加，表明在该工艺用水中存在LPS，但低于PGN的水平。

HEK-NOD2细胞的应答对于两种制剂都不显著，或在工艺用水吸收的淀粉的液化后观察到相对低的应答。该观察结果表明，PGN并没有特别退化，因此本质上是以大复合体的形式存在。

为了验证这一假设，所取的样品都在Centricon 30型(截止阈值30kDa)的微孔过滤单元上过滤。在滤液上进行了HEK-TLR2和HEK-TLR4的细胞测试，并且应答与用未经过滤的产物获得的那些应答进行了比较。结果示于图2中。

来源于工艺用水(WR)中的淀粉悬浮液的样品含有大量的PGN和LPS，其在相应的滤液中没有发现。单独的工艺用水(水R)也引起了在HEK-TLR2和HEK-TLR4细胞中的强烈应答，证明了WR样品中LPS和PGN型的污染物主要来源于悬浮步骤。此外，在脱矿质水(WD)的悬浮液中观察到的温和应答证实了非液化淀粉释放很少的污染物。

相反，来源于淀粉液化(DEWD和DEWR)的两个样品被高度污染。在滤液中没有发现明显的PGN或LPS的痕迹，这证实了它们作为分子存在或作为分子重量>30kDa的聚集体存在。因此，这些数据支持大分子、聚集体和/或细胞碎片的存在，这是由工艺用水贡献和/或通过液化步骤从淀粉粒中释放的。

测试2：在本测试中，通过对脱矿质水中溶解的同一批淀粉进行实验，评价了过氧乙酸的效果。

蜡质淀粉以20％吸收在pH 5.5的水中，然后在α-淀粉酶存在下进行处理。测试了两种制剂：

-制剂1：蜡质淀粉+脱矿质水(WD)

-制剂2：蜡质淀粉+脱矿质水，然后用过氧乙酸处理(WAD)。

在该方法的每个阶段取样：将淀粉悬浮在水中，添加α-淀粉酶(E)，液化(DE)。细胞测试的结果在图3中给出。

淀粉在脱矿质水中的悬浮液(制剂1)释放少量的PGN和LPS至上清液中(具有HEK-TLR2、HEK-TLR4和Raw的WD样品的应答)。酶的添加不导致任何污染。另一方面，液化释放大量生物污染物，如在HEK-TLR2和HEK-TLR4测试中通过用DEWD样品获得的强烈应答所证明的。这些结果证实，PGN和LPS与淀粉粒密切相关，且液化导致它们溶解。

用制剂2获得的结果表明，过氧乙酸对与淀粉粒相关的PGN具有中和作用。实际上，在液化前样品中没有TLR2应答，因为用WAD和WAD+E样品获得的值处于测定的检测阈值。此外，在液化(DEWAD相对于DEWD)之后，TLR2应答显著减少。

另一方面，治疗对LPS几乎没有影响，因为用制剂2获得的TLR4应答类似于在所有样品中不存在过氧乙酸的情况下观察到的那些应答。该数据表明，LPS对用过氧乙酸的处理并不十分敏感。此外，这些污染物的存在解释了为什么消除PGN只会诱导用Raw细胞观察到的炎性反应的中度减少。

HEK-NOD2应答并不显著。这一观察结果表明，过氧乙酸的作用并不伴随着可能的炎性降解产物的形成，例如PGN和/或MDP型解聚产物的小片段，但实际上是通过PGN的炎性活性的中和。

测试3：在本测试中，通过对工艺用水中溶解的同一批淀粉进行实验，评价了过氧乙酸的效果。

蜡质淀粉以约30％干物质吸收在pH 5.5的水中，然后在蒸汽加压锅中在α-淀粉酶的存在下进行处理。测试了两种制剂：

-制剂1：蜡质淀粉溶解于工艺用水中，在4℃下静置过夜，从其中除去过量的水，然后吸收在调节至pH 5.5的工艺用水中(WR)。

-制剂2：蜡质淀粉溶解于工艺用水中，在4℃下静置过夜，然后用过氧乙酸在300ppm下进行处理。再次除去过量的水，然后吸收在调节至pH 5.5的脱矿质水中(WRAD)。

