CN107708672A - 用于延长血液和淋巴组织中的药物水平的多药脂质纳米颗粒组合物和相关方法 - Google Patents

用于延长血液和淋巴组织中的药物水平的多药脂质纳米颗粒组合物和相关方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了稳定地掺入多种具有不同疏水和水溶性特征的小分子药物的多药脂质纳米颗粒，以及其相关的制备和使用方法。公开的组合物和方法提供了增强的脂质纳米颗粒药物制剂的稳定性，该脂质纳米颗粒药物制剂可以可靠地提供应对不同机制的靶点的药物，在体内的存在延长，用于更有效地治疗和避免单药耐药。

Description

用于延长血液和淋巴组织中的药物水平的多药脂质纳米颗粒 组合物和相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年6月15日提交的第62/175,565号美国临时申请的权益，将其全部内容通过引用并入本文。
政府许可权利的声明
本发明是在由国家卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的AI077390(S1、S2和S3)、P51OD010425、RR00166、RR025014、UL1-TR000423和UM1-AI120176的政府支持下完成的。政府对发明享有一定的权利。
背景
多药联合治疗已经成为治疗疾病，诸如由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的疾病的注意标准(standard-of-care)，并且越来越多的证据表明其在用于治疗癌症方面优于单药治疗。针对HIV感染的联合抗逆转录病毒治疗(cART)由具有不同病毒靶标的多种口服给予的抗逆转录病毒药物的每日方案组成，其在降低耐药性和增加治疗功效方面的益处已经非常明确。然而，由于当前接受cART的患者的不依从和相关的病毒复发的挑战，迫切需要开发可以在每周或更低频率的基础上递送多药治疗的长效抗艾滋病毒药物技术。即使实施含有多种药物的单一口服片剂或胶囊作为标准cART以减轻药丸负担，呈现其游离形式的每种药物自然具有不同的药代动力学分布，在维持每种药物的有效血药浓度一致以最佳地抑制HIV而不促进耐药性方面出现难题。此外，口服联合药物向淋巴结和其他淋巴组织中的渗透差，导致细胞内淋巴药物浓度低且不一致。该药物不足以达到(link to)接受cART的患者的残留病毒，即使患者的血液中的病毒低或不可检测，这会导致病毒水平的复苏。
即使在药物-纳米颗粒制剂中使用看似相似的脂质或脂质赋形剂，制备方法和得到的药物-赋形剂相互作用可以产生具有独特的药理学和毒理学以及在体内的靶组织或清除组织中的分布的不同药物。将药物掺入封闭膜中，例如脂质体中的标准过程是熟知的。然而，虽然已经提出脂质体和其它封闭的膜作为用于脂溶性药物(掺入脂质壳中)和水溶性药物(包封在球形内部之中)的通用载体，但是多种药物的掺入和包封是困难的。
即使药物成功地与脂质颗粒结合，所得到的颗粒通常对于产品开发也是不够稳定的。亲水性化合物的脂质体包封已经被证明是特别困难的，所述亲水性化合物包括作为一线cART的关键组分的核苷类似物逆转录酶抑制剂(RTI)，如替诺福韦(TFV)、拉米夫定(3TC)和恩曲他滨(FTC)。由于相对于小单层囊泡的截留的内部含水隔室的大量外部含水空间，在具有中性电荷的传统脂质体中小亲水性分子的包封率通常非常低，通常小于几个百分点。增加TFV捕获的尝试需要用带正电荷的脂肪酸改变膜内容物。不仅通过血清中的蛋白质容易从脂质体膜去除脂肪酸，从而使脂质体载体不稳定和失效，而且带正电的阳离子颗粒也在体内与红细胞和其他细胞相互作用，导致颗粒不稳定和细胞毒性。事实上，与带正电荷的脂质相关的毒性问题已经是阳离子非病毒载体17的临床应用的主要障碍。
甚至对于应更容易引入脂质膜中的疏水性HIV药物，使用不同脂质组合物的优化研究产生了程度不完全和不均匀的两种掺入脂质体中的HIV药物。此外，这些甚至包括聚乙二醇修饰以改善稳定性的脂质体当在仅10％血清中孵育时容易释放药物，约80％的药物在孵育的第一小时内释放。脂质体结合的药物的快速去稳定使得这些颗粒对于药物从注射部位运送到靶组织无效。虽然固体聚合物颗粒可以以高达81％的效率掺入多种疏水性药物，但是这些颗粒甚至比脂质体更大，并且缺乏含水隔室，限制了它们容纳多种药物组合的效用。此外，这些大的聚合物药物载体和较小的量子点通常被捕获在局部注射部位并缓慢释放，而不是作为单个药物-颗粒单元运送到淋巴组织和细胞。
已经报道了许多针对标准脂质体装配过程的变化和替代方案。例如，在逆向蒸发囊泡(REV)、多层囊泡、单层囊泡中，使用乙醇注射脂质体制备方法。这些制剂可以提供单一药物分子的高度掺入，特别是用于脂溶性药物。然而，在溶液中捕获水溶性亲水性药物的能力是可变的，并且取决于脂质体封闭的膜环境内药物分子的捕获量和电荷。
基于脂质体膜捕获带电分子，如(NH4)2SO4的能力，和盐酸阿霉素的膜渗透性，硫酸阿霉素的脂质体内沉淀提供了脂质体中高效药物负载的方法。然而，这种称为远程负载的方法仅适用于有限数量的可渗透的并且具有显示低溶解度的抗衡离子的药物。不幸的是，并不是所有的药物都适合远程负载到脂质体中。
为了以制药规模提高脂质体和脂质-药物纳米颗粒的包封效率，有人已经使用了采用单或双乳液方法的微胶囊载体方法，收效甚微。例如，微乳液方法产生不同程度的可再现的药物掺入水平，并且需要在最终步骤中从水中去除残留的有机溶剂，这可能是困难的，并且如果去除过程不完全，则可能引起毒性风险。就单一药剂掺入而言，必须将关注的药物添加到有机(油)相(用于疏水性药物)或水相(用于水溶性亲水性药物)中。该过程难以掺入多种药物，特别是显示不同物理特征的药物-疏水性药物和亲水性药物。微乳液方法的变化是双乳液方法，其中将药物和沉淀剂如KCl放置在具有脂质赋形剂和表面活性剂的两种分开的油包水(o/w/o)乳液中。在混合两种o/w/o乳液时，药物-KCl颗粒形成纳米药物沉淀物。使具有单层脂质涂层的这些纳米沉淀物经受在脂质例如胆固醇和DOTAP的有机或w/o乳液中包覆的第二步。这样产生的纳米颗粒药物掺入效率非常低。例如，对于替诺福韦(也称为PMPA)，最终的药物结合％小于3％。此外，该方法被设计用于信号药物纳米颗粒形成。虽然基于脂质与药物比例，载药量可能较高，但基于从开始到结束结合的药物部分，药物损耗的百分比低。
为了改善携带电荷的水溶性药物的掺入，带正电的脂质如1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)已被包括在脂质膜中用于静电相互作用。不幸的是，正电荷会在动物中引起毒性风险，并且得到的粒径(大于100nm直径)更容易从体内快速清除和消除。类似地，在磷脂酰胆碱脂质中掺入携带正电荷的脂肪酸，硬脂胺(SA)可以使亲水性药物如TFV与直径高达～2000nm的大颗粒的结合提高到70％。然而，带正电的颗粒具有53-93mV的正ζ电位，并且同样显示线粒体毒性。因此，掺入带电脂质以促进亲水性药物掺入的组合物不太可能适合临床开发。
尽管在本领域中有进展，但仍然需要有效且廉价地将多种结构不同的药物掺入单一药物递送载体中的方法，其向体内的预期组织和靶点提供稳定的递送。在HIV治疗的情况下，仍然需要能够维持血浆中的药物浓度并将药物递送到淋巴组织中的病毒持续感染的部位的药物递送载体。本发明致力于这些和相关的需求。
概述
提供该概述以简化的形式介绍一系列概念，这些概念在下面的详述中进一步描述。该概述不是为了确定所要求保护的主题的主要特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
一方面，本发明提供了多药脂质纳米颗粒。所述多药脂质纳米颗粒包含：
在25℃下log P大于1的第一小分子药剂；
在25℃下log P小于0的第二小分子药剂；
第一两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；和
第二两亲性赋形剂，其包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域。
另一方面，本发明提供了制备多药脂质纳米颗粒的方法。该方面的方法包括：
在有机溶剂中溶解在25℃下log P大于1的第一小分子药剂、第一两亲性赋形剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂，以提供有机溶剂溶液，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；第二两亲性赋形剂包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域，其中所述有机溶剂包含与水可混溶的副组分；
在含水溶剂中溶解在25℃下log P小于0的第二小分子药剂，以提供含水溶剂溶液；
混合所述有机溶剂溶液和所述含水溶剂溶液以提供混合溶剂溶液；
从所述混合溶剂溶液去除混合溶剂以提供包含第一小分子药剂、第一两亲性赋形剂、第二两亲性赋形剂和第二小分子药剂的脱水产物；和
在水溶液中再水化所述脱水产物以提供具有多药脂质纳米颗粒的溶液。
另一方面，本发明提供了制备多药脂质纳米颗粒的方法。该方面的方法包括：
在包含比例为约20:1至约40:1(v/v)的有机组分和含水组分的可混溶溶剂中溶解：
在25℃下log P大于1的第一小分子药剂，
在25℃下log P小于0的第二小分子药剂，
第一两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质，和
第二两亲性赋形剂，其包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域，
去除可混溶溶剂以提供包含第一小分子药剂、第二小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂的脱水产物；
将所述脱水产物加热到高于所述两亲性赋形剂的凝胶至液相转变温度至少3℃的第一温度；和
在水溶液中再水化所述脱水产物，以提供含有多药脂质纳米颗粒的溶液。
本发明还包括通过本文公开的方法制备的任何多药脂质纳米颗粒。
另一方面，本发明提供了包含本文公开的多药脂质纳米颗粒的药物制剂。
另一方面，本发明提供了治疗感染HIV的受试者的方法，其包括给予有效量的本文公开的多药脂质纳米颗粒或制剂。
附图说明
由于本发明的上述方面和许多伴随的优点当结合附图时通过参考以下详细描述变得更好理解，因此其变得更容易理解，其中：
图1A和1B是用于制备用脂质赋形剂稳定的多药组合纳米颗粒的示例性方法的示意图。图1A是本文中称为“混合双溶剂”法的方法的实施方案的示意图。图1B是本文中称为“单一可混溶溶剂”法的方法的实施方案的示意图。
图2图示了阿扎那韦(ATV)和地瑞那韦(DRV)对脂质相变行为的影响。使用膜极性探针DPH，通过荧光各向异性监测抗HIV药物阿扎那韦(ATV：○)或地瑞那韦(DRV：□)对脂质相变行为的影响。以DPH各向异性数据相对于温度(℃)作图。没有药物的脂质混合物也被作为对照(△)评价。用材料和方法中描述的非线性回归模型拟合数据。估算代表每种脂质药物组合物和对照的相变温度(Tc)的中点。对照、ATV和DRV脂质混合物的估算的Tc分别为54.9、54.2和53.3℃。
图3A和3B图示了阿扎那韦和地瑞那韦从脂质药物纳米颗粒的浓度和时间依赖性释放。在25℃下监测5mM(●)，25mM(■)和200mM(▲)的阿扎那韦(图3A)和地瑞那韦(图3B)从脂质药物纳米颗粒的释放。数据表示为一式三份的样品的药物释放平均值±SD％。
图4图示了阿扎那韦从阿扎那韦脂质纳米颗粒(ATV-LNP)的pH依赖性释放。在25℃(○)和37℃(●)下测量暴露于指定pH后释放的ATV-LNP中的总阿扎那韦的百分比。每个pH和温度的数据表示为一式三份的样品的总阿扎那韦释放的平均值±SD％。
图5A-5F图示了给予抗HIV脂质纳米颗粒的两只灵长类动物的血药浓度的时程，所述抗HIV脂质纳米颗粒含有组合的三种药物，阿扎那韦(ATV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV)。皮下给予两只灵长类动物M11016(图5A、5C、5E)和M10088(图5B、5D、5F)含有ATV、RTV和TFV(分别为25、12.8、15.3mg/kg)的抗HIV脂质纳米颗粒。测定ATV(图5A、5B)、RTV(图5C、5D)和TFV(图5E、5F)在指定时间点的血浆药物浓度。
图6A-6F图示了洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(PMPA)在游离(图6A、6C、6E)或脂质纳米颗粒(图6B、图6D、图6F)制剂中以25mg/kg LPV、14.3mg/kg RTV和17.1mg/kg PMPA的标准化剂量皮下给予后随时间推移的血浆浓度。数据点代表单只动物(圆形，M10066；三角形，M10068；方形，R10142；菱形，Z11084；空心，游离药物；实心，LNP)。平均值小于10ng/ml的时间点带注释。*省略的异常值：动物M10068在8h的3285.76ng/ml。
图7A-图7C图示了洛匹那韦(LPV)(图7A)、利托那韦(RTV)(图7B)和替诺福韦(PMPA)(图7C)在游离(空心符号)或脂质纳米颗粒(实心符号)制剂中以25mg/kg LPV、14.3mg/kg RTV和17.1mg/kg PMPA的标准化剂量皮下给予后在外周血单核细胞(PBMC)中随时间推移的平均细胞内浓度。浓度以ng/ml(左y轴)和nmol/升(右y轴)表示。误差条显示平均值的标准误差(SEM)。对于游离药物，n＝4，除了在48h和120h时n＝2。对于抗HIV LNP，n＝3，除了在48h和120h时n＝1。*由于n＝1，在48h和120h时间点无法计算抗HIV LNP的SEM。
图8A至8C图示了由公开的单一可混溶溶剂法(图8A)和混合双溶剂法(图8B)以及典型脂质体(图8C)制备的多药脂质纳米颗粒的物理特征。图示的聚乙二醇化脂质在组装期间保留存在的亲水性药物，但在形成时排斥或抑制另外的药剂掺入形成的未搅拌的冠中。图8A中亲水性药物的这种高比率的紧密结合需要充分混合的药剂和赋形剂，并且在再水化之前完全脱水以形成药物脂质纳米颗粒。混合双溶剂法的使用(图8B)看来导致亲水性药剂相对松散的结合。因此，在蔗糖梯度离心的剪切力作用下，药物结合％相对于78-85％大幅度降低至约7-20％。典型的脂质体包封亲水性药物的能力低得多，并受到排斥或未搅拌的水(水合)壳的限制(图8C)。因此，亲水性药物如替诺福韦(TFV)的结合约为3-5％，该值与他人报道的具有类似脂质组成的那些值相似。
图9A-9C图示了在给予包含洛匹那韦(图9A)、利托那韦(图9B)和替诺福韦(图9C)(2:1:3的摩尔比)的多药脂质纳米颗粒之后，四只灵长类动物猕猴(M.nemestrina)中单个药物浓度的时程。进一步分析表明，血浆中超过90％的药物可归因于脂质药物颗粒结合的形式。相反，如前所述，在给予未配制的游离药物后，每种药物到24h时在血浆中降至可检测水平以下。
图10图示了在脂质药物颗粒中配制的三种药物洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV或PMPA)的分离。使脂质药物组合混合物经受5-20％蔗糖梯度离心以使三种药物的结合部分与游离部分分离。部分2-10用作结合部分，而部分11-14(顶部具有低蔗糖密度)用作游离部分。结果显示以下与脂质药物颗粒的结合％：洛匹那韦(LPV)＝81.8％；利托那韦(RTV)＝76％；替诺福韦(TFV或PMPA)＝75.5％。
详述
本发明提供了用于制备多药脂质稳定化的纳米颗粒的新的、简单的和临床上有用的方法。这种方法产生新的脂质纳米颗粒，其将具有不同结构特征的药物化合物掺入到单一递送载体中，导致所有结合的药物在体内不仅持续的而且提高的血浆和细胞内药物浓度。所公开的方法和所得到的多药脂质纳米颗粒组合物的使用通过在单一靶位点同时提供多种药物的缓释药代动力学分布来提供克服药物不足的潜力。对于抗病毒应用，所公开的方法和组合物可以克服组织中的残留感染，并且避免了针对单药方案发展耐药性的可能性。尽管迄今为止我们的研究已经关注抗HIV药物组合，但是本文公开的多种方法和组合物可以容易地应用于制备治疗癌症和其他疾病的多药治疗剂。
如以下实施例中更详细描述的，本发明人开发了新的方法来制备新的脂质纳米颗粒载体，其可以掺入高水平的具有普遍不同结构特征的小分子药剂，即亲水性和疏水性的不同药剂。所公开的方法可以应用于很多种小分子药物。因此，所得到的多药脂质纳米颗粒便于充当单一的载体，其可以使所有掺入的药物在受试者的血浆和组织中令人惊讶地形成高水平和延长的水平。此外，所公开的多药脂质纳米颗粒具有避免与带正电荷的脂质赋形剂相关的毒性问题(如上所述)的有益特征，并显示出显著稳定的储存特征。此外，组装多药脂质纳米颗粒的方法是可再现的、有效的、易于放大的，并且避免了昂贵的去除未掺入的药物组合物的需要，这对于制剂安全性通常是需要的。在抗HIV制剂的情况下，所述方法提供了允许组合相关组合制剂的新的组合物，所述相关组合制剂包括对于抗HIV cART方案而言关键的高水平的亲水性药剂。由所公开的多药脂质纳米颗粒提供的持续的血浆和淋巴组织药物水平能够降低用药频率，例如以数周的规模，以克服目前每日口服药物所见的不依从性问题。
对所公开的方法而言不可缺少的是本发明人成功设计和实施独特的溶剂方法，其允许在脂质纳米颗粒组装期间同时组合和混合亲水和疏水组分。用于形成脂质纳米颗粒的许多有机溶剂不可与水混溶，这些有机溶剂迄今为止在将亲水性药剂掺入脂质纳米颗粒中已经呈现出上述难题。然而，本发明人发现，将这种水不可混溶性有机溶剂与水可混溶有机溶剂，例如醇组合，能够额外掺入有限量的包含亲水性药剂的水溶液，同时保持基本单相。掺入水溶液及其组分的能力由水可混溶有机溶剂被水饱和的能力来提供，并且最终受其限制。得到的单相溶液实现多药脂质纳米颗粒的所有组分的完全混合，既有亲水性的又有疏水性的。脱水去除溶剂并迫使所有不同组分的紧密结合。该方法减少了源自脂质赋形剂的药物之间的物理排斥，不管是疏水性药物还是亲水性药物。紧密接触还克服了添加正电荷脂质赋形剂以增加药物与颗粒的结合的任何需要，并降低正电荷相关的毒性风险。随后使含水缓冲液中的组分的均匀混合物再水化，产生纳米级脂质颗粒，其引入比传统脂质体更高的总药物与脂质比，包括疏水性和亲水性药剂，同时没有有害的残留洗涤剂或溶剂。通过超声处理、挤压槽过滤器或机械方法，例如乳化器或微流化器对较大的颗粒进行尺寸减小，以形成最终均一的尺寸，例如20nm-100nm，以优化稳定性并避免体内清除。
一种示例性的方法在本文中被称为“混合双溶剂”法，如以下在实施例1-4中更详细地描述的。还参见示意性地示出示例性方法的图1A。在该方法中，将赋形剂(脂质或其它)和疏水性药剂溶于具有水可混溶组分和水不可混溶组分的有机溶剂中。亲水性药剂(多种亲水性药剂)另外在含水溶剂中混合。由于有机溶液因水可混溶有机组分而具有水饱和能力，有机溶液和水溶液混合在一起形成混合的双溶剂相。虽然可能产生低水平的初始乳液，但是混合双溶剂最终形成与多药脂质纳米颗粒完全混合的单相。通过干燥去除混合溶剂并再水化干燥的相之后，形成实际的多药脂质纳米颗粒。