因此，制剂1对应于标准方案。在制剂2中，用过氧乙酸处理后，淀粉在脱矿质水中被吸收，以免引入新的污染物。

将淀粉悬浮于工艺用水中并液化后取样。在图4中给出细胞测试的结果。

正如预期的那样，工艺用水在制剂1中贡献了大量的可溶性PGN(WR样品的TLR2应答)。液化后，TLR2应答是饱和的(DEWR)，这证实了与淀粉粒相关的PGN型污染物的释放。相比之下，过氧乙酸处理，在减少制剂2中PGN的负荷中非常有效，是由水(WRAD)贡献的或通过液化(DEWRAD)释放的。

工艺用水也贡献了大量的可溶性LPS(WR样品中的TLR4应答)，但不同于用PGN观察到的，液化释放较少的这类污染物(对WR和DEWR样品的TLR4反应)。相比之下，过氧乙酸对LPS的负荷有中度影响，因为在制剂2(WRAD)中由工艺用水贡献的污染物负荷略有下降。

在两种制剂中，水都没有装载有MDP或PGN片段，并且液化释放出少量的MDP或PGN片段(对DEWR和DEWRAD的类似的NOD2应答)。

最后，在过氧乙酸作用后，反应总体炎性负荷的Raw细胞的应答在样品中减少，这与制剂2中PGN的显著损失一致(WRAD相对于WR以及DEWRAD相对于DEWR)。因此，在过氧乙酸作用后，Raw细胞的残余反应性主要是由工艺用水贡献的LPS引起的。

从总体上看，该数据证明了通过过氧乙酸处理在净化程序前显著降低原料中PGN的负荷方面的有效性。在该方法的后续步骤中，净化的优点还在继续。

测试4：第一次测试表明，由工艺用水贡献和/或通过液化步骤从淀粉粒释放的大部分炎性分子都以高分子量复合物(例如聚集体和/或细胞碎片)的形式存在。

在这种新的测试中，由于酶制剂的在分离高分子量聚集体和PGN的有效性，在液化和过滤步骤之间添加用酶进行处理。

蜡质淀粉以约30％被吸收在pH 5.5的工艺用水中，静置过夜，然后用过氧乙酸在300ppm下进行处理。在除去过量的水、然后在调节至pH 5.5的脱矿质水中吸收之后，添加α-淀粉酶以进行液化步骤(DEWRAD)。然后将溶液调节至pH 8，然后在酶制剂(0.4％)的存在下在50℃下处理24h。最终将溶液在硅藻床上过滤(DEWRADM)。

用过氧乙酸处理(WRAD)步骤、液化(DEWRAD)和酶制剂作用(DEWRADM)之后取样。在图5中给出细胞测试的结果。

正如预期的那样，工艺用水在制剂(WRAD)中贡献了大量的可溶性PGN。在这个测试中，水一定受到了PGN的特别污染，因为TLR2和Raw应答在过氧乙酸(WRAD)作用后仍然很高，并且在液化(DEWRAD)之后大体上已经饱和了。然而，可以注意到，在作用后，Raw应答减少，这证明了酶制剂确实消除了炎性污染物的一部分(DEWRADM相对于DEWRAD)。

与PGN不同，LPS的负荷在液化后很难修改，证明主要部分由工艺用水贡献。另一方面，添加后，存在TLR4应答强烈增加，这是可以预测的，因为该溶液本身受到了LPS的污染。

最后的结果表明，在净化程序中，LPS的这种外源贡献必须考虑在内。

实例4：净化程序对由原料引起的炎性反应的效果。

葡萄糖聚合物(以最终产品的形式)的各种净化处理已经单独和以组合进行了测试，并报告在本申请人公司的国际专利申请WO2013/178931中。这项工作使得可能鉴定对样品中存在的每种类型的污染物最适合的处理，并确定其应用于葡萄糖聚合物基质的条件。

诸位发明人想要测试这些处理的有效性，在最后的净化步骤中的最终产品、在复杂的混合物(例如淀粉水解产物)上开发。

选择的处理是：

-在活性碳上的处理：目前研究中选择的活性碳是：C extra USP，因为其在消除PGN上具有有效性；ENO-PC，因为在分子量<100kDa的污染物上是广谱的(例如，LPS和PGN降解产物)。