在实施例5中描述了本文称为“单一可混溶溶剂”法的供选择的示例性方法。也参见图1B，其示意性地说明了示例性方法。在该供选择的方案中，提供单一可混溶溶剂，其包含与水不混溶有机组分、水可混溶有机组分和少量的含水组分。如上所述，保持可溶混(即，使水充分混合而没有相分离)的能力受到溶液中水的量以及水可混溶有机组分被水饱和的能力的限制。一旦形成，多药脂质纳米颗粒的所有组分就可以在相同的溶液中充分和彻底地混合。将溶剂完全去除以提供均匀且完全混合的干燥产物。将干燥产物在含水缓冲液中再水化以形成负载有高水平的亲水性和疏水性药剂二者的脂质纳米颗粒。
总的来说，这种新方法需要更少的步骤，是可放大的，得到高产率的具有高多种药物药物结合率的纳米颗粒，甚至显示疏水性或亲水性特征的极端差异的纳米颗粒。此外，最终产品是含水缓冲液，不含有害溶剂或带正电荷的赋形剂，适用于大多数药物应用。最后，不必需去除水溶性药物的未结合部分。最终，所公开的方法显著降低了由于多次过滤或溶剂去除而造成污染的风险，并进一步减少了去除未结合药物的昂贵损耗。
鉴于上述内容，一方面，本发明提供了多药脂质纳米颗粒。所述多药脂质纳米颗粒包含：在25℃下log P大于1的第一小分子药剂、在25℃下log P小于0的第二小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；第二两亲性赋形剂包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域。
如本文所述，所公开的多药脂质纳米颗粒可以有利地掺入亲水性和疏水性治疗剂二者，以提供用于特定组合的有效载体。疏水性/亲脂性或基本上不溶于水的药理活性剂可以是在含水或亲水性环境中具有有限溶解度的任何生物活性剂。例如，这些药剂在20-25℃下在水中的溶解度可以低于约5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02或0.01mg/mL。亲水性或基本上溶于水的药理活性剂可以是在含水或亲水性环境中具有高溶解度的任何生物活性剂。例如，这些药剂在20-25℃下在水中的溶解度可以大于约5、10、20、30、40、50、75、100或更多mg/mL。
适合作为掺入本发明的脂质纳米颗粒制剂中的候选治疗剂的亲水性和疏水性治疗剂的特征包括由其辛醇/水分配系数X log P定义的治疗剂(Wang等人,Chem.Inf.Comput.Sci.,1997,37,615-621，通过引用将其全部内容并入本文)。在本发明的实践中，log P大于1.0的治疗性小分子药剂是作为疏水性(或亲脂性)药剂掺入本发明的纳米颗粒中的优秀候选物。这样的抗HIV药剂的实例列于下表18中。因此，如本文所使用，术语“疏水性”、“亲脂性”和“基本上不溶于水的”是指辛醇/水分配系数log P大于1.0的治疗性小分子药剂。在一些实施方案中，有用的疏水性小分子药剂的log P大于约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5和6。在本发明的实践中，具有负log P的治疗性小分子药剂是作为疏水性(或亲脂性)药剂掺入本发明的纳米颗粒中的优秀候选物。这样的抗HIV药剂的实例列于下表19中。因此，如本文所使用的，术语“亲水性”和“基本上溶于水的”是指辛醇/水分配系数log P小于零的治疗性小分子药剂。在一些实施方案中，有用的疏水性小分子药剂的log P小于约-0.25、-0.5、-0.75、-1.0、-1.25、-1.5、-1.75、-2.0、-2.5、-3.0和-3.5。
在一些实施方案中，在约25℃下确定log P。
如本文所使用，术语“小分子药剂”是指分子量为约1500克/摩尔或更低的治疗性分子。例如，任何小分子药剂可具有约1500、1250、1000、900、800、700、600、500、400、300、200g/mol或更低的分子量。
示例性的抗HIV小分子药剂列于表18-21中，但应理解，所公开的纳米颗粒包括用于应对其它疾病、病症或感染的任何小分子。在一些实施方案中，第一小分子药剂选自利匹韦林(RPV)或其前药，依法韦仑(EFV)或其前药，度鲁特韦(DTG)或其前药，茚地那韦(IDV)或其前药，阿扎那韦(ATV)或其前药，利托那韦(RTV)或其前药，洛匹那韦(LPV)或其前药等。在一些实施方案中，第二小分子药剂选自替诺福韦(TNF)或其前药，恩曲他滨(FTC)或其前药，拉米夫定(3TC)或其前药，雷特格韦(RAL)或其前药，齐多夫定或其前药等。本领域普通技术人员可以容易地识别相关治疗性小分子药剂的前药。另外，本领域普通技术人员将容易地认识到，小分子药剂不受特定结构的限制，并且可以容易地确认用在实践所公开的脂质纳米颗粒和相关方法中的合格候选物。
在一些实施方案中，多药脂质纳米颗粒的总小分子药剂与赋形剂的摩尔比为至少1:10，所述总小分子药剂包括第一和第二小分子药剂，所述赋形剂包括第一和第二两亲性赋形剂。在一些实施方案中，总小分子药剂与总两亲性赋形剂的摩尔比为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3或更高。在一些实施方案中，总小分子药剂与总两亲性脂质赋形剂的摩尔比为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3或更高。在这方面，如本文更详细地描述的，由双混合溶剂法制备的多药脂质纳米颗粒的特征在于小分子药物与脂质赋形剂之比为约1:8至约1:3。由单一可混溶溶剂法制备的多药脂质纳米颗粒的特征在于小分子药物与脂质赋形剂之比为约1:3。这两个范围均表明比典型的脂质体制剂显著更高的药物掺入，所述典型的脂质体制剂的药物与脂质比不超过1:10，并且通常低得多。
所公开的多药脂质纳米颗粒可以包括由多药脂质纳米颗粒的预期用途确定的第一和第二小分子药剂的相对浓度的任何相关范围。为了说明，多药脂质纳米颗粒的第一小分子药剂与第二小分子药剂的摩尔比可以为约1:20至约20:1，如1:9、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1等。
所公开的多药脂质纳米颗粒通常将具有至少两种不同类型的两亲性赋形剂。第一两亲性赋形剂是包含小亲水性结构域的脂质分子。该类型通常提供脂质纳米颗粒的大部分结构。当处于含水环境中时，小亲水性结构域帮助多种脂质赋形剂定向成大体球形的结构。小亲水性结构域通常具有低于约300克/摩尔的分子量。在一些实施方案中，小亲水性结构域的分子量低于约275、250、225、200、175、150、125、100和75克/摩尔。
在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂可以选自以下类型：磷脂、鞘脂、胆固醇和类固醇衍生物、胆汁酸和衍生物、心磷脂、酰基甘油酯和衍生物、糖脂、酰基肽和脂肪酸。磷脂可以选自以下类型：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；二棕榈酰磷脂酰胆碱；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；二油酰磷脂酰胆碱；源自蛋、大豆、亚麻籽等的酯交换磷脂；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰甘油；磷脂酰丝氨酸；和磷脂酸。
在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂是脂肪酸或脂肪酸衍生物，如本领域中所理解的。在一些实施方案中，脂肪酸在中性pH下具有离子化的羧酸。
在一些实施方案中，磷脂选自1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)等。
在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂是硬脂酸或油酸，或包括硬脂酸或油酸。
在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂包含具有至少14个碳的至少第一脂肪酸尾部结构域。在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂还包含具有至少14个碳的第二脂肪酸尾部结构域。在一些实施方案中，至少第一脂肪酸尾部结构域和任选的第二脂肪酸尾部结构域包含14、16、18、20和22个碳原子。第一脂肪酸尾部结构域可以是完全饱和的(即，具有最大数量的氢并且没有碳-碳双键)或不饱和的(即，具有任意数量的碳-碳双键)。在一些实施方案中，第一脂肪酸尾部结构域具有一个碳-碳键或没有碳-碳键。在一些实施方案中，第一脂肪酸尾部结构域具有一个、两个、三个或更多个碳-碳双键。在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂包含至少第一脂肪酸尾部结构域和第二脂肪酸尾部结构域，其中第一和第二脂肪酸尾部结构域中的至少一个具有一个碳-碳双键或没有碳-碳双键。在一个实施方案中，第一两亲性赋形剂包含至少第一脂肪酸尾部结构域和第二脂肪酸尾部结构域，其中第一和第二脂肪酸尾部结构域二者具有一个碳-碳双键或没有碳-碳双键。在一个实施方案中，第一和第二脂肪酸尾部结构域中的至少一个没有碳-碳双键(即，是完全饱和的)。在一个实施方案中，第一和第二脂肪酸尾部结构域二者均没有碳-碳双键(即，是完全饱和的)。
第一两亲性赋形剂可以通过凝胶至液相转变温度来表征，所述凝胶至液相转变温度是赋形剂的聚集体(例如，纳米颗粒)开始解聚并转变为液体溶液时的温度。所公开的多药脂质纳米颗粒通常掺入凝胶至液相转变温度为至少37℃的第一两亲性赋形剂。在一些实施方案中，凝胶至液相转变温度超过40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃(或其中的任何中间温度)。在一些实施方案中，还可以确定脂质纳米颗粒的组合的赋形剂的凝胶至液相转变温度(即，还至少包括对第二两亲性赋形剂的特性和量的考虑)。
第二两亲性赋形剂相对于第一两亲性赋形剂包含大亲水性结构域。由于第二两亲性赋形剂整合到脂质纳米颗粒中，大亲水性结构域通常延伸超过疏水性组分(例如，主要为脂质区域)进入颗粒外空间。疏水性结构域的结构可以是非常易变的，因此不限制所公开的纳米颗粒的范围。这些结构产生冠区域，如图8A和8B所示出的，其产生结构保护(refuge)区以使亲水性小分子药剂稳定结合于纳米颗粒。第二赋形剂的小亲水性结构域通常具有大于约500克/摩尔的分子量。在一些实施方案中，大亲水性结构域的分子量大于约500、750、1000、1500、2000、2500、3000、5000、7500、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或更多克/摩尔(或其中的任何中间分子量)。具有特定亲水性结构域的赋形剂的选择可以通过旨在向亲水性小分子药剂提供的结构保护的量(其还可以受到第二赋形剂的相对量的影响)获知。
在一些实施方案中，第一两亲性赋形剂可以选自以下类型：糖蛋白、糖脂、含聚环氧烷的聚合物和含聚环氧烷的脂质。在一些实施方案中，含聚环氧烷的脂质选自以下类型：含聚氧乙烯的脂质和含聚氧丙烯的脂质。在一些实施方案中，含聚氧乙烯的脂质是聚乙二醇官能化的磷脂，其中聚乙二醇的数均分子量为约500至约20,000g/mol，如500、750、1000、1500、2000、2500、3000、5000、7500、10,000、15,000、20,000g/mol(或其中的任何中间分子量)。在一些另外的实施方案中，聚乙二醇官能化的磷脂为N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(mPEG-2000-DSPE)。
在一些实施方案中，含聚环氧烷的脂质是包含具有至少14个碳的至少第一脂肪酸尾部结构域的磷脂。磷脂还可以包含也具有至少14个碳的第二脂肪酸尾部结构域。就具有14个或更多个碳和/或饱和的或包含碳-碳双键的第一和第二脂肪酸尾部的实施方案而言，以上关于第一两亲性赋形剂的实施方案的讨论等同地适用于第二两亲性赋形剂的磷脂的脂肪酸尾部(多个脂肪酸尾部)，并且此处不再重复以避免进一步的重复。
所公开的多药脂质纳米颗粒通常具有与第二赋形剂分子相比更多数量的第一限定的脂质赋形剂分子。例如，多药脂质纳米颗粒的第一两亲性赋形剂与第二两亲性赋形剂的摩尔比为约2:1至约20:1或更高，如2:1、5:1、7:1、10:1、13:1、15:1、18:1或20:1或更高(或其中包括的任何中间比例)。例如，如在以下实施例中所述的，稳定的多药脂质纳米颗粒以高水平的药物结合装配，其第一两亲性赋形剂与第二两亲性赋形剂的摩尔比(即DSPC:DSPE-mPEG2000之比)为约4:1和9:1。
得到的多药脂质纳米颗粒基本上是球形的，意味着从表面上的不同点通过中心点到相对侧的直径的测量值将不会变化超过50％或更少，并且优选将不会变化超过25％或更少。在一些实施方案中，多药脂质纳米颗粒的直径(或如果采取多次测量，则为平均直径)为约20nm至约200nm。在一些实施方案中，多药脂质纳米颗粒的直径或平均直径为约20nm至约150nm、约20nm至约125nm、约20nm至约100nm、约30nm至约90nm、约40nm至约60nm，或其中包括的任何中间直径或直径范围。
如上所述，多药脂质纳米颗粒具有围绕至少部分由第一两亲性赋形剂的亲水性结构域形成的外表面的冠。冠由第二两亲性赋形剂的亲水性结构域形成，其提供其中可以在装配和脱水步骤中稳定地捕获亲水性小分子药剂的结构。冠是亲水性的，因为水和其他亲水性分子可以驻留在冠中。然而，由于结构限制，一旦形成，就难以从外部含水环境进入亲水冠区域。因此，第二两亲性赋形剂的亲水性结构域可以阻止分子进入亲水冠。在一些实施方案中，当在等渗缓冲液(例如，生理张力)中并且在生理pH和25℃下观察时，亲水冠具有约2nm至约15nm的厚度。在一些实施方案中，冠具有约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15nm的厚度。可以通过选择第二脂质赋形剂上的亲水性结构域获得或设计该冠厚度。
多药脂质纳米颗粒不是脂质体。脂质体通过具有两亲性脂质的层状双层来定义。
在一些实施方案中，多药脂质纳米颗粒没有固体芯。这样的固体芯例如可以包括金属微粒等，其涂覆有脂质等。
如本文所述，根据本发明制备并包括在本发明中的多药脂质纳米颗粒具有增强的性质，包括稳定性和不同小分子药剂的令人惊讶的高结合率。因此，在一些实施方案中，多药脂质纳米颗粒的特征在于，有至少约70％，如70％、75％、80％、85％或更多的第一小分子药剂(多种第一小分子药剂)在pH 7.4和25℃下在24小时后保持与纳米颗粒结合。在一些实施方案中，多药脂质纳米颗粒的特征在于，有至少7％，如约7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多的第二小分子药剂(多种第二小分子药剂)在pH 7.4和25℃下在24小时后保持与纳米颗粒结合。如以下更详细地描述的，脂质纳米孔装配的方法可以影响得到的脂质纳米颗粒的结构，从而影响保留结合的亲水性(即，第二)小分子药剂的能力。在这方面，由单一可混溶溶剂法制备的纳米颗粒可以保留约75％或更多的在装配过程期间使用的亲水性药物(参见表21)，并且公开的脂质纳米颗粒在长期储存期间相当稳定。在一些实施方案中，至少约70％，如约75％、80％、85％或更多的组合的第一和第二小分子药剂在pH 7.4和4℃下在8个月后保持与纳米颗粒结合。在一些实施方案中，至少约60％，如70％、75％、80％或更多的组合的第一和第二小分子药剂在pH 7.4和4℃下在8个月后保持与多药脂质纳米颗粒结合。
在一些实施方案中，当纳米颗粒经受蔗糖梯度测试时，至少70％，如约75％、80％、85％或更多的小分子药剂保持与纳米颗粒结合。在一些实施方案中，当纳米颗粒经受蔗糖梯度测试时，至少70％，如约75％、80％、85％或更多的第二(即，亲水性)小分子药剂保持与纳米颗粒结合。确定该特征的蔗糖梯度测试描述在实施例5中。简言之，蔗糖梯度测试包括使多药脂质纳米颗粒经受连续的5％-20％的蔗糖梯度，并施加200,000g的离心力4小时。未结合的小分子分离并漂在密度较低的部分，而结合的小分子药剂与稳定的脂质纳米颗粒沉淀在密度更大的梯度中。可以定量并从而比较未结合的和结合的小分子试剂的相对量。
如下文所述，因为随着pH降低，结合的小分子药剂的量越来越多地从脂质纳米颗粒释放，多药脂质纳米颗粒可以显示pH响应性。因此，例如，主要在通过细胞内吞作用摄取脂质纳米颗粒并暴露于细胞溶酶体囊泡内降低的pH时递送药品是有利的。这保留了比例高得多的用于递送到实际预期的靶点的给予的药物，而不是仅提供初步的全身性高峰，然后立即清除。
在一些实施方案中，在给予哺乳动物受试者后，与给予哺乳动物受试者相同量的游离小分子药剂相比，公开的多药脂质纳米颗粒赋予第一小分子药剂和第二小分子药剂延长的血药浓度。例如，在给予有效影响疾病或感染的状态的量时，第一小分子药剂和第二小分子药剂的量在血浆或淋巴组织中保持可检测达超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的时间段。这与当以游离形式(即，未与脂质纳米颗粒制剂结合)给予时第一小分子药剂和第二小分子药剂的存在相反，该存在通常在一或两天内降至可检测的水平以下。
如本文所述，在血浆和淋巴组织中的延长的存在有利于维持病原体或其他疾病靶点暴露于小分子治疗剂。此外，将多种小分子药剂组合到单一稳定载体中确保两种(或所有)治疗剂与其预期靶点同时相互作用，并具有相关的有效水平以促进有效的多药联合治疗，如cART。因此，相对于游离形式或其中各自配制在分开的递送载体中的形式的小分子药剂的效能/功效，公开的多药脂质纳米颗粒增强或提高了掺入其中的小分子药剂的功效和/或效能。
应理解的是，公开的多药脂质纳米颗粒还可以包括增强或引导功能的任何相关的组分。例如，常规掺入可检测的标记用以提供成像功能在本领域技术人员的技能范围内。此外，多药脂质纳米颗粒还可以包括靶向分子，如受体、凝集素、抗体和功能性片段或其衍生物。例如，对于抗体，这可以包括单链抗体(例如，单链可变片段(scFv)、单链Fab片段(scFab)、VHH片段、VNAR或纳米抗体)、双特异性抗体、Fab片段或F(ab)2片段)。这些可以促进结合的小分子治疗剂定向递送至具有被靶向分子特异性识别的独特抗原的所关注的靶点。此外，多药脂质纳米颗粒还可以包括其他结合配偶体(例如，生物素、链霉亲和素)以帮助与其他功能结构结合或连接。可以使用本领域熟知的技术，将这样的示例性的另外的组分整合或结合到公开的脂质纳米颗粒。
另一方面，本发明提供了包含本文公开的多药脂质纳米颗粒的药物组合物。药物组合物可以包括如本领域理解的药学上可接受的含水载体。
另一方面，本发明提供了包含本文公开的多药脂质纳米颗粒的药物组合物。然而，在该方面中，多药脂质纳米颗粒以干燥形式，如粉末提供，其可以在给予前用无菌盐缓冲液重构。干燥粉末形式的实施方案包括在25℃下log P大于1的第一小分子药剂、在25℃下logP小于0的第二小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；第二两亲性赋形剂包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域。
又一方面，本发明提供了包含本文公开的制剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还包含重构缓冲液和指导重构和给予过程的书面标记。
另一方面，本发明提供了制备多药脂质纳米颗粒的方法。该方面的方法在本文中也指混合双溶剂法。该方法包括在有机溶剂中溶解在25℃下log P大于1的第一小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；第二两亲性赋形剂包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域，以提供有机溶剂溶液。所述方法还包括在含水溶剂中溶解在25℃下log P小于0的第二小分子药剂，以提供含水溶剂溶液。将有机溶剂溶液和含水溶剂溶液混合以提供混合溶剂溶液。接下来，从混合溶剂溶液除去混合溶剂以提供包含第一小分子药剂、第一两亲性赋形剂、第二两亲性赋形剂和第二小分子药剂的脱水产物。使脱水产物在水溶液中再水化，以提供含有多药脂质纳米颗粒的溶液。
有机溶剂包含与水可混溶的副组分。在一些实施方案中，有机溶剂包含与水不可混溶的另一种副组分。混溶是指与水或另一种水溶液混合而不形成乳液(即，相分离)的能力。当其存在时，水可混溶性通常受到溶液中包含的水的量的限制。因此，本领域普通技术人员将容易地理解，必须限制混合溶液中的含水溶剂的相对量。
在一些实施方案中，有机溶剂溶液和含水溶剂溶液以至少约20:1(v/v)的比例混合。在一些实施方案中，有机溶剂溶液和含水溶剂溶液以至少约20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、35:1、40:1、60:1或更高(v/v)的比例(或其中包括的任何中间比例)混合。
已知一般与水可混溶的有机溶剂是已知的，并且包括乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二噁英、乙醇、甲醇、丙醇(和其他醇)和四氢呋喃。在一个实施方案中，有机溶剂的水可混溶的副组分为醇。在另外的实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、己醇和癸醇。在另一个实施方案中，有机溶剂的水可混溶的副组分为乙腈。
在一些实施方案中，有机溶剂由水可混溶的副组分组成。然而，在其他实施方案中，有机溶剂还包含水不可混溶的副组分。在这个意义上，在分离时，该副组分不会与水或水溶液混合而不形成分离的相。然而，仅在与上述水可混溶组分共混时，该水不可混溶组分可以在单相中与水或水溶液组合。已知通常与水不可混溶的有机溶剂是已知的，并且包括苯、丁醇、四氯化碳、氯仿、环己烷、环戊烷、二氯乙烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、二乙醚、庚烷、己烷、甲基乙基酮、辛烷、戊烷、二丙醚、四氯乙烷、甲苯、三氯乙烷和二甲苯。在一些实施方案中，水不可混溶的副组分选自氯仿、己烷、癸烷、二氯甲烷及其组合。
在一些实施方案中，水不可混溶的副组分为氯仿，并且水可混溶的副组分为醇，如甲醇、乙醇、丙醇、己醇和癸醇中的任一种。
在一些实施方案中，有机溶剂的水不可混溶的副组分与水可混溶的副组分的比例(v/v)为约1:1至约4:1。在一些实施方案中，比例为约7:5(即，1.4:1)至约4:1。在一些实施方案中，比例为约2:1至约3:1。在以下更详细地描述的一个实施方案中，对于氯仿与醇，有机溶剂的水不可混溶的副组分与水可混溶的副组分的比例(v/v)为65:35(即，13:7)。
含水溶剂可以是在其中溶解选择的亲水性小分子的任何合适的溶剂。实例包括含有NaHCO3、磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸或其组合的含水溶剂，但不必如此限制。
可以使用蒸发从混合溶剂溶液去除混合的有机和含水溶剂，如通过施加真空干燥促进的真空来促进。其他干燥或去除溶剂的技术是已知的，并涵盖在公开的方法中。在一些实施方案中，脱水产物基本是干燥的，其中痕量水平(例如，低于原始体积的3％)的溶剂保留。在一些实施方案中，脱水产物完全或几乎完全干燥。
在方法的一些实施方案中，脱水产物在至少高于两亲性赋形剂的凝胶至液相温度约3℃的温度下在水溶液中再水化。如上所述，凝胶至液相温度是赋形剂的聚集体(例如纳米颗粒)开始解聚并转变成液体溶液时的温度。可以通过第一两亲性赋形剂的结构特性确定凝胶至液相转变温度，或供选择地通过脂质纳米颗粒的组合的赋形剂(即，至少包括对两亲性赋形剂的特性和量的考虑)确定凝胶至液相转变温度。在一些实施方案中，脱水产物在至少高于两亲性赋形剂(多种两亲性赋形剂)的凝胶至液相温度约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃或更多的温度(或其中包括的任何中间温度)下在水溶液中再水化。在一些实施方案中，根据使用的赋形剂，方法包括在混合过程中使水溶液的温度保持在至少40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或更高(或其中包括的任何中间温度)。
在一些实施方案中，混合溶剂相的小分子药剂与赋形剂的摩尔比为至少约1:10。在一些实施方案中，得到的多药脂质纳米颗粒的小分子药剂与赋形剂的摩尔比为至少约1:10。公开的多药脂质纳米颗粒的上述其他特征适用于通过该公开方法制备的多药脂质纳米颗粒。
另一方面，本发明提供了制备多药脂质纳米颗粒的方法。该方面的方法在本文中也称为单一可溶混溶剂法。该方法包括在可混溶溶剂中溶解以下：在25℃下log P大于1的第一小分子药剂、在25℃下log P小于0的第二小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质，第二两亲性赋形剂包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域。去除可混溶溶剂以提供包含第一小分子药剂、第二小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂的脱水产物。将脱水产物加热到高于两亲性赋形剂的凝胶至液相转变温度至少3℃的第一温度。在水溶液中再水化脱水产物，以提供含有多药脂质纳米颗粒的溶液。
在一些实施方案中，可混溶溶剂包含比例为约20:1至约40:1(v/v)，如约20:1、22:1、25:1、27:1、30:1、32:1、35:1、37:1和40:1(或其中包括的任何中间比例)的有机组分和含水组分。在一些实施方案中，可混溶溶剂的有机组分包括与水可混溶的副组分。在另外的实施方案中，可混溶溶剂的有机组分还包括与水不可混溶的副组分。以上关于水可混溶和水不可混溶的副组分的描述，以及其在有机溶剂中的相对比例适用于该方面的有机副组分以及其在可混溶溶剂的有机组分中的比例，此处不再赘述。
在一些实施方案中，水不可混溶的副组分为氯仿，并且水可混溶的副组分为醇，如甲醇、乙醇、丙醇、己醇和癸醇中的任一种。
以上对含水溶剂的描述适用于可混溶溶剂的含水副组分，此处不再赘述。
在一些实施方案中，去除可混溶溶剂包括蒸发、减压干燥、喷雾干燥或其组合。其他用于干燥或去除溶剂的技术是已知的并且被公开的方法涵盖。在一些实施方案中，脱水产物基本上是干燥的，其中痕量水平(例如，低于原始体积的3％)的溶剂保留。在一些实施方案中，脱水产物完全或几乎完全干燥。
在一些实施方案中，第一温度至少高于两亲性赋形剂(多种两亲性赋形剂)的凝胶至液相温度约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃或更高(或其中包括的任何中间温度)。
在一些实施方案中，水溶液在再水化步骤期间保持在至少第一温度。如所示的，第一温度高于两亲性赋形剂(多种两亲性赋形剂)的凝胶至液相温度至少约3℃。在一些实施方案中，根据使用的赋形剂，方法包括在混合过程中使脱水产物和/或水溶液的温度保持在至少40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或更高(或其中包括的任何中间温度)。在一个实施方案中，再水化步骤包括逐渐在约第一温度下组合脱水产物和水溶液，并且使完全组合的脱水产物和水溶液保持在第二温度下至少约1小时，所述第二温度为至少第一温度。
得到的多药脂质纳米颗粒的小分子药剂与赋形剂的平均摩尔比可以为至少约1:5，如约1:4、1:3或更高。在另一个实施方案中，至少约70％的第一小分子药剂和至少约70％的第一小分子药剂在中性pH下与得到的多药脂质纳米颗粒稳定结合。公开的多药脂质纳米颗粒的上述其他特征适用于通过该公开的方法制备的多药脂质纳米颗粒。
此外，以上公开的方法方面还可以包括另外的特征或者由另外的特征表征。
在一些实施方案中，方法还包括搅拌包含多药脂质纳米颗粒的水溶液，以降低多药脂质纳米颗粒的尺寸。搅拌步骤可以包括应用超声处理，通过一种或多种滤器挤出，或机械或水力剪切破碎。该搅拌步骤可以产生多药脂质纳米颗粒，其中按数量计至少90％的脂质纳米颗粒具有约20nm至约200nm的直径。因此，平均直径可以为约20nm至约150nm、约20nm至约125nm、约20nm至约100nm、约30nm至约90nm、约40nm至约60nm或其中包括的任何中间直径或直径范围。
在本发明的其他方面或部分中描述的关于多药脂质纳米颗粒的结构和功能方面，例如，关于冠、组分第一小分子、组分第二小分子、组分第一两亲性赋形剂、第二两亲性赋形剂及其各自的log P值和亲水性结构域、组分部分(例如，小分子药剂和赋形剂)的相对比例等，适用于通过该方法制备的多药脂质纳米颗粒，此处不再赘述。
另一方面，本发明包括通过公开的方法制备的任何多药脂质纳米颗粒。
如下所述，本发明人证实了制备多药脂质纳米颗粒的装配方法的效用和功效，所述多药脂质纳米颗粒掺入了经批准用于抗HIV感染的亲水性和疏水性小分子药剂。因此，另一方面，本发明提供了治疗感染HIV的受试者的方法，包括给予有效量的本文公开的多药脂质纳米颗粒或给予有效量的本文公开的药物组合物。如本文所述，术语“治疗”是指减缓、降低或防止病毒复制和/或改善与病毒感染相关的症状。
给予可以是针对可能带有HIV的任何哺乳动物。可以通过提供多药脂质纳米颗粒的全身递送的任何合适途径给予，例如皮下(SC)、静脉内(IV)或肌内(IM)。
在一些实施方案中，病毒载量在受试者的淋巴组织中可检测地降低。在一些实施方案中，在给予哺乳动物受试者后，与给予哺乳动物受试者相同量的游离小分子药剂相比，公开的多药脂质纳米颗粒赋予第一小分子药剂和第二小分子药剂延长的血浆药物浓度。例如，在给予有效影响疾病或感染的状态的量时，第一小分子药剂和第二小分子药剂的量在血浆或淋巴组织中保持可检测超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的时间段。
如本文所述，在血浆和淋巴组织中的延长的存在有利于维持病毒暴露于小分子治疗剂。此外，多种小分子药剂组合到单一、稳定载体中确保两种(或所有)治疗剂与其预期靶点同时相互作用，并具有相关的有效水平以促进有效的多药联合治疗，如cART。因此，相对于游离形式或各自配制在分开的递送载体中的形式的小分子药剂的效能/功效，公开的多药脂质纳米颗粒增强或提高了掺入其中的小分子药剂的功效和/或效能。
本发明还包括通过掺入适合的多种靶向不同的影响指定疾病或感染性病原体的机制的小分子药剂(例如，如所描述的组合亲水性和疏水性小分子药剂)来治疗其他疾病和感染的方法。
除非在本文中具体定义，否则本文使用的所有术语具有与其对于本发明的领域的技术人员而言相同的含义。本文引用的出版物及其引用的主题具体地通过引用整体在此并入。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代供选择的方案或者供选择的方案是相互排斥的，但本发明支持仅涉及供选择的方案的定义以及“和/或”。
根据存在已久的专利法，除非特别指出，否则在权利要求书或说明书中与词语“包括”一起使用时，词语“一个(a)”和“一个(an)”表示一个或多个。
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本发明公开了可用于公开的方法和组合物、可以与公开的方法和组合物一起使用、可以用于制备公开的方法和组合物或者是公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。应该理解的是，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，即使没有明确公开对这些化合物中的每一个和每种单一组合和排列的具体提及，也可以具体考虑各种个体和集体组合。这个概念适用于发明的所有方面，包括但不限于所描述的方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的特定要素可以被组合或被其他实施方案中的要素替代。例如，如果存在可以进行的各种另外的步骤，则可以理解的是，这些另外的步骤中的每一个可以利用公开的方法的任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且特别考虑每个这样的组合或组合的子集，并应被认为是公开的。此外，可以理解的是，可以使用任何适合的材料来实施本文所述的实施方案，例如在本文其他地方描述的或本领域已知的材料。
实施例
以下实施例旨在说明但不限制所公开的发明。
实施例1
该实施例描述了对阿扎那韦和地瑞那韦与脂质的相互作用的评价，以开发pH-响应性抗-HIV药物组合纳米颗粒。
摘要
我们评价了两种人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制剂，阿扎那韦(ATV)和地瑞那韦(DRV)的pH依赖性溶解度、脂质结合和药物从脂质纳米颗粒(LNP)的释放。阿扎那韦和地瑞那韦均以接近100％的效率掺入由聚乙二醇化和非聚乙二醇化的磷脂构成的脂质纳米颗粒中，但仅有阿扎那韦脂质纳米颗粒形成了稳定的脂质-药物颗粒，并显示pH-依赖性药物释放。地瑞那韦脂质纳米颗粒是不稳定的，并且在低药物-脂质浓度下形成混合的胶团(micelle)，因此不适用于脂质-药物颗粒开发。当使用代谢和细胞膜输出抑制剂利托那韦(RTV)以及HIV逆转录酶抑制剂替诺福韦(TFV)制备阿扎那韦脂质纳米颗粒时，制备出稳定的、可放大的和可再现的抗-HIV药物组合脂质纳米颗粒。对于阿扎那韦、利托那韦和替诺福韦分别实现了85.5±8.2、85.1±7.1和6.1±0.8％的药物掺入效率。使用皮下给予的这些pH响应性抗HIV药物组合脂质纳米颗粒的初步灵长类动物药代动力学研究得到了可检测的血浆浓度，其对于所有三种药物均持续7天。这些抗HIV脂质纳米颗粒可以作为长效靶向抗逆转录病毒治疗开发。
引言
于20世纪90年代后期引入并且针对多种病毒蛋白的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)清除血液中的人类免疫缺陷病毒(HIV)，并实现了HIV感染患者的生活质量和预期寿命的显著改善。尽管口服HAART治疗对于从血液中清除HIV非常有效，但即使采用高药物剂量，残余的病毒仍然存在于淋巴结和其他淋巴组织中。我们之前描述过，在口服抗HIV药物茚地那韦的HIV感染患者中，淋巴结的单核细胞中的细胞内药物浓度显示的水平为在血液单核细胞中发现的水平的三分之一。这些数据最近在12名HIV感染患者的前瞻性临床研究中得到证实，其中发现两种HIV药物(阿扎那韦，ATV和地瑞那韦，DRV)的淋巴结细胞内药物水平比在血液中细胞内的药物水平低多达99％。淋巴结中这些较低的细胞内药物水平与患者中的残余病毒相关。
我们先前系统地开发了pH敏感性茚地那韦脂质纳米颗粒，并且证明当皮下给予时它们优先定位在淋巴结和淋巴组织中。在感染HIV的灵长类动物中，我们报道了这些脂质-茚地那韦复合物提高了整个身体淋巴结中的茚地那韦浓度，药物水平达到比血浆高22.7倍。这些研究显示显著的血浆病毒载量降低和CD4+T细胞下降的逆转。在用游离药物治疗的对照灵长类动物中未观察到淋巴结药物积累或临床影响方面的增强。
然而，对于临床转化而言，抗HIV药物的组合—而不仅仅是茚地那韦单一疗法—对于解决潜在的耐药性是必要的。最近的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)治疗指南推荐了许多药物组合，其中大多数包括至少两种或三种不同的抗HIV药物。在HAART中使用的蛋白酶抑制剂中，目前许多较新的抗HIV药物可用，其表现出10-100倍的高抗病毒效能和较低的耐药率。ATV和DRV是通常与另一种蛋白酶抑制剂利托那韦(RTV)和逆转录酶抑制剂替诺福韦(TFV)联合使用的新一代蛋白酶抑制剂。
因此，本研究的目的是在膜结合、掺入程度、稳定性和药物的pH依赖性释放方面表征新的蛋白酶抑制剂ATV和DRV的脂质-药物相互作用。这些研究为开发pH响应性抗HIV药物组合脂质纳米颗粒提供了基础，所述抗HIV药物组合脂质纳米颗粒由聚乙二醇聚合物修饰的脂质和磷脂混合物组成，其是稳定的，并且可以以高蛋白酶抑制剂掺入效率放大用于灵长类动物研究。我们的结果表明，ATV和DRV二者都与脂质结合并主要掺入脂质膜中，但是只有ATV-脂质纳米颗粒(ATV-LNP)是稳定的并且显示pH敏感性。因此，含ATV的纳米颗粒适合含有ATV、RTV和TFV的抗HIV药物组合脂质纳米颗粒的进一步开发。
材料和方法
材料
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)2000](DSPE-mPEG2000)(均为GMP级)购自GenzymePharmaceuticals(纯度>99％；Cambridge,MA)。阿扎那韦(C38H52N6O7，ATV)、地瑞那韦(C27H37N3O7S，DRV)、利托那韦(C37H48N6O5S2，RTV)和替诺福韦(C9H14N5O4P，TFV)参比标准由国家卫生研究院(NIH)AIDS研究和参比试剂项目提供。之后的一些样品购自Waterstonetech LLC(Carmel,IN)并使用参比化合物验证。环庚米特购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)获得自Invitrogen(Eugene,OR)。其他试剂为分析级或更高级。
阿扎那韦和地瑞那韦在辛醇和缓冲液中的分配系数的确定