在用1N HCl调节至pH 4.5的32％(重量/体积)葡萄糖聚合物溶液中以0.5％(重量/体积)的终浓度添加它们时，碳的活性最大。伴随在80℃下搅拌1h进行处理。处理后，溶液(500ml)通过NaOH中和，然后在垂熔玻璃过滤器(3μm的孔隙率)上过滤。考虑到碳处理是分批进行的，且需要加热、中和和过滤步骤，它们在其他处理之前进行。

-通过吸附树脂：目前研究中选择的树脂是：Dowex SD2，因为其污染物消除的广谱性；MN-100，因为其在保留LPS-型分子方面的有效性。

对于该实验，在包含20mL的每一种树脂的柱上，洗脱32％葡萄糖聚合物溶液(250mL)。先前的研究教导表明，这种程序不会通过葡萄糖聚合物溶液引起树脂的任何饱和现象。

-5kDa超滤：超滤处理的目的是消除目前仍存在于葡萄糖聚合物溶液中的小分子(PGN和MDP的降解产物)。因此，如果NOD2应答是阳性的，那么该步骤是可选的，并且在程序的结束时使用。

测试在室温下进行，以25mL/min的速率在5kDa过滤器上连续注射葡萄糖聚合物溶液持续3h。为了补偿滤液的损失，将滞留物注入起始溶液，并且通过添加无菌脱矿质水，连续调节至初始体积(100mL)。

在实验室中进行各个净化步骤。在每一步骤后，在无菌条件下取出样品，并且用于细胞测试，以便测定总体炎性负荷(Raw应答)和生物污染物的量(TLR2、TLR4和NOD2应答)。对于饱和细胞应答，样品被预先稀释(1/10和1/100)。

污染物的浓度通过参考用标准的激动剂分子产生的剂量-反应曲线来计算：LPS、PGN和MDP，描述于实例1中，并根据本申请人公司的国际专利申请WO 2013/178931的教导建立。

然后将污染物浓度降低到样品中存在的葡萄糖聚合体的量。然后，将每个净化步骤后获得的值与初始原料的值进行比较，以便估计净化程序的有效性。结果表达为，相对于每个生物测定的检测的阈值极限(LOD)，相对于初始的污染物负荷和残余污染的降低的百分比(以ng/g葡萄糖聚合物计)：HEK-TLR2，<1ng PGN；HEK-TLR4，<0.5ng LPS；HEK-NOD2，<0.2ng MDP；Raw，<2ng PGN。

分析了以下程序:

-程序1：在这第一净化测试中，按照实例3测试3中描述的方案制备原料：蜡质淀粉(约20％)溶解在工艺用水中，在4℃下静置过夜(WR)，然后用300ppm的过氧乙酸处理。除去过量的水，然后吸收在pH 5.5的脱矿质水中(WRAD)。液化，然后在硅藻床上过滤(DEWRAD)。

然后，对应于DEWRAD样品的原料使用以下组合净化：

1.用C extra USP碳(0.5％)处理，然后在垂熔玻璃过滤器(3μm)上过滤，

2.用ENO-PC碳(0.5％)处理，然后在垂熔玻璃过滤器(3μm)上过滤，

3.通过SD2树脂柱，

4.无菌过滤器过滤(0.22μm)。

在制备原料的各种步骤后取样，再进行净化程序。

细胞测试的结果在图6中给出。

首先，在液化(TLR2和Raw应答)之前，用过氧乙酸(WRAD相对于WR)进行处理降低了PGN含量，但是对LPS(TLR4应答)没有显著效果。液化释放了大量与淀粉粒有关的PGN，因为TLR2和Raw应答对于DEWRAD样品已经饱和，而TLR4应答只稍微增加。由此可以得出结论，在本测试中，淀粉中含有大量的PGN，因为甚至在过氧乙酸的作用后TLR2和Raw应答还是饱和的(图6A)。

为了计算净化步骤的有效性，初始的污染物浓度是从每个细胞类型的DEWRAD样品中确定的；对于饱和的细胞应答(TLR2和Raw)，样品预先被稀释到1/100，然后浓度值用稀释因子校正。每个净化步骤计算污染物的残余浓度，然后这些值与初始浓度关联以将结果表达为降低百分比(图6B和表I)。

最令人惊讶的是，净化过程使得能够非常显著地减少TLR2应答，其中PGN的负载减少>99.9％(检测阈值)。另外，串联的C extra USP和ENO-PC碳在通过树脂之前，对消除PGN有加和效应，其因为它们的互补作用加强了这两种碳的选择。

鉴于对于该细胞系在该方法的最后达到了检测阈值极限，该程序在减少NOD2应答方面也很有效。与PGN相比，减少只有90％，但是这个值与在初始原料中的微量含量的NOD2激动剂(PGN和MDP解聚产物)有关。

在该程序结束时，LPS的消除是>99.9％，并且TLR4应答也达到了检测的阈值极限。可以注意到，通过SD2树脂是为了达到这个净化阈值。实际上，在用两种碳处理后仍然存在大量的LPS。然而，该物质被LPS高度污染，这可以解释为什么这两种碳的联合作用不足以消除所有的物质。

最后，Raw细胞的应答证实了这个第一程序在消除了在原料中存在的所有类型的污染物方面的有效性。实际上，没有再观察到显著的炎性反应(<检测的阈值极限)，这反映了在整体炎性负荷的>99.9％的减少。

LOD，检测极限

-程序2：第一个测试表明，可以任选地使用SD2树脂，其条件是在原料中LPS含量并不高。为了测试这一假设，按照上述的方案制备原料：蜡质淀粉(约20％)溶解在工艺用水中，在4℃下静置过夜(WR)，然后用300ppm的过氧乙酸处理。除去过量的水，然后吸收在pH5.5的脱矿质水中(WRAD)。液化，然后在硅藻床上过滤(DEWRAD)。

然后，对应于DEWRAD样品的原料使用“简化”组合进行净化，无需通过SD2树脂：

2.用ENO-PC碳(0.5％)处理，然后在垂熔玻璃过滤器(3μm)上过滤，

3.无菌过滤器过滤(0.22μm)。

在制备原料的各种步骤后取样，再进行净化程序。

细胞测试的结果在图7中给出。

在液化之前，用样品WR获得的TLR2应答是饱和的，表明工艺用水被PGN高度污染。用过氧乙酸进行处理部分减少了这种污染(WRAD)，但是液化释放新的PGN，因为用DEWRAD样品TLR2应答再次饱和。相反，LPS污染物(TLR4应答)仍然是中度，无论它们来自于工艺用水还是来自于液化。因此，在这新程序中使用的原料比前一种更强烈地污染上PGN，而LPS较少(图7A)。

然后根据净化程序，结合两种碳C-Extra和ENO-PC以及0.22μm过滤器过滤来处理DEWRAD样品。DEWRAD样品中所含污染物的初始负荷减少至100％，每个步骤后从残余污染物负荷计算相对减少百分比(图7B)。

尽管在原料上有很高的PGN污染，并且没有经过SD2树脂，但是净化程序使得能够非常显著地减少TLR2应答(>99.9％)。这一结果证实了碳在消除这种类型的污染物方面的有效性。该组合也足以降低PGN解聚产物的负荷，因为在该方法的结束时达到了NOD2应答的检测阈值极限。

与第一净化测试不同，在这里似乎不需要SD2树脂来减少LPS污染。实际上，TLR4应答也达到了检测的阈值极限，在该程序结束时，LPS消除为>99.9％。

最后，Raw细胞的应答证实了这一“简化”程序消除在低LPS负荷的原料中存在的污染物的有效性。实际上，在程序结束时不再有显著的炎性反应(<检测阈值极限)。

-程序3：在这第三净化测试中，根据实例3测试4描述的方案制备原料，其中在液化步骤和在硅藻床上过滤步骤之间添加用酶进行处理。事实上，酶制剂被证明在分离高分子量PGN和聚集体方面有效的。

然而，被LPS污染。为了消除这种外源性贡献，SD2树脂被MN-100树脂替代，因为其在单个测试中保留LPS型分子方面的效率。

制备：蜡质淀粉(包含约30％干物质)溶解在工艺用水中，在4℃下静置过夜，然后用0.03％过氧乙酸处理。除去过量的水，然后吸收在调节至pH 5.5的脱矿质水中(WRAD)。添加α-淀粉酶并液化(DEWRAD)。调节至pH 8并在50℃下用(0.4％)处理24h(DEWRADM)。