在室温下的辛醇-缓冲液药物分配系数通过Dittert LW等人.Phase SolubilityTechnique in Studying the Formation of Complex Salts of Triamterene.Journalof pharmaceutical sciences.1964；53:1325–1328描述的小规模摇瓶法测定。简言之，pH3、5和7.4的磷酸盐-缓冲盐(PBS)用作水相。将0.2mg/mL的ATV或DRV溶于辛醇，添加到等体积的PBS，并涡旋10min。在14,000rpm(18,078g)下离心混合物(Beckman CoulterTM 18离心机，Beckman Coulter Inc.,Brea,CA)，以分离辛醇和水相。用高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)测定在两相中的药物浓度。分配系数计算为辛醇相中的药物浓度与水相中的药物浓度之比。在每个pH下使用一式三份的样品。
脂质-药物纳米颗粒制备
如之前在以下文献中所述制备脂质-药物纳米颗粒：Kinman L等人.Optimizationof lipid-indinavir complexes for localization in lymphoid tissues of HIV-infected macaques.J Acquir Immune Defic Syndr.2006；42(2):155–161；Choi SU等人.pH-dependent interactions of indinavir and lipids in nanoparticles and theirability to entrap a solute.Journal of pharmaceutical sciences.2008；97(2):931–943；和Endsley AN和Ho RJ.Design and characterization of novel peptide-coatedlipid nanoparticles for targeting anti-HIV drug to CD4 expressing cells.TheAAPS journal.2012；14(2):225–235，通过引用将每篇的全部内容引入本文。简言之，将DSPC和DSPE-mPEG2000脂质(8:2，mol/mol)和ATV、DRV和RTV溶解在玻璃管中的氯仿中，然后在氮气下干燥直到形成均匀的脂质-药物膜。通过真空干燥去除残留溶剂过夜。随后使用含有20mM碳酸氢钠的0.9％NaCl(pH 7.4)再水化干燥的脂质-药物膜。使脂质-药物样品在60℃下水化2h。然后对样品进行超声处理(实验室规模)或均质化(临床前规模)，以获得均匀的悬浮液。
对于脂质纳米颗粒的小规模制备，使用浴式超声仪(Polar LipidsInc.,Alabaster,AL)超声处理200μL样品直至样品透明。对于大规模制备，使用在5,000-6,000psi下运行的Avestin EmulsiFlex-C5(Avestin Inc.,Ottawa Ontario,Canada)使45mL水化的脂质-药物混合物均质化15个循环。使用VAPROTM5520蒸汽压渗透压计(Wescor Inc.,Logan,UT)测量最终制剂的重量克分子渗透压浓度。脂质-药物纳米颗粒和脂质体对照样品储存在4-8℃下。
药物掺入效率
使用透析法确定掺入脂质-药物纳米颗粒中的ATV、DRV、RTV和TFV的百分比。简言之，将脂质-药物纳米颗粒制剂的50μL等分试样转移到透析膜中(MW截留值＝6,000-8,000；Spectra/6,Spectrum Laboratories Inc.,Rancho Dominguez,CA)，并在1,000mL pH7.4的缓冲液中透析以使游离药物与掺入纳米颗粒的药物分离。掺入效率计算为掺入的药物的量与负载的药物的总量之比乘以100％。
颗粒尺寸分析
使用NICOMPTM380ZLS仪器(NICOMP Particle Sizing Systems,Santa Barbara,CA)，通过光子相关光谱法(PCS)确定脂质-药物纳米颗粒和脂质体对照的平均颗粒尺寸。在盐水缓冲液中将脂质纳米颗粒制剂稀释至0.25mM，用于尺寸测量(0.4mL最终体积)，并使用5mW HeNe激光(λ＝632.8nm)在90°角下评价。使用相同的缓冲液将样品稀释至相同的最终体积，以分析浓度作用。基于强度-重量NICOMP尺寸分布分析光散射数据，并表示为平均值±SD。
测量膜流动性的荧光各向异性研究
为了评价由于药物插入脂质膜而引起的膜流动性的变化，使用0.1％的1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)作为膜内探针18,20。简言之，为了将DPH掺入脂质膜中，将2μL的2mMDPH的四氢呋喃溶液添加到含有或不含药物的脂质纳米颗粒悬浮液中。将最终制剂在60℃下(高于55℃—DSPC相转变温度)孵育30分钟，然后在15分钟内缓慢冷却至室温。将含有DPH的(药物负载的和空的)脂质纳米颗粒添加到加热到45℃的比色皿，然后以1-2℃的增量逐渐升高到65℃。使用连接到循环水浴(PolyScience，型号1162,Niles,IL)的水套式比色皿架控制比色皿内的温度，通过数字温度计测量该温度。在每次读取温度之前，使比色皿平衡10min。用设置为λex/em＝360/430nm的F-4500荧光光谱仪(Hitachi,Minato-ku,Tokyo,Japan)连续测量平行和垂直于发射光的荧光强度；激发和发射狭缝均为5nm。荧光各向异性响应r由以下公式计算：
其中IVV和IVH是用取向平行和垂直于激发光束的偏振面的偏振器记录的荧光强度。
使用SigmaPlot软件(11.0版，Systat Software,Inc.,San Jose,CA)，通过非线性回归生成荧光各向异性响应相对于温度的曲线。相转变温度的中点(Tc)基于以下公式估算：
其中y是荧光各向异性，x代表温度(℃)，min是最小响应，max是最大响应，Tc是最小参数和最大参数正中间的温度值，并且Hillslope是Tc处的斜率。
药物从脂质-药物纳米颗粒的释放的确定
使用类似于上述的透析法确定药物从脂质-药物纳米颗粒的时间和pH-依赖性释放。简言之，将脂质-药物纳米颗粒制剂的50μL等分试样转移到透析膜中(MW截留值＝6,000-8,000；Spectra/6,Spectrum Laboratories Inc.,Rancho Dominguez,CA)，并在1,000mL pH 3、4、5、6或7.4的缓冲液中透析以评价pH-依赖性药物释放，并使游离药物与掺入纳米颗粒的药物分离。通过HPLC/MS/MS(以下描述的方法)确定初始和最终药物浓度以估算药物释放的百分比。
抗HIV药物组合脂质纳米颗粒在灵长类动物中的血浆时程
根据华盛顿国家灵长类动物研究中心(the Washington National PrimateResearch Center)指南，猕猴(豚尾猴(Macaca nemestrina)，雄性，2.9-5.0kg)用于药代动力学研究。所有的动物程序均在华盛顿大学机构动物保护和使用委员会(the Universityof Washington Institutional Animal Care and Use Committee)审查的批准方案下进行。
对两只年轻的成年雄性猕猴进行脂质纳米颗粒的单次20mL皮下注射，所述脂质纳米颗粒包含ATV、RTV和TFV的组合，剂量为25mg/kg ATV(35μmol/kg)、12.8mg/kg RTV(18μmol/kg)和15.3mg/kg TFV(53μmol/kg)。在0、0.5、1、3、5、8、24、48、120和168小时(7天)从股静脉收集静脉血样品。通过以1,200rpm(252g)(Jouan CR 312离心机，Jouan Inc.，Winchester，VA)离心10分钟立即从血液分离2mL血浆。一式两份提取血浆中的ATV、RTV和TFV，并用与洛匹那韦(LPV)、RTV和TFV类似的经过验证的反相HPLC/MS/MS方法，用液相色谱-质谱测试进行分析。Koehn J和Ho RJ.A Novel LC/MS/MS Method for SimultaneousDetection of anti-HIV Drugs Lopinavir,Ritonavir and Tenofovir inPlasma.Antimicrobial agents and chemotherapy.2014。
在接近给药后168h的时程期间采用线性梯形法计算ATV、RTV和TFV的血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)。根据报道的ATV、RTV和TFV血浆半衰期(产品标签)，以及我们在给予这些药物的灵长类动物的初步数据(数据未显示)，ATV、RTV和TFV大多在8小时后从血液清除。因此，为了描绘游离药物与脂质结合的药物相比的影响，我们分析了三个连续时间段的AUC：0-8小时、8-168小时和0-168小时。
通过HPLC/MS/MS分析多种抗-HIV药物
缓冲液和血浆中的所有药物都使用能够分析ATV、DRV、LPV、RTV和TFV的经过验证的HPLC/MS/MS分析方法分析。LPV、RTV和TFV的一步分析是以前发表的。Koehn J和Ho RJ.ANovel LC/MS/MS Method for Simultaneous Detection of anti-HIV Drugs Lopinavir,Ritonavir and Tenofovir in Plasma.Antimicrobial agents and chemotherapy.2014。简言之，HPLC系统配备有Shimadzu 20AD HPLC(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.,Pleasanton,CA)。在反相SynergiTM柱(100×2.0mm2；4μm POLAR-RP ,PhenomenexInc.,Torrance,CA)上分离ATV、RTV和TFV，并且使用四极串联质谱仪MS/MS(AB SCIEX 3200,Framingham,MA)检测。以50ng/mL的终浓度将内标环庚酰胺的等分试样添加到血浆样品。将5μL样品(含有内标)注射到柱上，并以0.35mL/min的流速用包含乙腈和含0.1％乙酸的水的流动相以3-100％的梯度洗脱。使用多反应监测(MRM)检测从特定前体离子到产物离子的转变离子。使用以下m/z转变检测分析物：对于ATV为705.5/168.2，对于DRV为548.3/392.3，对于RTV为721.3/296.1，对于TFV为288.1/176，以及对于环庚米特为238.1/193.2。
统计分析
当分析对照和测试样品时，使用student t检验。为了确定具有不同脂质-药物浓度的多个组的差异，使用方差分析(ANOVA)。小于0.05的p值被认为是统计学显著的。
结果
阿扎那韦和地瑞那韦及其形成脂质纳米颗粒的能力的表征
除了亲脂性以外，药物在不同pH下的离子化程度可以在药物结合(associate)或结合(bind)到脂质的能力中起到重要作用。许多预测工具可用于估算药物亲脂性，其作为在中性pH下的辛醇-水分配系数的对数值(Log P)，通常表示为XLog P。然而，ATV和DRV的XLog P不能应对变化的pH的影响。因此，我们在pH 3、5和7.4下评价了ATV和DRV的这些值，并将其表示为Log D(辛醇-缓冲液分配系数)估算值。如表1所示，虽然ATV和DRV在pH 3下具有相似的Log D值—3.40相对于2.98—但仅ATV而不是DRV显示pH-依赖性Log D值。ATV的Log D随着pH升高而升高，在pH 5下具有4.66的值，在pH 7.4下具有5.77的值。对于DRV，pH5和7.4的Log D值分别为2.80和2.84；没有检测到Log D显著的pH-依赖性变化。相比之下，ATV和DRV的预测的XLogP3-AA值分别为5.6和2.9，与上述观察的pH 7.4的Log D值一致。总的来说，这些数据表明，虽然ATV和DRV都是亲脂性的(在中性pH下Log D为～3或更高)，但仅有ATV显示Log D随着pH升高逐渐升高。
表1.阿扎那韦和地瑞那韦的分子结构和pH-依赖性疏水性
a如材料和方法中所述，测量每个pH值的分配系数log D，并以一式三份的平均值±SD表示。
b理论估算值来自PubChem数据库(参考：网址pubchem.ncbi.nlm.nij.gov andsioc-ccbg.ac.cn/software/xlogp3)。
c通过ChemAxon估算的药物库数据(ATV的网址drugbank.ca/drugs/DB01072；DRV的网址drugbank.ca/drugs/DB01264)。
为了确定两种疏水性药物ATV和DRV掺入脂质中的程度和方式是否有差异，将每种化合物与脂质一起溶解在由氯仿组成的有机溶剂中。在去除溶剂和在缓冲液中水化之后，接着是颗粒尺寸减小，评估不同浓度下的药物掺入效率、颗粒尺寸和颗粒尺寸稳定性。为了保持脂质组成恒定，我们使用由DSPC和DSPE-mPEG2000(8:2，mol/mol)组成的脂质。已经显示该组合物是生物相容的并且证明对于抗HIV药物掺入和细胞摄取有效。我们发现在混合物中不存在脂质的情况下，ATV和DRV都形成沉淀，并且不能形成药物悬浮液。当ATV和DRV与脂质混合时，没有观察到药物沉淀，这能够确定药物掺入脂质纳米颗粒中。如表2所示，我们发现，在测试的所有脂质与药物摩尔比(5:1、8:1和20:1)中，ATV和DRV几乎完全掺入脂质-药物纳米颗粒中。无论脂质与药物的摩尔比如何，ATV掺入效率几乎为100％(范围为96.2-97.4％)，而DRV掺入效率表现出随着药物密度的增加而下降。与脂质与药物摩尔比为20:1时的掺入效率相比，DRV在脂质与药物摩尔比为5:1和8:1时显示8.5-6.3％的较低掺入效率(脂质与药物摩尔比为20:1时为96.6％，8:1时为94.4％，并且5:1时为88.1％)。
表2：脂质与药物比对药物掺入脂质-药物纳米颗粒的程度和颗粒尺寸的影响
a如材料和方法中所述，制备具有不同脂质与药物摩尔比的包含ATV或DRV的脂质-药物纳米颗粒。
b药物掺入效率是基于去除游离、未掺入的药物后与颗粒结合的药物百分比确定的；数据表示为4次重复的平均值±SD。
c脂质-药物颗粒直径使用PCS确定，并且数据表示为4次重复的平均值±SD。
接下来我们确定了不同的脂质与药物摩尔比对这些脂质-药物纳米颗粒的尺寸(直径)的影响。如表2所示，随着脂质与药物摩尔比的增加，DRV-脂质纳米颗粒(DRV-LNP)的尺寸没有显著变化。所有DRV-LNP的尺寸均为约33.6-35.6nm，并且该值与无药物的对照脂质纳米颗粒(d～35.4±4.4nm)非常相似(p>0.05)。相比之下，随着药物密度的增加(或脂质与药物比的降低)，ATV-LNP的直径从34.6±3.1nm增加到68.2±7.1nm(p<0.01；表2)。
总之，这些数据表明，ATV，但不是DRV，表现出pH依赖性疏水性。虽然ATV和DRV二者几乎可以完全掺入由DSPC和DSPE-mPEG2000组成的脂质纳米颗粒中，但仅有DRV而不是ATV的掺入效率随着药物密度的增加而下降。基于这些数据，我们将ATV和DRV的脂质与药物摩尔比固定为8:1，以在随后的研究中评估这两种药物在不同浓度下如何影响膜流动性和稳定性。
阿扎那韦和地瑞那韦对膜流动性的影响：脂质-药物相互作用的测量
为了表征药物与脂质之间的相互作用以及药物对膜流动性的影响，我们使用DPH作为荧光偏振探针。作为平面疏水性荧光分子，插入到磷脂双分子层的疏水结构域内的DPH对由DPH极化程度和荧光强度的变化表示的相行为的变化是敏感的。DPH已成功应用于多个报道中，以研究具有荧光各向异性的膜双分子层的秩序。如果药物被结合并掺入脂质内，应该检测到药物引起的脂质膜无序的变化。因此，我们监测了作为温度的函数的含有和不含药物的DSPC和DSPE-mPEG2000脂质膜中DPH的荧光各向异性。图2显示随着温度升高，对照脂质纳米颗粒和具有ATV或DRV的脂质纳米颗粒(以8:1脂质与药物摩尔比)的荧光各向异性。还描绘了相转变温度(Tc)的中点。
如图2所示，与不含药物的脂质对照相比，将DRV掺入脂质双分子层中降低了DPH在脂质纳米颗粒中的极化。相反，掺入ATV显示对膜秩序的影响较小，因为荧光各向异性值与脂质对照的相似。然而，ATV和DRV都使相转变温度降低至不同程度。在8:1的固定的脂质与药物摩尔比的情况下，DRV使Tc降低1.6℃，而ATV使Tc仅降低0.7℃(对于对照LNP、ATV-LNP和DRV-LNP，Tc分别为54.9、54.2、53.3℃；图2)。没有药物的对照LNP的54.9℃ Tc值与报道的DSPC的55℃ Tc类似。总的来说，这些数据表明，ATV和DRV都可以结合并掺入到脂质双层中，改变膜流动性并降低相转变温度。
阿扎那韦和地瑞那韦与脂质结合的稳定性以及对脂质-药物纳米颗粒的浓度依赖性影响
尽管ATV和DRV与脂质结合并影响脂质结构行为，但是这种结合相互作用的稳定性对于开发稳定的脂质-药物纳米颗粒制剂是重要的。为了应对这个问题，在确定时间依赖性药物释放曲线之前，我们首先测试了不同浓度下的颗粒尺寸稳定性。
我们最初的数据表明，ATV可以稳定地结合到脂质双分子层中，而DRV结合有些不稳定。如果药物分子不能稳定地与脂质结合，不溶性药物分子可能引起颗粒聚集，当药物沉淀时与脂质分离，或者重新组成更小的颗粒，如混合胶团或胶团。在形成ATV-LNP和DRV-LNP后，我们没有检测到任何药物沉淀，这在相同条件下在生理缓冲液中采用ATV和DRV的游离药物通常是观察不到的。由于混合胶团或胶团结构的形成是浓度依赖性的并且在低脂质-药物浓度下变得明显，因此连续稀释含有ATV或DRV的脂质纳米颗粒连同对照纳米颗粒(无药物)，并且通过PCS监测它们的直径的变化。最初的脂质浓度对于制剂是相同的(200mM)，并且将它们稀释到一系列0.01-10mM之间的浓度。如表3所示，脂质-药物纳米颗粒的稀释对ATV-LNP的流体动力学直径没有显著影响。然而，对于DRV-LNP，随着脂质-药物浓度的降低，颗粒直径表现出逐渐变小(表3)。当DRV-LNP的浓度低于1mM时，颗粒直径从最初的33.9±3.8nm下降到8.9-14.3nm(p<0.01)。这些颗粒的较小直径处于混合胶团和胶团的范围内。相比之下，ATV-LNP的直径没有因稀释而改变。正如所预期的，稀释对无药物的对照脂质纳米颗粒(脂质体)的直径没有影响(表3)。
表3：浓度对脂质-药物纳米颗粒的表观尺寸的影响a
a如材料和方法中所述，制备具有具有固定的脂质与药物摩尔比(8:1)的含有ATV或DRV的脂质药物纳米颗粒或对照(无药物)。
b通过PCS测量指定浓度和稀释度下的颗粒的表观尺寸，并将颗粒直径表示为4次重复的平均值±SD。
通过制备不同初始浓度的DRV-LNP进一步证实了对DRV-LNP的浓度依赖性影响，以确定药物掺入效率。我们发现在5和0.5mM脂质的情况下的DRV的药物掺入效率分别为95％和58％，与之相比，ATV分别为96％和97％。