然后，对应于DEWRADM样品的原料使用以下组合进行净化：

2.用ENO-PC碳(0.5％)处理，然后在垂熔玻璃过滤器(3μm)上过滤，

3.通过MN-100树脂柱，

4.无菌过滤器过滤(0.22μm)。

在制备原料的各种步骤后取样，然后进行净化程序。

细胞测试的结果在图8中给出。

在液化之前，用WRAD样品获得的TLR2应答不饱和，表明用过氧乙酸进行处理在降低由工艺用水贡献的PGN污染方面有效。另一方面，液化释放新的PGN，因为用DEWRAD样品TLR2应答是饱和的。LPS污染在工艺用水(WRAD)中很高，并且正如预期的那样，液化不会显著改变TLR4应答。另一方面，的添加贡献了重要的外源性LPS的污染，因为由DEWRADM样品引起的TLR4应答是饱和的。因此，用于这一新测试的原料被PGN和LPS严重污染(图8A)。

然后，根据程序结合两种碳C-Extra和ENO-PC、MN-100树脂以及0.22μm过滤器过滤处理DEWRADM样品。DEWRADM样品中包含的污染物的初始负荷减少至100％，并且在每一步骤后从残余负荷计算相对减少百分比(图8B和表II)。

净化过程在消除LPS的过程方面非常有效，因为观察到TLR4应答显著降低(>99.8％)，其达到测定的检测阈值极限。因此，MN-100树脂保留了这些污染物，无论是由工艺用水或是由酶制剂贡献的。

鉴于在程序结束时还达到NOD2应答的检测阈值极限，该组合在消除PGN解聚产物方面也有效。

另一方面，尽管在该方法结束时减少了约99％的炎性负荷，TLR2应答仍保留(相当于每克干物质5.2ng PGN)。这一数据表明，尽管两种碳在除去PGN方面的联合有效性，但是TLR2激动剂仍然以痕量存在于原料中。

Raw细胞的应答证实了在程序结束时在原料中存在炎症污染物。实际上，总体炎性负荷的降低仅为98.5％，且应答明显高于检测阈值极限(相当于每克干物质8ng PGN)。

因为先前的测试显示，两种碳在消除PGN方面的有效性，即使在严重污染的原料中，这些结果表明，酶制剂向PGN贡献具有不同的化学性质的TLR2激动剂。这些污染物可以是例如脂肽，其已知是TLR2应答的强诱导因子。因此，碳+MN-100树脂的组合，虽然在保留PGN和LPS方面有效，但是允许这种类型的污染物通过，这将解释残留的TLR2和Raw应答。

为了克服这个问题，在以下测试中，MN-100树脂被SD2树脂所替代，因为其作用的范围更广。

-程序4：在本测试中，原料与程序3所使用的DEWRADM样品相对应。净化程序使用先前的步骤，但用广谱的SD2树脂替代MN-100树脂：

2.用ENO-PC碳(0.5％)处理，然后在垂熔玻璃过滤器(3μm)上过滤，

3.通过SD2树脂柱，

4.无菌过滤器过滤(0.22μm)。

在制备原料的各种步骤后取样，然后进行净化程序。

细胞测试的结果在图9中给出。

每种污染物的相对减少量从组合中每一步后测量的残余负荷计算的，并且表达为相对于DEWRADM样品中包含的初始负荷的百分比(图9和表III)。

与程序3中测试的组合不同，使用SD2树脂的这种组合使得能够在检测阈值极限处将HEK-TLR2细胞应答消灭，而减少炎性负荷>99.9％。因此，串联的C-extra-USP和ENO-PC碳以及SD2树脂的组合显然在TLR2激动剂(无论是PGN还是其他类型的)的消除方面具有互补作用。该程序还保留了在去除NOD-激动剂污染物方面的有效性。

MN-100树脂的选择是基于酶制剂被LPS污染这一事实。用SD2树脂替代使得能够有效消除LPS，而在程序结束时减少>99.9％(检测阈值极限)。因此，从这些结果可以得出结论：SD2树脂比MN-100树脂在消除由原料中的贡献的LPS和其他污染物方面最终是一个更好的选择。

最后，Raw细胞的应答证实了这一程序在消除在原料中存在的所有类型的污染物方面的有效性。实际上，不再观察到显著的炎性反应(<检测阈值极限)，其反映了总体炎性负荷减少>99.9％。

LOD，检测极限

评价：

总之，在本研究中获得的结果表明，仔细挑选和整理的几个生产和净化步骤的组合证明在消除可能存在于用于制备葡萄糖聚合物的原料中的炎症分子方面有效。

该组合包括以下步骤：

-将蜡质淀粉以20％与40％干物质之间的浓度悬浮于工艺用水(pH＝5.5)中，

-用终浓度为100与500ppm之间(优选为300ppm)的过氧乙酸溶液处理淀粉悬浮液，

-将过量的水从淀粉中除去，然后在调节至pH 5.5的脱矿质水中吸收，且浓度在20％与40％干物质之间，

-升高温度至107℃，然后添加α-淀粉酶持续15min，

-对于含有大量PGN的原料，任选地用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂处理，例如

-经硅藻床过滤悬浮液，

-用具有等于C Extra USP的孔隙率的活性碳进行处理，

-用具有等于ENO-PC的孔隙率的第二活性碳进行处理，

-任选地，对于含有大量LPS的原料通过Dowex-SD2型吸附树脂和/或用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂(例如)处理，

-对于含有大量PGN解聚产物的原料，任选地进行连续的5kDa超滤，

-经孔隙率为0.22μm的无菌过滤器安全过滤。

这些步骤的组合使得能够针对不同的污染物家族，并提供用于无炎性反应性的葡萄糖聚合物的原料。

附图

图1：由在脱矿质水或在工艺用水中制备的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。

图2：由未过滤的原料以及通过30kDa超滤后获得的滤液引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。

图3：由在脱矿质水制备的且经或未经过氧乙酸处理的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。

图4：由在工艺用水中制备的且经或未经过氧乙酸处理的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。

图5：由在工艺用水中制备的且经处理的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。

图6：(A)由制备用于净化的程序1的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。(B)在程序1中污染物负荷的减少。负荷值从每种细胞类型的剂量-反应曲线获得并表达为相对于DEWRAD样品获得的那些的百分比，减少至100％。

图7：(A)由制备用于程序2的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。(B)在“简化”净化程序中污染物负荷的减少。负荷值从剂量-反应曲线获得并表达为相对于DEWRAD样品获得的那些的百分比，减少至100％。

图8：(A)由制备用于程序3的原料引起的细胞应答。结果表达为在620nm处测量的吸光度值(SEAP测试)。(B)在程序3中污染物负荷的减少。负荷值从剂量-反应曲线获得并表达为相对于DEWRADM样品获得的那些的百分比，减少至100％。

图9：在程序4中污染物负荷的减少。负荷值从剂量-反应曲线获得并表达为相对于DEWRADM样品获得的那些的百分比，减少至100％。

Claims

1.一种用于净化淀粉的方法，所述淀粉用作制备旨在用于腹膜透析的葡萄糖聚合物的原料，该方法包括以下步骤：

-制备蜡质玉米淀粉，

-将该蜡质淀粉以在20％与40％干物质之间的浓度悬浮于pH值在约5与约6之间、特别是约5.5的工艺用水中，

-用浓度在100ppm与500ppm之间、优选为300ppm的过氧乙酸溶液处理该淀粉悬浮液，

-将过量的水从该淀粉中除去，然后在调节至pH在约5与约6之间、特别是约5.5的脱矿质水中并且以在20％与40％干物质之间的浓度吸收，

-升高温度至约100℃与110℃之间、优选至约107℃，然后添加α-淀粉酶持续约10至20分钟、优选约15分钟，

-任选地，用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂进行处理，

-经硅藻床过滤该悬浮液，

-用具有“间隙孔的”孔隙率的第二活性碳进行处理，

-任选地穿过具有大于100埃的孔隙率的大孔吸附聚合树脂，并且

-任选地，进行连续的5kDa超滤，

-经孔隙率0.22μm的无菌过滤器安全过滤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂具有甘露聚糖酶类型的酶活性。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于如果该液化的和水解的淀粉证实具有高水平的PGN型污染物，则进行该用具有洗涤剂和澄清特性的酶制剂处理的步骤。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于进行全部所述步骤，包括所述任选的步骤。