接下来，作为稳定性研究的一部分，我们确定了药物从ATV-LNP和DRV-LNP释放的时程。对5、25和200mM脂质-药物制剂进行这些药物释放研究，并评估在pH7.4下在24小时后药物释放的百分比。在该时间段，我们没有发现任何可观的药物部分从ATV-LNP释放(图3A)。相比之下，对于DRV-LNP，在5和25mM稀释度下几乎100％的DRV释放，并且在200mM制剂中检测到53％的药物释放。DRV-LNP的不稳定性到4小时也是明显的，此时分别从5、25和200mM DRV-LNP释放65.21％、42.14％和29.99％的DRV(图3B)。
总之，这些数据表明，尽管DRV和ATV在掺入脂质纳米颗粒中的能力同等有效，但是只有ATV在脂质双层中的整合产生了不易稀释或快速药物释放的稳定结构。DRV-LNP不太稳定，并且药物释放速率和颗粒尺寸减小经历浓度依赖性增加。因此，对于随后的实验，我们使用ATV-LNP进行pH依赖性药物释放表征，以及构建用于制剂放大和初级灵长类动物研究的组合药物颗粒。
阿扎那韦从脂质纳米颗粒的pH-依赖性释放
由于ATV表现出pH依赖性的亲脂性，因此我们确定了pH的变化是否可以诱导药物从ATV-LNP释放。为此，我们将ATV-LNP暴露于不同pH的缓冲液，并测量ATV从脂质-药物纳米颗粒释放的分数。如图4所示，在37℃下，在使ATV-LNP暴露于逐渐降低的pH值下24小时后，在这些条件下，约21.3-26.2％的ATV分子从ATV-LNP释放。当pH降至3时，几乎所有ATV分子在24小时内释放。这种行为也非常类似于在25℃下的pH依赖性ATV释放(图4)。总的来说，这些数据表明ATV从ATV-LNP释放取决于pH和在一定程度上取决于温度。
抗-HIV药物组合脂质纳米颗粒的开发和放大制备
由于上述脂质药物相互作用研究表明，ATV(而不是DRV)-脂质相互作用产生稳定的ATV-LNP，因此选择ATV来开发抗HIV药物组合纳米颗粒。按照目前最佳降低病毒抗性潜力的临床指南，除了ATV外，这种抗HIV药物组合还包括ATV代谢抑制剂/加强剂RTV，加上逆转录酶抑制剂TFV。由于替诺福韦(TFV)作为逆转录酶抑制剂的已被证实的效力，并且因为其作为磷酸化的活性代谢物在细胞内保留以用于持续应答，因此选择替诺福韦(TFV)。因此，我们制备了三种不同的包含ATV、ATV+RTV或ATV+RTV+TFV的实验室规模(0.2mL)的脂质纳米颗粒制剂，并评价它们的掺入效率和物理特征。如表4所示，将RTV或RTV+TFV添加到ATV-脂质纳米颗粒中并不改变～100％的ATV掺入效率。我们还发现，在那些条件下，RTV掺入效率几乎同样是100％(表4)。作为水溶性药物，TFV掺入效率为约2.4％，并且批次之间可重现。将所有三种药物包含在脂质纳米颗粒中对物理特征没有任何影响，因为颗粒直径(d＝56-62nm)未检测到显著变化(表4)。在初步实验中，我们比较了ATV与ATV+RTV脂质纳米颗粒产生pH依赖性药物释放的能力。我们发现ATV和RTV的pH依赖性释放非常类似于ATV-LNP的pH依赖性释放。因此，我们以更大体积制备了这些抗HIV药物组合脂质纳米颗粒(ATV+RTV+TFVLNP)，用于初步灵长类动物药代动力学研究(如下所述)。如表4所示，在无菌条件下制备的放大制剂(～45mL)也提供了与实验室规模制剂(～0.2mL)相当的颗粒尺寸、pH和重量克分子渗透压浓度。该临床前规模提供了几乎完全的ATV和RTV掺入以及以可重现的方式提供了约6％的一致的TFV掺入。因此，将这些含有ATV、RTV和TFV(2:1:3摩尔比)药物组合的抗HIVLNP用于灵长类动物研究，而不进行制剂中未结合(约93.9％游离)的TFV的去除。
表4：以中试规模或用于灵长类动物研究的临床前规模制备的包含抗-HIV药物的脂质纳米颗粒的表征
a如材料和方法中所述，制备配制在脂质纳米颗粒中的药物。对于中试(0.2mL)和临床前(45mL)规模二者，将三种药物组合ATV+RTV+TFV(2:1:3(mol/mol))用作比较。在中试规模下，还以脂质与药物比8:1(mol/mol)制备含有ATV或ATV+RTV的脂质纳米颗粒。
b掺入效率如表2中所述测定。
c脂质-药物纳米颗粒的颗粒直径用PCS测量，并且表示为平均值±SD。
d脂质-药物纳米颗粒的重量克分子渗透压浓度如材料和方法中所述监测，并且表示为平均值±SD。
抗-HIV药物组合脂质纳米颗粒在灵长类动物中的血浆时程
为了评价ATV、RTV和TFV的血浆时程，在初步研究中使用了两只灵长类动物。皮下给予它们单剂量的含有25mg/kg ATV、12.8mg/kg RTV和15.3mg/kg TFV的抗HIV药物组合脂质纳米颗粒。监测血浆药物浓度7天(参见图5A-5F)。如图5A-5F所示，在接受抗HIV LNP的两只猕猴中，血浆药物浓度在7天(168小时)内持续在可检测的水平。两只动物均检测到血浆TFV浓度时程曲线中的两个主峰。8小时后TFV的第一个峰值出现下降(图5E和5F)，随后是更显著和持续的血浆TFV水平。持续的血浆TFV水平是出人意料的，因为这种抗HIV制剂仅提供了6.1％的脂质结合的TFV(93.9％为游离可溶形式)。对于RTV和ATV来说，这个转折点看起来不那么突出且更可变(图5A-5D)。然而，在由三种药物组合组成的抗HIV LNP单次皮下给药7天后，在血浆中可清楚地检测到ATV和RTV二者。
我们通过计算每种药物的血浆药物浓度AUC来进一步分析血浆药物浓度的时程，以确定血浆药物暴露随时间的变化。我们采用皮下给予灵长类动物在溶液或悬浮液中的蛋白酶抑制剂如茚地那韦、LPV和RTV以及各自产品标签中报道的血浆半衰期的经验已经表明到4-5小时血浆药物浓度预期会降低到低于检测限，到8小时溶液中的TFV预期会降低到低于检测限。因此，我们分析了早期(0-8小时)和晚期(8-168小时)时程的AUC。虽然两种动物之间存在一些变化，但清楚的是，在皮下给予抗HIV脂质纳米颗粒后，对于所有三种药物，包括TFV，早期(0-8h)AUC低于总AUC(0-168h)的20％。由于抗HIV LNP含有93.9％(仅6.1％与LNP结合)的游离TFV，因此低至2.6％的TFV的早期AUC0-8h分数是出人意料的。事实上，大部分TFV暴露(AUC分数)在AUC8-168h后期发现。无论如何，这些数据表明，抗HIV LNP在灵长类动物中为三种药物ATV、RTV和TFV提供了持续的血浆药物水平，并且在血浆中的早期药物暴露低于单次皮下给药后持续超过168小时或7天的总药物暴露的20％。
讨论
虽然包括蛋白酶抑制剂如茚地那韦、LPV、RTV、ATV和DRV在内的许多口服抗HIV药物组合的临床使用已经成功地将血浆HIV降低到检测限以下，但是大多数口服药物治疗需要至少一次或更多次的每日给药。多种液体和固体口服制剂的单次或多次每日给药通常面临依从性难题，特别是在HIV传播率高的物质滥用和高危人群中。因此，医疗团体迫切需要开发每周一次的抗HIV组合药物方案，其克服口服剂型的每日给药要求，特别是对于具有依从性(例如药物滥用人群)或实用性(无法吞咽或胃肠不适)问题的患者。利用ATV和DRV的疏水性以及它们与脂质结合和相互作用的能力，我们开发了含有这两种药物之一(ATZ)的脂质纳米颗粒，并且表征了脂质-药物相互作用的稳定性。我们发现ATV，而不是DRV与脂质稳定结合，使得能够开发由ATV、RTV和TFV(一种亲水性逆转录酶抑制剂)组成的抗HIV药物组合脂质纳米颗粒。考虑到目前的临床HAART推荐，选择了这种药物组合，赋予其更大的临床潜力。我们使用简单的放大工艺制备这些组合纳米颗粒，这些工艺产生了适用于在灵长类动物中研究的临床前规模的可重现的特征。
之前采用HIV蛋白酶抑制剂茚地那韦的研究表明，该化合物完全与脂质结合。另外的优化研究表明，具有C18脂肪酰基链的磷脂酰胆碱脂质(DSPC和聚乙二醇化脂质DSPE-mPEG2000)在灵长类动物皮下给予时在淋巴组织中提供稳定的药物掺入和药物积累。这些报告还显示，脂质-药物纳米颗粒中的完全药物结合有助于药物定位于整个身体的淋巴结中，并在血浆中产生持续的药物水平的能力。在该报告中，我们使用相同的脂质组合物来证明在中性pH下均表现出高度的亲脂性的两种有效的HIV蛋白酶抑制剂ATV和DRV能够以高密度结合于脂质(多达每5个脂质分子1个药物分子)。我们能够制备直径为33.6-68.2nm的脂质纳米颗粒，其显示接近100％的ATV或DRV掺入效率(表2)。ATV和DRV的脂质插入在每种药物降低脂质相转变温度的能力和在不同程度上降低脂质-药物纳米颗粒结构内脂质分子组织的秩序方面是明显的。药物对脂质填充的影响作为膜偏振探针DPH的各向异性行为的降低是可检测到(图2)。尽管ATV和DRV二者表现出影响脂质膜的有序状态，但是DRV表现出具有比ATV更高的影响，作为脂质相转变温度的更强的抑制被检测到(图2)。另外，浓度依赖性研究表明，只有DRV-LNP而不是ATV-LNP的表观尺寸(直径)受到稀释的影响。只有DRV-LNP颗粒尺寸显著减小到混合胶团的尺寸范围。这些数据表明DRV但不是ATV诱导LNP在稀释时采取胶团样行为(表3)。相反，当脂质浓度降低时，掺入ATV的脂质纳米颗粒的直径没有显著变化，表明它们形成稳定的脂质-药物纳米颗粒。该浓度依赖性尺寸行为与以ATV-LNP观察到的药物释放速率比DRV-LNP的低得多相一致，并且ATV-LNP的释放速率也表现出是不依赖于浓度的(图3A和3B)。
虽然DRV和ATV插入脂质膜的确切机制或程度不清楚，但从pH依赖性分配系数数据明显看出，只有ATV表现出亲脂性的pH依赖性变化。当pH从3升高到7.4时，ATV的pH特异性亲脂性的测量值Log D从3.40升高到5.77，而对于相同的pH范围内，DRV的Log D保持相对不变(2.80-2.98)(表1)。与DRV相比，ATV的更高的Log P值可能部分地促成了ATV-LNP的更稳定的结合(表2-3和图3A和3B)。此外，ATV的pH依赖性亲脂性可能与ATV在pH 3-7.4之间从脂质-药物纳米颗粒pH依赖性解离的能力有关(图4)。此外，溶质的pKa可以影响药物从脂质-药物纳米颗粒的pH-依赖性释放的程度(degree)和范围(extent)。作为在酸性条件下化学上稳定的化合物，当pH低于pKa(酸性)时，化合物将被质子化，溶解性会增加。pH 3的环境比ATV的pKa 4.42低(酸性，表1)，这就是在pH 3时约98.1％的ATV从ATV-LNP释放的原因。对于DRV，pH 3-7.4都高于其pKa 2.39(酸性，表1)。在这种条件下，DRV将被去质子化，使其更疏水并且不能经历pH依赖性释放。因此，整合到脂质纳米颗粒中的ATV可被淋巴结和淋巴组织中的细胞内化，随后在pH分别降至5.5和4的核内体和溶酶体中释放。pH敏感性药物结合和从纳米颗粒解离对于改善游离药物分子向淋巴结和淋巴组织的细胞内递送将是有用的。在这些胞内酸性细胞器内，可使游离或未结合的药物用于增强抗蛋白酶活性和抗HIV作用。这些和其他的可能性需要进一步的研究，然而，该研究超出了本报告的范围。
ATV结合和插入脂质膜中的稳定性以及对脂质-药物相互作用的详细了解，使我们能够开发出含有两种其他临床使用的抗HIV药物RTV和TFV的制剂。RTV是代谢和输出抑制剂，通常与其他蛋白酶抑制剂如ATV组合使用以降低其清除率。随着ATV和RTV几乎完全和可再现地掺入脂质纳米颗粒中(表4)，放大过程大大简化，不需要去除游离蛋白酶抑制剂。因此，可以避免浪费和潜在的成本过高的纯化过程。例如，去除聚合物颗粒中的游离人生长激素(hGH)的要求被证明是成本过高的，并认为是在美国获得上市的注册审批后停止生产持续释放hGH的关键原因。在本报告中描述的将ATV和RTV几乎完全掺入脂质中可被认为是这些脂质-药物纳米颗粒的重要特征，其实现灵长类动物中的持续药物水平超过口服或皮下给予可溶性和悬浮制剂所达到的水平。
目前的临床指南建议开具抑制病毒耐药性的至少两种组合的药物或抑制两种HIV靶点的药物组合，如蛋白酶抑制剂和逆转录酶。因此，我们选择了经证实的逆转录酶抑制剂TFV，其在细胞内磷酸化并随后保留较长时间，以掺入包含ATV和RTV的脂质-药物纳米颗粒中。然而，由于高水溶性(低亲脂性)，我们发现低的但一致且可重现的约6％的TFV掺入度。因此，我们继续在含有93.9％的“游离”可溶形式的TFV的脂质-药物纳米颗粒中用这三种药物ATV、RTV和TFV进行灵长类动物研究。可溶性ATV、RTV或TFV的给予已经显示灵长类动物中的血浆药物水平通常在8小时内降低至检测水平以下，并且在24小时时药物在血浆中是不可检测的。当同样的三种药物被一起配制到脂质-药物纳米颗粒中时，我们发现在7天后两种灵长类动物的血浆中仍然可以检测到所有三种药物。虽然预期ATV和RTV将提供持续但低的水平，但是令我们惊讶的是，仅有6.1％结合于颗粒(93.9％的游离形式)的水溶性TFV还表现出高程度的血浆药物暴露，其超过游离药物释放时期期间可获得的血浆药物暴露。人们将预期早期时间点(0-8小时)的TFV的AUC比率应当高于较晚的时间点，因为93.9％的TFV作为游离药物存在。将推测游离药物从皮下空间直接吸收到血液中，或者容易地渗透通过淋巴结，并迅速出现在血液中。因此，人们将预期在早期时间点(0-8小时)血浆药物浓度高，AUC比率高。然而，我们发现0-8小时在血浆中仅可检测到TFV的2.6％的药物暴露(AUC0-8h)，而8-168小时可检测到97.4％的药物暴露(表5)。这些数据表明，TFV(与制剂中的ATV和RTV组合)可以与抗HIV LNP相互作用，具有尚待定义的机制，导致血浆中延长的TFV存留。虽然所观察到的相互作用的确切机制和血浆TFV时程延长值得进一步研究，但是目前的数据指出三联ATV+RTV+TFV LNP每周一次给药以在血浆中提供足够的抗病毒水平的可能性。
表5：皮下给予具有不同掺入效率的含有三种药物的抗HIV纳米颗粒的灵长类动物的早期(0-8h)与晚期(8-168h)血浆药物暴露的对比分析
a在指定的时间跨度(0-8h、8-168h和0-168h)内的两只灵长类动物(M11016和M10088)的平均AUC，单位为ng·h/mL。
b将早期(0-8h)和晚期(8-168h)的AUC分数与0-168h总血浆暴露进行比较。数据表示为每种药物的AUC％。
如果需要，血浆药物水平可以随着剂量的增加或相同剂量频率的增加而升高。正在计划并将需要更多动物的详细药代动力学研究来阐明预测的药代动力学参数，用于限定提供最佳抗病毒血浆浓度所必需的剂量和频率。但是，这样的研究超出了本报告的范围。
总之，我们已经证明两种蛋白酶抑制剂ATV和DRV可以几乎完全掺入脂质纳米颗粒中。然而，只有ATV，而不是DRV，与脂质稳定结合，并实现抗-HIV药物组合脂质纳米颗粒的开发。可以无菌地制备含有ATV、RTV和TFV的三联抗HIV LNP，并按比例调节以制备适合灵长类动物皮下给予的一致的颗粒尺寸、pH和重量克分子渗透压浓度特征。这些抗HIV药物组合脂质纳米颗粒提供了所有三种药物超过7天的持续血浆药物水平，即使对于亲水性药物TFV也是如此。基于初步的灵长类动物血浆浓度-时间数据，每周一次给予含有ATV、RTV和TFV的抗HIV纳米颗粒是可行的。
实施例2
该实施例描述了另外的多药脂质纳米颗粒的设计和表征，其提供了长效三药联合抗HIV纳米颗粒，增强了灵长类动物血浆和淋巴结和血液内细胞的药物暴露。
淋巴结中的HIV药物水平不足与病毒存留有关。为了克服淋巴药物不足，我们开发并在灵长类动物中评估了含有洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦的脂质-药物纳米颗粒。与游离药物相比，这些纳米颗粒在淋巴结中产生高50倍以上的细胞内洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦浓度。血液中的血浆和细胞内药物水平在单次皮下给药后增强并持续7天，超过用目前口服治疗可达到的水平。
联合抗逆转录病毒疗法(cART)可以清除血液中的HIV；然而，残余的病毒仍然处于淋巴结中。口服cART在淋巴组织中产生比在血浆中更低的药物浓度，这与淋巴结中存留的病毒和在治疗停止时的病毒反弹有关。药物纳米颗粒具有克服淋巴药物不足的潜力。我们之前开发并在灵长类动物中证明了含有茚地那韦(IDV)的脂质纳米颗粒(LNP)在所有分析的淋巴结中增强了药物水平。此外，LNP中的IDV增强了外周血单核细胞(PBMC)中的细胞内药物浓度，延长了血浆停留时间，逆转了CD4+T细胞衰退，并抑制了血浆和淋巴结二者中的病毒RNA。基于采用IDV-LNP的发现，我们已经开发了含有两种蛋白酶抑制剂洛匹那韦(LPV)和利托那韦(RTV)和逆转录酶抑制剂替诺福韦(TFV)的抗HIV LNP，用于向血液和淋巴中的HIV宿主细胞同时递送三联药物。选择LPV和RTV是因为它们的稳定性和与LNP的强疏水性相互作用。利托那韦通过代谢和药物转运蛋白相互作用增强LPV的功效。包含TFV提供了进一步抑制耐药潜力的抗病毒作用的第二靶标，并且磷酸化的TFV的细胞内保留延长了抗病毒活性。
我们评价了用于灵长类动物研究的优化的抗HIV LNP的特征。无菌制备的抗HIVLNP分别显示94、91和12％的LPV、RTV和TFV掺入，平均直径为52nm。纳入明确限定的未结合药物部分用于体内研究。以固定的LPV:RTV:TFV 1:1:0.5摩尔比评价的抗HIV-1的抗病毒效力显示，与可溶形式的药物相比，抗HIV LNP的效力增加至少三倍(LNP形式的LPV、RTV和TFV的EC50为30±0.8、30±0.8、15±0.1nmol/l，相比之下，游离形式的为98±0.3、98±0.3、49±0.2nmol/l)。
用抗-HPV LNP形式的LPV、RTV和TFV(25.0、14.3和17.1mg/kg)皮下给药的灵长类动物在7天(168小时)内表现出升高的LPV和RTV的血浆浓度。相比之下，游离药物联合给药后血浆药物水平到24h时下降到接近或低于检测限。由LNP制剂提供的LPV、RTV和TFV的总药物暴露[曲线下面积(AUC)]增加分别为18、14和7倍(配对t检验P＝<0.05、0.07和0.173)(表6)。还比较分析了早期(0-8h)与晚期药物暴露(8-168h)的AUC。用游离药物处理的灵长类动物在前8小时内显示92％的总TFV暴露，而用抗HIV LNP处理的灵长类动物在前8小时内仅显示9.1％，其余部分在8-168小时(表6)。
细胞内药物积累是抗病毒作用的关键。在用抗HIV LNP处理的灵长类动物中检测到PBMC中持续的LPV、RTV和TFV超过7天，而游离药物的那些到48h时降至接近或低于检测限(表6)。使用抗HIV LNP与游离药物之比(LNP/游离比)来比较两个测试组之间的PBMC药物浓度。在5h以外的所有时间点，这个比值大于1，而在稍后的时间点大于20(表6)。对于TFV，只有12％的LNP结合，在早期时间点，血液PBMC中的LNP/游离比小于1；然而到8h，这个值增加到50以上。抗HIV LNP也增加了淋巴结单核细胞(LNMC)中的细胞内药物浓度。在24h时从腹股沟淋巴结分离的LNMC显示在用游离药物组合处理的动物中没有检测到LPV并且仅检测到低水平的RTV，而用抗HIV LNP处理的那些显示高50倍以上的细胞内浓度(表6)。对于TFV而言，在LNP结合有限的情况下，LNP/游离比较低，记录为0.7；然而，两组猕猴之间的差异没有统计学显著性(P＝1.0)。
表6.抗HIV脂质纳米颗粒a对外周血单核细胞和腹股沟淋巴结中的洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦的细胞内水平以及血浆中的总药物暴露b的影响。
腹股沟淋巴结的单核细胞中的细胞内药物浓度(ng/106个单核细胞)e
LNP，脂质纳米颗粒。NA，不可用。
a由1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺钠盐(MPEG-2000-DSPE)、洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦(TFV)组成的抗-HIVLNP通过如先前公开的薄膜水化法制备。所有药物都用脂质膜干燥，在碳酸氢盐缓冲盐水中再水化，并在无菌条件下通过高压均质化减小尺寸以产生具有平均52nm直径的药物-脂质纳米颗粒。使用生物相容性溶剂和表面活性剂在碳酸氢盐缓冲盐水中制备游离的药物悬浮液制剂以悬浮高度疏水性药物。
b在交叉研究中，以25mg/kg LPV、14.3mg/kg RTV和17.1mg/kg替诺福韦(TFV)的标准化剂量皮下给予四只灵长类动物(豚尾猴)抗HIV LNP和游离药物。所有实验均在经批准的机构动物保护和使用委员会(IACUC)方案下进行。在指定的时间点在7天内收集血液和淋巴结，并使用经验证的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)公布的分析法测定药物浓度。数据表示为平均值±SD。用于比较分析的比值以粗体显示。
c LNP/游离比是平均抗HIV LNP药物浓度除以平均游离药物浓度。在药物水平低于检测限的情况下，将该数字作为“0.01”来计算比值。
d通过密度梯度法从全血中分离PBMC，并分析各200万个PBMC的细胞团。(n＝4/组；在48h和120h时，n＝2/组)。
e在24h时收集腹股沟淋巴结(n＝2/组)，通过按压组织通过200μm细胞过滤网分离单核细胞。分析各200万个细胞的细胞团。
f使用梯形法则由血浆药物浓度计算曲线下面积(AUC)。由总AUC的平均值和在指定时间范围的平均AUC计算早期(0-8h)和晚期(8-168h)的总AUC的分数百分比。数值表示为总AUC的百分比(n＝4/组)。
虽然抗HIV LNP的毒性需要进一步研究，但是全血细胞计数、血清化学板(serumchemistry panel)、C反应蛋白和补体水平没有显示处理影响。没有抗HIV LNP处理的动物显示C-反应蛋白、白细血胞计数、血尿素氮(BUN)、肌酸酐或肝酶升高。总补体水平高度变化，但变化不显著。另外，用抗HIV LNP给药时，注意到胆固醇水平没有显著升高(162±16.4相对于191±14.8mg/dl)。在注射部位的身体检查中，接受游离药物的未经治疗的(naive)动物表现出局部反应，由坚硬的非红斑性肿胀，其在随后几周内消除组成。用抗HIV LNP处理的动物没有显示局部反应，并且它们的血小板计数保持在正常范围内。
综上所述，利用两种亲脂性蛋白酶抑制剂LPV和RTV的高LNP掺入效率和包封亲水性TFV的能力，我们构建了组合抗HIV LNP并分析了在猕猴(豚尾猴)中的细胞内药物浓度和血浆动力学。用抗HIV LNP皮下给予的灵长类动物在血液和淋巴结二者的单核细胞中显示出升高和延长的细胞内药物水平，表明该方法克服口服cART治疗的患者中的淋巴结药物不足和相关的病毒存留的效用。抗HIV LNP使血浆药物水平以更高的总药物暴露延长超过1周的能力支持了作为改善患者依从性的长效药剂的考虑。重要的是，将三种药物一起包装在抗HIV LNP中，可以通过在相同细胞中在治疗水平以上一致且同时递送所有三种药物来降低耐药性潜力。这减少了每种药物的如当以游离形式或分开的颗粒递送时所实现的细胞内浓度变化的可能性。通过具有pH响应性药物释放的细胞器靶向和表达CD4+-结合肽来靶向HIV宿主细胞，可以进一步增强抗HIV LNP的治疗功效。总之，抗HIV LNP显示了克服淋巴组织中的药物不足并改善患者依从性以寻求治愈AIDS的希望。
实施例3
本实施例提供了抗HIV药物组合纳米颗粒的进一步描述，其增强了血浆药物暴露持续时间以及灵长类动物的淋巴结和血液中的细胞中的三联药物组合水平。
摘要
组合口服药物治疗的HIV患者经历淋巴结中的药物水平不足，这与病毒存留相关。在成功地增强淋巴结药物水平和延长在脂质纳米颗粒中配制的茚地那韦的血浆停留时间后，我们开发了含有洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(PMPA)的多药抗HIV脂质纳米颗粒(抗HIV LNP)。制备、表征、放大并在灵长类动物中评估这些抗HIV LNP，重点是血浆时程和血液和淋巴结中的细胞内药物暴露。四只猕猴在交叉研究中皮下给予抗HIV LNP和游离药物悬浮液。分析血浆药物浓度的时程以及血液和腹股沟淋巴结中的细胞内药物浓度，以比较LNP制剂的作用。抗HIV LNP以高效率掺入LPV和RTV，并可重现地捕获一部分亲水性PMPA。在灵长类动物中，与游离药物相比，抗HIV LNP在淋巴结中产生高出50倍以上的细胞内LPV和RTV浓度。血液中的血浆和细胞内药物水平升高并持续长达7天，超过了其游离药物对应物可实现的水平。因此，多种抗逆转录病毒剂可以同时掺入到抗HIV脂质纳米颗粒中，以增强病毒复制存留的血液和淋巴结中的细胞内药物浓度。由于这些抗HIV脂质纳米颗粒也延长了血浆药物暴露，所以它们有希望作为HIV患者的长效剂型来解决细胞和组织中的残余病毒。
引言
高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是具有不同病毒靶点的抗逆转录病毒药物的组合，能够从血液清除病毒并维持数年的无病毒血(aviremia)。然而，如果每日口服治疗中断，血浆病毒血症迅速反弹。病毒在淋巴结和淋巴组织中存留，即使在血浆无病毒血的情况下，在HAART患者的淋巴结和淋巴组织中仍可检测到病毒DNA和RNA。HAART的HIV+患者的淋巴组织中的药物浓度相对于同时的血浆浓度而言更低，这与持续的淋巴病毒复制有关。增强和延长淋巴组织中的药物暴露对于清除残余病毒以寻求治愈HIV是必要的。
我们以前发现，含有蛋白酶抑制剂茚地那韦(IDV)的脂质纳米颗粒(LNP)在整个身体的淋巴结中产生升高的药物水平并延长了血浆停留时间。在HIV感染的灵长类动物中，用这些IDV-LNP治疗逆转了CD4+T细胞衰退，并减少了血浆和淋巴结中的病毒RNA。已经记载了这些LNPS掺入了其他蛋白酶抑制剂以及亲水性药物替诺福韦(PMPA)，其为核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)和Viread中的活性药物。由于单药方案可以促进耐药性，而针对多种HIV蛋白的组合药物疗法降低死亡率，因此配制在单一颗粒中的多种药物可增强治疗效力和组织病毒清除率。
因此，我们开发并在灵长类动物中评价了含有洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和PMPA的三药组合的脂质纳米颗粒(抗HIV LNP)。LPV和RTV由于其酸稳定性和疏水性而被选择，酸稳定性和疏水性促进脂质结合。利托那韦是一种代谢和转运抑制剂，临床上用于提高共同给予的药物的功效。作为NRTI的PMPA提供了另外的抗病毒作用位点，并且其磷酸化形式保留在细胞内，从而延长了抗病毒活性。该组合在临床上是相关的并且有利于延长和增强细胞内药物暴露。我们发现与悬浮液中的游离药物相比，在灵长类动物中皮下注射抗HIVLNP在淋巴结单核细胞(LNMC)和外周血单核细胞(PBMC)产生增强的细胞内药物浓度以及在PBMC和血浆中延长停留时间。长效抗HIV脂质纳米颗粒具有克服药物不足和淋巴组织中的相关病毒存留的潜力。
材料和方法
材料和动物
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和N-(羰基甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺钠盐(MPEG-2000-DSPE)购自CordenPharma(Liestal,Switzerland)。LPV、RTV和PMPA([(2R)-1-(6-氨基嘌呤-9-基)丙烷-2-基]氧基甲基膦酸)购自Waterstone Technology(Carmel,IN)。其他试剂为分析级或更高级。
由华盛顿国家灵长类动物研究中心(the Washington National PrimateResearch Center，WaNPRC)根据经批准的机构动物保护和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的方案，饲养和照料四只年轻的成年雄性猕猴(豚尾猴，2.9-4.0kg)。一只动物患上无关的疾病，因此必须丢弃该个体的第二轮PBMC数据。
脂质纳米颗粒制备和体外表征。根据先前建立的方法无菌制备由DSPC:MPEG-2000-DSPE(8:2或9:1摩尔比)、LPV、RTV和PMPA(115:10:5:15脂质:LPV:RTV:PMPA摩尔比)组成的LNP。Kinman L,Brodie SJ,Tsai CC等人:Lipid-drug association enhanced HIV-1protease inhibitor indinavir localization in lymphoid tissues and viral loadreduction:A proof of concept study in HIV-2287-infected macaques.J AcquirImmune Defic Syndr 2003；34(4):387–397，将其全部内容通过引用并入本文。简言之，将脂质和蛋白酶抑制剂溶于氯仿:乙醇(3:1v/v)，并添加来自30mg/ml的150mM NaHCO3水溶液的储备溶液的PMPA。通过旋转蒸发和真空干燥去除溶剂。干燥的膜在60℃下在具有20mMNaHCO3缓冲液的0.4％NaCl中再水化至200mM脂质。通过浴式超声处理(实验室规模)或使用Emulsiflex-C5(Avestin，Ottawa，Canada)(临床规模)进行高压均质化，在60℃下减小颗粒尺寸。将LNP保持在60℃下以在冷却前退火30分钟，并在4℃下储存。使用NICOMP 380 ZLS(Particle Sizing Systems，Santa Barbara，CA)通过光子相关光谱法测定颗粒尺寸。评估重量克分子渗透压浓度(Vapro 5520渗透压计；Wescor，Logan，UT)和pH(Hydrion纸)。
抗HIV LNP制剂含有未结合的药物和结合于脂质纳米颗粒的药物。为了确定药物掺入/包封效率，在室温下用1,000×体积的碳酸氢盐缓冲的盐水对抗HIV LNP进行透析(MWCO 6,000-8,000)4小时以去除未结合的药物。通过LC-MS/MS使用乙腈沉淀对药物进行定量。包封效率(EE)计算如下：
如前所述，在HIV感染的CEM-174细胞中评价三药组合的可溶性或LNP形式的抗病毒活性。Kinman L,Brodie SJ,Tsai CC等人:Lipid-drug association enhanced HIV-1protease inhibitor indinavir localization in lymphoid tissues and viral loadreduction:A proof of concept study in HIV-2287-infected macaques.JAcquirImmune Defic Syndr 2003；34(4):387–397，将其全部内容通过引用并入本文。与药物孵育4天后，观察细胞的合胞体，并通过ELISA检测HIV-2p27确认病毒感染。对于抗病毒活性评价，LPV、RTV和PMPA的比例固定为1:1:0.5(m/m/m)。添加到细胞中的药物剂量表示这些抗HIV LNP制剂中结合的和未结合的药物的总和。
用于灵长类动物研究的游离药物悬浮液的制备
以与抗HIV LNP(LPV:RTV:PMPA 2:1:3，m/m/m)相同的摩尔比制备两种游离药物悬浮液。第一悬浮液的载体是含有3％乙醇和0.2％牛血清白蛋白的碳酸氢盐缓冲的盐水。第二悬浮液的载体是含有8％DMSO和0.1％吐温20的碳酸氢盐缓冲的盐水。
注射用制剂的无菌性
所有注射用制剂均使用注射级水溶液和无菌技术制备。通过0.22-lm醋酸纤维素过滤器对有菌含水组分灭菌。在37℃下通过7天的血琼脂培养试验验证无菌性。
将游离和脂质结合的药物组合皮下给予猕猴
四只猕猴被分成两个治疗组(每组两只动物)。每只动物在交叉研究中接受游离药物和抗HIV LNP(结合的和游离的药物混合物)，实验之间的清除期超过12周。在背部皮下递送20ml的抗HIV LNP，剂量分别为25.0、14.3和17.1mg/kg的LPV、RTV和PMPA。由于有限的溶解度，游离药物悬浮液以相同的体积剂量略低(分别为20.0、11.5和13.7mg/kg的LPV、RTV和PMPA)。数据被归一化到抗HIV LNP剂量用于比较分析。
血液和组织样本的收集和处理
在研究的第二轮中的0、0.5、1、3、5、8、24和168h，加上48h(两组)和120h(抗-HIVLNP组)，通过股静脉穿刺将血液样品收集在EDTA中。去除血浆，通过密度梯度法分离PBMC，并将细胞等分成各约2百万个PBMC的细胞团。在给药后24小时手术切除腹股沟淋巴结(每次处理n＝2)，通过穿过100-lm尼龙细胞过滤网(Corning，Tewksbury，MA)分离LNMC，并将细胞等分成各约1-2百万LNMC的细胞团。在药物分析之前，所有的样品都储存在-80℃下。
血浆和细胞中的药物浓度的确定
使用最近公布的方法，通过液相色谱串联质谱法同时分析所有三种药物的血浆浓度。Koehn J and Ho RJ,Novel liquid chromatography-tandem mass spectrometrymethod for simultaneous detection of anti-HIV drugs lopinavir,ritonavir,andtenofovir in plasma.Antimicrob Agents Chemother 2014；58(5):2675–2680，将其全部内容通过引用并入本文。使用200μl水/甲醇(1:1v/v)溶解PBMC和LNMC细胞团，超声处理10分钟，然后使用与上文所述的相同方法提取和分析。假定每个细胞的体积为4×10-9ml，将细胞内浓度转换成ng/ml。Alberts B,Johnson A,Lewis J等人.Molecular Biology ofthe Cell,4ed.Garland Science,New York,2002，将其全部内容通过引用并入本文。
血浆药物暴露的测定
使用梯形法则计算总评价时间段(0-168h)以及0-24和24-168h的曲线下面积(AUC)。通过配对双侧Student t-检验分析数据，p<0.05被认为具有统计学显著性。
免疫和炎症反应的评估
在给药前至少1周和恰好给药7天后收集血液，用于分析全血细胞计数、血清化学、C反应蛋白和总补体。豚尾猴的参考值由WaNPRC提供。由于有限的灵长类动物数据，人参考值被用于C反应蛋白和总补体。每天观察动物的身体或行为改变。
结果
由洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦组成的抗HIV纳米颗粒的物理化学性质和抗病毒活性。在灵长类动物研究的制剂中，将含有LPV，RTV和PMPA的抗HIV LNP以实验室规模(0.1–0.4ml)优化并使用可容纳多升(multiliter capacity)的设备放大至临床规模(14–40ml)。高蛋白酶抑制剂掺入效率可重现，临床规模批次显示超过90％的LPV和RTV掺入(表7)。PMPA结合是一致的和可重现的(表7)。高压均质化产生比超声处理制备的颗粒(直径～70nm)略小的颗粒(直径～50nm)。抗HIV LNP制剂的pH和重量克分子渗透压浓度是生理学上相容的，并且培养测试验证了适合灵长类动物研究的无菌性。
表7.以实验室或临床规模制备的抗HIV脂质纳米颗粒的物理化学特征
a颗粒尺寸由Nicomp强度加权分析确定。
b以0.1-0.4ml批次重现抗HIV LNP，数值表示为五批的平均值±标准偏差。
c以15-40ml批次重现抗HIV LNP，数值表示为三批的平均值±标准偏差。
以脂质:LPV:RTV:PMPA摩尔比为115:10:5:15和200mM的最终脂质浓度制备抗HIVLNP。按照材料和方法中对重现性和其他特征的描述测定三种药物LPV:RTV:PMPA(2:1:3摩尔比)中的药物掺入度。抗HIV LNP以明确限定的分数包含游离的和结合的药物。
LNP，脂质纳米颗粒；LPV，洛匹那韦；RTV，利托那韦；PMPA，替诺福韦。
LNP结合的LPV、RTV和PMPA的抗病毒效力在HIV感染的CEM-174细胞中进行评价，并与以等当量比例组合或单独使用的可溶性游离药物比较。在1:1:0.5(m/m/m)的药物比例下，抗HIV LNP分别显示效力比以可溶性形式组合的药物提高30倍(LNP形式为LPV、RTV和PMPA EC50 3.0±0.8、3.0±0.8和1.5±0.1nM，相比之下，游离形式为98±0.3、98±0.3和49±0.2nM)。LPV、RTV和PMPA的单一药剂EC50值分别为600±0.04、530±0.2和1150±0.7nM。对照脂质纳米颗粒没有显示出抗病毒作用。
LNP结合对血浆时程和总药物暴露的影响
灵长类动物接受单一皮下剂量的抗HIV LNP或游离悬浮形式的LPV、RTV和PMPA。在游离药物给予后，血浆浓度在8h内达到峰值，并且到24h降至低或不可检测的水平(图6A-6F)。相比之下，用抗HIV LNP处理的猕猴在所有评价的时间点均显示升高的LPV和RTV的血浆浓度，和更高的LPV和RTV的峰值血浆浓度(p<0.05)，且所有三种药物在给予后7天(168h)以有效杀病毒浓度内的水平在血浆中保持可检测(甚至不需要进一步优化)。LNP-结合的PMPA显示两个峰：第一个峰与游离药物给予后看到的相似，而第二个峰采用游离药物未见到(图6E和6F)。
通过计算血浆药物浓度曲线下面积(AUC)评估总药物暴露。如表8中所示，与游离药物悬浮液(LPV、RTV和PMPA分别≤0.05、0.07和0.173)相比，抗HIV LNP提供了所有三种药物的总药物暴露的7倍或更多的增加。此外，采用抗HIV LNP所有三种药物在前24h后发生的总的药物暴露百分比都增加了。对于亲水性PMPA，这一变化最为显著(采用游离药物为0.1％，采用抗HIV LNP为51.2％)(表8)。这些数据表明，LNP制剂为所有三种药物提供增强和延长的血浆药物暴露，包括仅有12％药物结合的水溶性PMPA。注意到在最初的24小时内出现的替诺福韦(PMPA或TFV)的初始峰值血浆浓度显著降低。替诺福韦的峰值血浆浓度的这种降低可以减少与该药物的高峰值血浆浓度相关的不良作用。还令人感兴趣的是，注意到用脂质纳米颗粒配制的药物组合的总血浆药物暴露在七天研究的24-168小时的延长期内(表8中的右栏)。考虑到7-18倍的总暴露增强和本研究选择的游离药物剂量相当于治疗性灵长类动物SHIV治疗剂量(例如每天20mg PAMA和50mg/kg FTC SC)，因此相当于可以仅使用一个多药脂质纳米颗粒配制的剂量来提供七个每日游离药物剂量以提供治疗效果。此外，总剂量的降低以及替诺福韦的预期较低的血浆峰值水平可以被容易地优化以得到更安全，并且更有效的产品。
表8.抗HIV脂质纳米颗粒对用组合的洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦处理的灵长类动物中血浆药物暴露的影响
a用以游离或LNP形式皮下给予的洛匹那韦(25mg/kg)，利托那韦(14.3mg/kg)和替诺福韦(17.1mg/kg)处理的四只动物。测量血浆药物浓度并使用梯形法则计算曲线下面积(AUC)。数据表示为在168小时期间四只动物的平均值-标准偏差。
b从代表用于目前HAART的标准给药期的0到24h和从24到168h分析AUC，以证明由抗HIV LNP提供的延长的血浆暴露。数值表示为总AUC的百分比，平均值±标准偏差。
LNP结合对血液和淋巴结单核细胞中细胞内LPV、RTV和PMPA浓度的影响
尽管血浆药物水平显示持续的药物暴露，但细胞内水平对于抑制病毒复制是必要的。因此，分离血液中的单核细胞(PBMC)并测定细胞内LPV、RTV和PMPA的浓度。如图7A至7C所示，用抗HIV LNP处理的猕猴在给予后7天具有可检测的细胞内药物水平，其超过上述报道的实验EC50。相比之下，游离药物给予后的细胞内药物水平到48h通常降低到检测限以下(图7A-7C)。抗HIV LNP给药后的LPV和RTV浓度在早期时间点与游离药物相当，在更晚的时间点比游离药物高达20倍。抗-HIV LNP的前五个时间点，水溶性PMPA显示较低的细胞内药物水平；然而，到给药后8h，LNP处理的动物中的细胞内PMPA浓度高超过50倍(图7A-7C)。
为了确定LNP结合对LNMC中的细胞内药物浓度的影响，在给药后24小时收集腹股沟淋巴结。分离LNMC并在测试组(LNP与游离的之比)之间比较细胞内药物浓度，并与同时发生的血浆药物浓度进行比较(表9)。LPV和RTV浓度在用游离药物组合处理的动物的LNMC中低或不可检测，并且与血浆浓度相当。相比之下，抗HIV LNP给予后LNMC中LPV和RTV的浓度分别比同时发生的血浆浓度高2倍和10倍，并且比游离药物给予后的LNMC浓度高50倍以上(p<0.05)。此外，与游离药物相比，抗HIV LNP在24h时的LPV和RTV的血浆浓度大约高25倍(表9)。PMPA虽然在LNMC中始终可检测到，但在两个测试组之间的细胞内淋巴结浓度没有显著差异(p＝1.0)。在24h时，PBMC和LNMC中的细胞内药物水平是相当的。总之，包含LPV、RTV和PMPA的抗HIV LNP在血液以及淋巴结中增强和延长所有三种药物的细胞内水平，并且在给予后24h时在LNMC中产生比血浆中更高的LPV和RTV的浓度。
表9.与24h时的血浆浓度相比，抗HIV脂质纳米颗粒对淋巴结中洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦的细胞内浓度的影响
a以25mg/kg LPV、14.3mg/kg RTV和17.1mg/kg PMPA的标准化剂量皮下给予动物抗HIV LNP或游离药物。给药后24h收集血样和腹股沟淋巴结，分离淋巴结单核细胞进行药物分析。如材料和方法中所述，计算细胞内药物浓度。药物浓度报道为平均值±标准偏差(n＝2)。
b平均抗HIV LNP药物浓度除以平均游离药物浓度。在药物水平低于检测限的情况下，该数值取“1”来计算比值。
c平均淋巴结细胞内药物浓度除以平均血浆药物浓度。在药物水平低于检测限的情况下，该数值取“1”来计算比值。
免疫和炎症反应的安全评价
为了评价安全性，分析给予药物前后取得的灵长类动物血液样品的全血细胞计数、血清化学板、C-反应蛋白和总补体。表10总结了相关的值。肾和肝功能指标(血尿素氮、肌酸酐、肝酶)保持在正常限度内。动物未显示C反应蛋白或白细胞计数增加至参考范围之外的值。总补体虽然高度可变，但没有显示出显著的变化。在抗HIV LNP处理的情况下，轻微的胆固醇水平变化没有统计学显著性(p＝0.07)。接受游离药物的未经治疗的动物表现出局部反应，由在随后几周内消除的坚硬的非红斑性肿胀，以及轻度增加的血小板计数组成。接受抗HIV LNP的未经治疗的动物没有表现出局部反应，并且它们的血小板计数保持在正常限度内。
表10.以游离或抗HIV脂质纳米颗粒形式皮下给予洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦后所选择的炎症指标和胆固醇的变化a
a分析静脉血液样品的全血细胞计数、血清化学、总补体和C反应蛋白。数值表示为平均值±标准偏差。没有从该表排除的参数，其显示在任何灵长类动物(n＝4)中给予后增加至参考范围之外的值。
b为了建立基线，在给药前至少7天收集血液。
c给药后7天收集血液。
dp值由配对双侧Student t-检验确定。
讨论
利用脂质纳米颗粒有效掺入两种亲脂性蛋白酶抑制剂LPV和RTV并同时包封相当一部分PMPA的能力，我们构建了药物组合抗HIV LNP并分析了猕猴(豚尾猴)中的细胞内药物浓度和血浆动力学。用抗HIV LNP皮下给药的灵长类动物表现出延长的血浆药物水平(图6A-6F)，具有较高的总药物暴露(表8)，以及血液中LPV、RTV和PMPA的持续的细胞内浓度(图7A-7C)。重要的是，抗HIV LNP中的药物在淋巴结中提供了高得多的LPV和RTV的细胞内水平，超出了用游离药物所达到的水平(表9)。这些发现表明，脂质纳米颗粒可能会克服所报到的口服HAART的HIV感染者的药物不足。
采用简单、可重现和可放大的制备方法，这些纳米颗粒稳定地掺入LPV和RTV，效率>90％，同时包封亲水性逆转录酶抑制剂PMPA(表7)。PMPA结合是一致的和明确的，并且未结合的PMPA作为游离药物留在溶液中，减少了药物浪费和污染的风险，并且消除了对昂贵且耗时的纯化的需求。由于篇幅限制，关于抗HIV LNP的优化和体外表征的其他细节超出了本报道的范围，将分开报道。
如AUC增加所证明的，皮下给予的抗HIV LNP的三药组合增加峰值血浆浓度，延长血浆停留时间，并增加血浆药物暴露(图7A-7C和表8)。考虑到PMPA的12％的包封率，这些发现表明，亲水性PMPA的有限的包封仍然对药物分布和/或代谢产生显著的影响。LNP提供的增强的稳定性和减少的肾脏和肝脏药物清除可能有助于这些发现，但是抗HIV LNP的体内行为和形式仍有待探索。
如果药物最大限度地抑制细胞中的病毒复制，细胞内药物暴露是一个重要的考虑因素。对于所有三种药物，脂质-药物结合增加了PBMC和LNMC中的细胞内药物浓度，表明LNP被内化并保留在单核细胞中(图7A-7C和表9)。虽然这项非终止研究能够仅分析单个外周淋巴结，但之前使用含茚地那韦LNP的工作显示，整个身体(包括肠系膜、扁桃体、支气管等)的淋巴结的茚地那韦浓度升高。因此，含有药物的LNP的广泛的淋巴分布是可实现的。因此，抗HIV LNP有望成为用于多种抗HIV药物同时广泛淋巴分布的载体，克服了在病毒存留部位的淋巴药物不足。
在单个颗粒内提供具有不同病毒靶点的多种药物对于改善抗病毒效力和降低病毒抗性的风险是重要的。虽然已经做出了许多努力去开发在给予时组合的单药纳米颗粒，但这种方法可能会导致细胞内药物浓度的不均一性，并可能庇护耐药性病毒。已经合成了含有多种结晶药物的直径为100-600nm的固体聚合物颗粒，但是这些比抗HIV LNP大得多，并且可能不适用于淋巴摄取。尽管抗HIV LNP中的药物作用机制仍有待阐明，但完整纳米颗粒的细胞摄取，接着活性药物的pH或磷脂酶依赖性释放可能导致升高的细胞内水平。与游离形式的药物或分开的纳米颗粒相比，这种使用组合的酸稳定的药物的机制提供了协同的抗病毒作用。计划进一步的研究以评价多药抗HIV LNP在感染HIV的猕猴模型中的治疗功效。
在每日口服HAART治疗的情况下，治疗中断通常与不良副作用或药物滥用相关。胃肠道副作用导致患者逃避服药，有药物滥用史的患者停止治疗的可能性高出三倍，导致病毒迅速反弹。用单剂量的抗HIV LNP获得的升高的和持续的血浆和细胞内药物暴露表明较低频率(例如，每周一次)给药的可行性，降低了治疗中断的可能性。虽然需要剂量范围和多剂量研究来优化剂量和给药频率，但是我们的预测模型表明每周一次给予抗HIV LNP是可行的。计划评价整个身体的淋巴结中的细胞内药物水平和使用钆示踪剂的脂质颗粒分布的研究，但超出了本报道的范围。
除了提供多种抗病毒化合物之外，抗HIV LNP平台还提供了具有pH依赖性药物释放、CD4结合肽的表达或其他表面修饰细胞和细胞器靶向的可能性。这些抗HIV脂质纳米颗粒很少或不引发局部或全身炎症反应，有希望用于将HIV药物如LPV、RTV和PMPA递送到血液和淋巴组织中的病毒存留的位点。
实施例4
该实施例描述了扩展多药脂质纳米颗粒制剂的表征及其长期稳定性的另外的研究。
如实施例3中所述，我们开发了含有疏水性蛋白酶抑制剂洛匹那韦(LPV)和利托那韦(RTV)(一起作为销售)和亲水性TFV(中的活性药物)的多药抗HIV脂质纳米颗粒。在大于90％的LPV和RTV的结合以及约12％的TFV的结合的情况下，这些脂质稳定的药物颗粒在灵长类动物中与游离药物相比增强和延长了所有三种药物的血浆和细胞内药物暴露。这种LNP方法设计和得到的体内药代动力学数据表明，这种新方法在制备用于治疗HIV、癌症和其他疾病的多药治疗剂方面具有可放大性和临床相关性。
所描述的脂质稳定的药物-组合纳米颗粒组合物和相关的制备方法广泛适用，并且能够以传统脂质体无法实现的水平同时掺入疏水性和亲水性药物。为了进一步证明所述方法和所得纳米颗粒制剂的适用性，我们用另外的不同药物组合评价了该方法。每种组合都测试到两种疏水性药物的高且可重现的结合以及亲水性药物的可接受的和可重现的分数的稳定结合(表11)。
表11：已经同时结合到脂质-药物纳米颗粒中并且大规模制备(15-60mL体积)的药物组合a。脂质-药物结合效率b(平均值±标准偏差)显示在括号中。
a所有组合物都以9:1的优化的摩尔比用DSPC:DSPE-mPEG2000配制。脂质:药物摩尔比如下：组合1脂质:LPV:RTV:TFV为115:10:5:15，组合2脂质:ATZ:RTV:TFV为115:10:5:15，组合3脂质:LPV:EFV:TFV为200:26.6:20:40。
b通过用至少1000x体积的等渗碳酸氢盐缓冲的盐水在生理pH下在室温下对药物-脂质颗粒产品透析4小时来测定脂质-药物结合效率。将透析后的药物浓度(通过LC-MS/MS方法测定)与透析前的药物浓度进行比较，以确定与脂质稳定结合的药物百分比。
为了测试长期稳定性，将多药纳米颗粒在4℃下冷藏保存，并在长时间后测试其稳定性。脂质-药物组合颗粒是稳定的，如通过颗粒尺寸和药物结合程度确定的(表12)。在评价药品的临床潜力时，这是关键因素，所述药品必须显示可接受的保质期以具有临床可行性。即使是在数个小时内容易地从大多数脂质颗粒扩散出来的亲水性化合物，在储存8、12和17个月后，只损失非常低的分数的结合的药物。这种卓越的稳定性为转化为临床应用提供了实质性的优点。
表12：与药物组合纳米颗粒混合物结合的药物部分的储存稳定性a
a LPV/RTV/PMPA的储存稳定性。将3-4种制剂在4℃在无菌条件下以150mg/mL包含在多药脂质纳米颗粒混合物中的洛匹那韦/利托那韦/PMPA的脂质储存。在指定的储存时间点(0-17个月)，通过透析法从制剂中除去游离药物后，测定与多药纳米颗粒结合的药物分数。表示的数据为平均值和标准偏差。在17个月时，只有一批制剂可用于稳定性分析。C＝摄氏度，LPV＝洛匹那韦，mg＝毫克，mL＝毫升，PMPA/TNF＝替诺福韦，RTV＝利托那韦，SD＝标准偏差。
如上所述，我们确立了各种药物在中性pH下与脂质的pH-依赖性结合，以及在pH降低时伴随的药物释放。同样如上所述，该稳定整合和药物从多药脂质纳米颗粒的pH依赖性释放对于亲脂性和水溶性化合物都是一致的。为了证实单一药物从多药组合脂质纳米颗粒的pH依赖性释放，使如上所述装配的LPV/RTV/PMPA(TFV)脂质纳米颗粒经历不同的pH环境，并且分析上清液的游离药物组分以确定释放的量。与以上实施例中报道的结果一致，不同的药物显示出从多药组合脂质纳米颗粒的pH依赖性释放。参见表13。表13中显示的该证实的pH响应性属性说明了公开的多药组合脂质纳米颗粒的附加益处。当脂质纳米颗粒位于组织中并被HIV感染的细胞摄取时，所掺入的抗逆转录病毒药物随后在pH降低时释放到细胞器(如核内体和溶酶体)内部。由于所提出的药物在酸性条件下的化学稳定性(大多数药物被提取以测量用于LC-MS分析的血浆药物水平)，通过提供更稳定、延长和有效的药物递送模式，该属性可以增强抗病毒效力。
表13：药物从包含与洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(PMPA/TFV)结合的脂质纳米颗粒的pH依赖性释放。在37℃在2小时内的药物释放分数表示为平均值±SD％。
评估了公开的多药-脂质纳米颗粒组合物中提供的HIV药物组合，特别是掺入了LPV、RTV和PMPA(TFV)的组合的HIV药物组合的抗病毒效力的增强。在HIV感染的CEM-174细胞中评价多药-脂质纳米颗粒组合物的功效，并与以当量比组合的可溶性游离药物或单独使用的可溶性游离药物进行比较。在药物比为1:1:0.5(m/m/m)的情况下，多药-脂质纳米颗粒制剂中的LPV、RTV和PMPA分别增强了单一药物效力以及可溶形式的等价固定组合(表14)。对照脂质颗粒没有表现出抗病毒作用。多药-脂质纳米颗粒配制的药物在体外50％抑制作用(EC50)中显示约30倍增强。确切的增强将根据病毒株变化，但该数据经验显示，由多药-脂质纳米颗粒制剂引起的抗病毒效力提高了3到30倍。
表14：含有洛匹那韦、利托那韦和PMPA的多药脂质纳米颗粒制剂在HIV-2(287)复制中的作用(数据表示为抗病毒复制的50％抑制药物浓度(nM))。对于联合治疗，制剂中的洛匹那韦、利托那韦和PMPA的比例固定为1:1:0.5(m/m/m)。
已经在体内评价了表11的所有三种脂质-药物组合，并且在以上实施例1-3中描述了来自这些组合的子集的起始药代动力学数据。与游离形式的相同组合相比，使用公开的大规模制备方法制备的脂质-药物颗粒混合物一致地证明持续7天以上的血浆药物水平，增强的血浆药物暴露，以及淋巴结和血液中更高的细胞内药物浓度。评价为血浆时程曲线下面积(AUC)的给予脂质稳定的药物后的总血浆药物暴露通常显著高于由游离药物所达到的总血浆药物暴露，并且一致地向更晚的药物暴露移动(表15)。这对于TFV来说是最显著的，在只有8-10％的稳定的脂质结合的情况下，其一致地表现出增加10-20倍的血浆暴露，并且AUC向更晚的时间点急剧移动。游离药物处理的灵长类动物在前8小时内显示～90％的总TFV暴露，而用脂质稳定的药物颗粒处理的灵长类动物在8小时后显示～95％的总TFV暴露，不管药物组合如何(表15)。脂质-药物颗粒还增强和延长了外周血单核细胞(PBMC)中的细胞内药物暴露，提供超过7天的可检测的细胞内药物水平，而游离药物水平到24小时降低到接近检测限或检测限以下(表16)。验血和身体检查未显示与皮下给予脂质-药物组合颗粒相关的显著不良反应，表明可接受的安全程度。
表15：脂质稳定化对血浆药物暴露的影响。研究了三种不同的优化的多药脂质制剂以确定血浆曲线下面积(AUC)与游离形式的相同药物相比的变化a。使用的药物包括洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)、替诺福韦(TFV)、阿扎那韦(ATZ)和依法韦仑(EFV)。
a在交叉研究中，给予灵长类动物脂质-药物颗粒和游离药物(除了在LPV/EFV/PMPA的情况下)。通过LC-MS/MS方法测定血浆浓度，并且使用梯形法则计算AUC。数据表示为平均值±标准偏差(每组n＝2或4)。
b通过将指定时间范围的AUC除以总AUC来计算分数AUC。
c脂质/游离比是由脂质-药物混合物产生的平均总AUC除以游离药物产生的平均总AUC。
表16：皮下给药后脂质结合对外周血单核细胞(PBMC)中洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦的细胞内水平的影响a
a在交叉研究中以脂质-药物颗粒形式和游离药物形式皮下组合给予四只灵长类动物(豚尾猴)洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV)，标准化剂量为25mg/kgLPV、14.3mg/kg RTV和17.1mg/kg TFV。通过密度梯度法从全血分离PBMC，分析各200万个PBMC的细胞团。数据表示为平均值±标准偏差。
b脂质/游离比是给予脂质-药物颗粒混合物后的平均药物浓度除以给予游离药物后的平均药物浓度。在药物水平低于检测限的情况下，该数值取“0.01”来计算比值。
这些结果进一步证明，多种药物与纳米颗粒聚集体中的脂质赋形剂的结合显著提高了递送性能和药物的持续释放/利用度。具体地，公开的纳米颗粒中药物组合与脂质赋形剂的结合导致血浆和细胞内药物浓度显著增加较长时间段。这样可以更有效地治疗诸如HIV等疾病，其中给予攻击不同的靶点的多种药物对于清除病毒是必需的。这种方法提供了令人兴奋的克服现有策略的缺陷的机会，在现有策略中，多种药物可能分开给药，不能在相同的靶组织和细胞中提供高水平的所有给予的药物，因此不能实现完全清除病毒。虽然本发明专注于抗HIV药物和相关疗法，但显而易见的是，所公开的方法可以应用于其他疾病和/或感染的治疗剂的制备和给予，所述治疗剂涉及可类似地与形成颗粒的脂质赋形剂结合的小分子药剂。
实施例5
以上的实施例1-4描述了在允许使用混合双溶剂方法将亲水性和疏水性药剂共同掺入稳定的脂质纳米颗粒的过程中装配的多药脂质纳米颗粒。如所述的，将药剂分别溶于有机溶剂或含水溶剂中，然后将溶剂以允许混合而不形成多相的比例组合(本文称为“混合双溶剂”方法)。这实现了提供多种药物的显著增强和延长的递送的稳定制剂，所述多种药物各自具有不同的物理特征，例如不同的亲水性/疏水性，并且可能针对不同的疾病靶点。拥有可灵活地应对多种疾病靶点的单一制剂，使制剂用于应对诸如HIV/AIDS的疾病，同时避免对单一靶点疗法的潜在耐药性。为了实现这个特定目标，表17中提供了FDA批准的示例性抗HIV药物及其各自的靶点/作用模式。
该实施例描述了使用说明性的供选择的装配方法成功地装配掺入选择的抗HIV药物的多药脂质纳米颗粒。该供选择的组装方法被设计成确保或增强亲水性和疏水性组分(即小分子药剂和赋形剂组分)一起在最终的均匀组合物中的完全溶解和混合。该供选择的方法涉及在单一可混溶溶剂中完全溶解所有成分，即疏水性小分子药剂、亲水性小分子药剂和赋形剂组分。随后是受控去除溶剂以形成干燥的产物，将其再水化以形成多药脂质纳米颗粒。在某些方面，这种说明性的供选择的方法产生具有增强或优化特征，包括更高程度的稳定性和亲水性药物结合的多药脂质纳米颗粒。
表17.FDA批准的HIV药物及其病毒靶蛋白的列表
a非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)
b抑制HIV逆转录酶的核苷类似物衍生物(NRTI)
如上所述，可以将一些有机溶剂如醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、己醇等)与一小部分水混合以形成水饱和的单相可混溶溶剂而不产生乳液。这甚至可以与其它有机溶剂如氯仿(CHCl3)结合使用，所述单独的有机溶剂是水不可混溶的，只要整个混合物不含超过水可混溶有机溶剂饱和容量的水，就可以同时保持单相。此处，形成能够溶剂化所有成分，即亲水性和疏水性药剂和赋形剂组分的单相完全可混溶溶剂，以允许药剂和赋形剂完全溶解并混合以达到最大的相互作用。在一些实施方案中，可混溶溶剂的有机组分可以是不同有机分子和水溶液或缓冲液的组合。例如，氯仿可以与醇混合。在该实例中，氯仿以65:35(体积/体积)的比例与乙醇混合。在一些实施方案中，乙醇可以被甲醇、丙醇、己醇等替代。认为存在一些水不溶性有机组分如氯仿有助于混合物的干燥。
将选择的亲脂性(疏水性/水不溶性)小分子药剂(多种小分子药剂)、亲水性(水溶性/脂不溶性)小分子药剂(多种小分子药剂)、脂质赋形剂和含有大亲水性结构域的赋形剂完全溶解在可混溶溶剂中。出于该说明性实例的目的，从表18选择亲脂性小分子药剂(也称为“1类”)，并从表19选择亲水性小分子药剂(也称为“2类”)，其各自提供了关于每种说明性小分子药剂的结构和物理特性。
表18：适合掺入公开的脂质纳米颗粒中的用于HIV治疗的说明性亲脂性(疏水性的，也被称为“1类”)小分子药剂。
*在中性pH下的净形式电荷
表19：适合掺入公开的脂质纳米颗粒中的用于HIV治疗的说明性亲水性(也称为“2类”)小分子药剂。
*中性pH下的净形式电荷
该实施例描述了表征以上描述的单一可混溶溶剂法中装配的多药脂质纳米颗粒的另外的研究。说明性的多药脂质纳米颗粒掺入了洛匹那韦(LPN)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV)，并且在灵长类动物中进行体内药代动力学研究，在血浆中确立延长的存在。此外，为了研究令人惊讶的在给予脂质纳米颗粒时高且持续的水平的亲水性药物替诺福韦，进行蔗糖梯度测试，即使在梯度测试中施加剪切力的情况下，仍在纳米颗粒中确立了高水平的药物结合。
根据以下通用方法装配掺入了洛匹那韦(LPN)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV)的多药脂质纳米颗粒：
1.选择一种或两种表18中的疏水性和水不溶性(1类)药物(例如，洛匹那韦和利托那韦)。
2.选择一种或两种表19中列出的亲水性和水溶性(2类)药物(例如，替诺福韦和/或恩曲他滨和/或拉米夫定)。
3.选择赋形剂组合(例如，9份DSPC和1份PEG-DSPE)。
4.制备单相可混溶溶剂，所述可混溶溶剂能够使所选的水不溶性1类药物和水溶性2类药物加上来自步骤3的赋形剂充分溶解。实例包括CHCl3:甲醇:水(65:35:4)；CHCl3:乙醇:水(65:35:4)；CHCl3:丙醇:水(65:35:4)；和CHCl3:己醇:水(65:35:4)。
5.将步骤1、2和3中的组分用步骤4中的可混溶溶剂溶解。
6.将药物(步骤1和2)以及赋形剂(步骤3)和可混溶溶剂(步骤4)在减压下借助热、减压和/或雾化的组合进行干燥，以提供均匀性和干燥效率。
7.将脱水的组合物加热到赋形剂混合物的凝胶至液相转变温度以上(例如，50℃)。
8.制备缓冲盐溶液，并将温度平衡至与脱水组合物相同的温度。
9.将缓冲盐溶液和脱水组合物逐渐组合，并保持在规定的温度下(例如，50℃)3小时。
10.在保持在限定的温度下的同时(在脂质赋形剂的液相中)，通过剪切或迫使通过小孔或加压过滤器装置，使得到的水化的多药脂质纳米颗粒尺寸减小。通常，约10-15次通过提供了直径60-120nm的限定尺寸。
药物与赋形剂的摩尔比通常高，并且对于每3个赋形剂分子(即在步骤3中描述的)，可以在组合中实现多达1个药物分子(即，上述步骤1和2中的药物)。最终产品混合物含有超过70-90％的来自表18(脂溶性；1类)和表19(水溶性；2类)列出的与多药脂质纳米颗粒结合的药物。因此，低分数的游离药物对于治疗应用是允许的，作为使非特异性分布饱和并吸附到组织中的负荷剂量。
在使用可混溶溶剂和被称为单一可混溶溶剂法的再水化控制过程的情况下，另一部分的2类水溶性药剂与得到的脂质纳米颗粒结合。可以注意在下表21中2类药剂结合的改善。这些反映疏水性(1类)和亲水性(2类)药剂的结合的数据在下表20和21中提供。这些表格还提供了由双溶剂法以及使用传统脂质体药物制剂制备的多药脂质纳米颗粒的对比数据。
表20：形成的脂质纳米颗粒中疏水性HIV药物的结合百分比。
a报道的值
b靶向逆转录酶的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)
c HIV靶标：蛋白酶
表21：形成的脂质纳米颗粒中亲水性HIV药物的结合百分比。
a报道的值
b靶向逆转录酶的核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)
c HIV靶标：整合酶
为了评价在报道的表21中稳定的2类药物结合的程度，我们对由洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV)组成的LNP进行蔗糖梯度测试。蔗糖梯度测试离心测试通过密度增加的蔗糖梯度使脂质-药物颗粒沉降以去除未结合的药物，从而使任何未结合的药物与多药脂质纳米颗粒分离。在这些条件下，溶液中的所有游离药物都保持在(或漂浮到)蔗糖密度低的梯度的顶部。具体地，使用5-20％(具有65％缓冲)蔗糖的连续梯度，使脂质-药物颗粒混合物在200,000g下经受离心力4小时。通过该方法，我们能够分离结合和未结合的药物部分。如图10所示，发现大部分水溶性药物TFV与亲脂性LPV和RTV(即，与稳定的脂质纳米颗粒)共沉淀。数据表明这些颗粒在贯穿蔗糖梯度时在剪切力作用下是稳定的。我们估计在颗粒中发现的亲水性药物TFV的结合分数约为75.5％，远远超过TFV与通过混合溶剂制备的LNP的7-30％的结合，或使用脂质体实现的甚至更低的数值(～5％)(表21)。数据表明，多药脂质纳米颗粒在贯穿蔗糖梯度时在剪切力作用下非常稳定，并且包括亲水性药物在内的结合的药物与纳米颗粒保持强结合。注意到，观察到的其他两种药物(LPV和RTV)的多药脂质纳米颗粒结合的百分比与表11中的数据一致。
考虑到图10和表21中的数据，脂质-药物颗粒与脂质体之间的药物负载和药物结合之间存在明显的区别。药物负载是用于稳定不能独自保持在溶液和悬浮液中的药物的脂质分数的量度。药物结合是混合物中发现被颗粒吸收或与颗粒结合的总药物的分数的量度。在这两种评估中，脂质体在最终的脂质-药物颗粒制剂中提供低得多的载药能力和结合的亲水性药物分数。
用这种单一可混溶溶剂法制备的多药脂质纳米颗粒因此明显更稳定并且提供更高的亲水性药物结合程度。不受任何特定理论的束缚，这种效应可能是由于在纳米颗粒的两亲性脂质冠上的结合水的去除。这使得亲水性药物被捕获在脂质纳米颗粒结构表面的该未搅动层内，其主要由疏水性药物和赋形剂组分形成。脂质纳米颗粒形成后不太可能发生这样的捕获。因此，亲水性药物和疏水性药物二者都保持与稳定的脂质纳米颗粒高度结合。
这些结果表明，两种装配方法产生与疏水性药剂高度结合的脂质纳米颗粒。然而，本实施例中描述的单一可混溶溶剂法导致高得多的亲水性药物的结合率。最后，用单一可混溶溶剂法装配的脂质纳米颗粒显示约3:1的脂质与总药物摩尔比，具有高百分比的与形成的脂质纳米颗粒结合的初始溶解药物(疏水性或亲水性)。用上述混合双溶剂法装配的脂质纳米颗粒表现出约3:1至约8:1的脂质与总药物的摩尔比，表明保留较少的总药物的倾向，这最可能归因于与以单一可混溶溶剂法开发的脂质纳米颗粒相比更低的亲水性药物结合程度。
无论如何，与仅能包封有限量的最初与组分脂质组合的水溶性药物的脂质体相比，用单一可混溶溶剂法或混合双溶剂法装配的脂质纳米颗粒显示出高得多的尤其是亲水性药剂的结合。在这方面，脂质体通常仅具有超过10:1的脂质与总药物比，表明最终的脂质体颗粒主要是脂质，这对于形成稳定的具有有限的包封的双层结构是必需的。由于需要绝对数量的脂质分子来形成大而稳定的双层膜，因此脂质体并不能以所公开的脂质纳米颗粒获得的低脂质与药物比(高药物与脂质比)形成。此外，如下文更详细解释的，脂质体在稳定保留显著水平的亲水性(2类)药物分子方面特别差。因此，脂质-药物颗粒与脂质体之间的药物负载和药物结合之间有明显的区别。“药物负载”是用于稳定不能独自保持在溶液和悬浮液中的药物颗粒的脂质分数的量度。“药物结合”是混合物中发现被颗粒吸收或与颗粒结合的总药物分数的量度。在这两种评估中，脂质体在最终的脂质-药物颗粒制剂中提供低得多的载药能力和结合的亲水性药物分数。最终，在相同的脂质体制剂中的不同类型(例如亲水性和疏水性)药剂的组合尚未实现，并且不能提供所公开的脂质纳米颗粒的明显的优点。
也根据以上实施例中更详细地描述的方法表征了这些多药脂质纳米颗粒的物理特征、稳定性和灵长类动物(豚尾猴)中的药代动力学参数。简言之，将25mg/kg的由洛匹那韦、利托那韦和替诺福韦以2:1:3摩尔比使用单一可混溶溶剂法构成的多药纳米颗粒皮下给予四只灵长类动物猕猴(豚尾猴)。随时间推移监测每种单一药物的浓度。如前所说明的，对于所有三种药物，溶液中的游离(未配制)药物在24小时内降至低于可检测水平。然而，如图9A和9B所示，我们发现如所预期的那样，两种疏水性药物如洛匹那韦和利托那韦都提供持续和延长的血浆时程。事实上，如以上在实施例1-4中描述的混合双溶剂LNP的最初研究中所观察到的，来自在单一可混溶溶剂技术中装配的纳米颗粒的持续血浆药物水平的持续时间进一步延长至至少两周而不是一周。此外，如图9C所示，我们发现亲水性替诺福韦(TFV)出乎意料地表现出超过90％的持续血浆药物浓度达两周。考虑到对多药脂质纳米颗粒(由以上在实施例1-4中描述的混合双溶剂法制备的)之前的平衡透析分析显示约9-10％的结合分数，这是令人惊讶的。
为了说明体内增强的性能和稳定性，将这些脂质纳米颗粒(由单一可混溶溶剂法制备的)的灵长类动物研究结果与在以上实施例中描述的组合的双溶剂法和可混溶溶剂法中装配的类似的多药脂质纳米颗粒进行比较。参见表22。值得注意的是，单一可混溶溶剂法导致血浆中药物的额外存在，持续1周至2周的血浆药物水平，反映了所有三种药物TFV、LPV和RTV的血浆半衰期延长。对于两种方法，药代动力学中特别明显的药物暴露和时间延长差异与增加的与LNP结合的TFV分数是平行的。
表22.使用单一可混溶溶剂或双溶剂法制备的抗HIV(3)药物组合洛匹那韦(LPV)、利托那韦(RTV)和替诺福韦(TFV)的物理特征和灵长类动物药代动力学曲线的比较。
根据单一可混溶溶剂法制备的多药-脂质纳米颗粒明显更稳定，并提供更高的亲水性药物结合程度，甚至当掺入另外的不同(疏水性)药剂也是如此。不受任何特定理论的束缚，这被认为是从所形成的脂质纳米颗粒周围的亲水冠区域去除结合水的结果。亲水性冠由位于外表面上的一些纳米颗粒赋形剂提供的大量亲水性结构域建立。在脂质纳米颗粒的装配过程中，这些亲水性结构域为此时存在于溶液中的水溶性药物提供了保护。认为亲水性药物被大量捕获在脂质-药物颗粒表面的这个冠区域内，而纳米颗粒的结构主要由疏水性药物和脂质赋形剂提供。因此，亲水性药物和疏水性药物均保持与负载到由脂质稳定的药物-组合纳米颗粒的多种药物高度结合。典型的纳米颗粒装配方法不能实现这个结果，因为类似的冠区域虽然是亲水性的，但通常是“未搅动的”，这表明由于结构限制，极少发生来自外部环境的预先形成的冠区域的渗透，甚至小的亲水分子也不行。因此，一旦装配，带有疏水性小分子药剂的脂质纳米颗粒不能将疏水剂进一步负载到冠区域中。
为了说明公开的多药纳米颗粒和典型的脂质体制剂之间的结构区别，图8A-8C示意性地描绘了由单一可混溶溶剂法(图8A)和混合双溶剂法(图8B)二者装配的多药纳米颗粒以及脂质体(图8C)的结构。在示出的制剂中，用作为脂质赋形剂的磷脂酰胆碱(PC)脂质和聚乙二醇化(PEG)-脂质和具有显著亲水性结构域的赋形剂构建纳米颗粒和脂质体。颗粒没有按比例表示，并且脂质体没有用层状双层描绘，但这被理解为其结构的一部分。在颗粒表面上的含有聚乙二醇(PEG-脂质)的赋形剂将亲水性药物保留在未搅动的冠中，同时阻止另外的药剂(亲水性或其它的)在装配后进入。如本文所述，将亲水性药物保留在冠区域中的能力要求亲水性和疏水性药物与脂质混合并脱水，然后在再水化期间装配纳米颗粒。如实施例1-4中所述，使用混合的双溶剂实现保留大量的亲水性药剂的纳米颗粒的装配，这相对于不类似地保留亲水性药剂的脂质体有显著提高。相反，脂质体可以将少量的亲水性分子包封在中心内。然而，这通常不能提供大量的稳定保留。此外，脂质体在体内给予时具有已知的稳定性问题。由单一可混溶溶剂法产生的脂质纳米颗粒在未搅动的冠内具有较高程度的亲水性药剂结合，使得药物保留率接近观察到的疏水剂药剂的药物保留率。此外，如蔗糖梯度(参见以下实施例6)所示，这些颗粒看来被赋予了增强的稳定性，其中纳米颗粒在蔗糖梯度离心的剪切力下能够保留高达～85％的亲水性药剂。以混合双溶剂法装配的脂质纳米颗粒在相似的条件下保留约7-20％的亲水性药物，并且脂质体仅保留约3-5％的结合。最终，由于脂质体相对有限的包封亲水性药物的能力和未搅动的冠的排斥，就亲水性药剂的整合和保留的结合而言，这两种类型的脂质纳米颗粒明显优于标准的脂质体。
总的来说，这些数据至少表明(1)脂质-药物颗粒制剂不仅能够高药物负载量，而且能够高水平地将药物与颗粒稳定结合；(2)高水平的结合消除了在给予之前需要将未掺入的药物从制剂中去除的要求，从而简化了制备过程；(3)独特的制剂提供了共同配制具有极端物理特征的药物，即亲脂性和亲水性分子的能力，使得两者可以可靠和有效地一起递送到靶位点；(4)灵活和物理上稳定的脂质-药物结合提供长期行为，这对于医疗用途是重要的；(5)在脂质-药物混合物中具有高载药量的平台是新颖的，并且明显优于文献报道的脂质囊泡制剂或胶团制剂的任何脂质体。
尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变。

Claims (80)

1.一种多药脂质纳米颗粒，其包含：
在25℃下log P大于1的第一小分子药剂；
在25℃下log P小于0的第二小分子药剂；
第一两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；和
第二两亲性赋形剂，其包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域。
2.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的小分子药剂与脂质赋形剂的摩尔比为至少1:10。
3.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第一和第二小分子药剂具有1000克/摩尔或更低的分子量(MW)。
4.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第一小分子药剂选自利匹韦林(RPV)或其前药，依法韦仑(EFV)或其前药，度鲁特韦(DTG)或其前药，茚地那韦(IDV)或其前药，阿扎那韦(ATV)或其前药，利托那韦(RTV)或其前药，和洛匹那韦(LPV)或其前药。
5.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第二小分子药剂选自替诺福韦(TNF)或其前药，恩曲他滨(FTC)或其前药，拉米夫定(3TC)或其前药，雷特格韦(RAL)或其前药，和齐多夫定或其前药。
6.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的第一小分子药剂与第二小分子药剂的摩尔比为约1:20至约20:1。
7.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第一两亲性赋形剂选自磷脂、鞘脂、胆固醇和类固醇衍生物、胆汁酸和衍生物、心磷脂、酰基甘油酯和衍生物、糖脂、酰基肽和脂肪酸。
8.权利要求所述7的多药脂质纳米颗粒，其中所述磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；二棕榈酰磷脂酰胆碱；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；二油酰磷脂酰胆碱；源自蛋、大豆、亚麻籽等的酯交换磷脂；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰甘油；磷脂酰丝氨酸；和磷脂酸。
9.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第一两亲性赋形剂是包含具有至少14个碳的脂肪酸尾部的磷脂。
10.权利要求1所述的多药纳米颗粒，其中所述第一两亲性赋形剂是包含两条脂肪酸尾部的磷脂，其中每条脂肪酸尾部具有一个碳碳双键或没有碳碳双键。
11.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第一两亲性赋形剂具有至少37℃的凝胶至液相转变温度。
12.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述第二两亲性赋形剂为糖蛋白、糖脂、含聚环氧烷的聚合物或含聚环氧烷的脂质。
13.权利要求12所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述含聚环氧烷的脂质选自含聚氧乙烯的脂质和含聚氧丙烯的脂质。
14.权利要求13所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述含聚氧乙烯的脂质是聚乙二醇官能化的磷脂，其中所述聚乙二醇具有约500至约20,000g/mol的数均分子量。
15.权利要求14所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇官能化的磷脂是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(mPEG-2000-DSPE)。
16.权利要求12所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述含聚环氧烷的脂质是包含具有至少14个碳的脂肪酸尾部的磷脂。
17.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的第一两亲性赋形剂与第二两亲性赋形剂的摩尔比为约2:1至约20:1。
18.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的直径为约20nm至约200nm。
19.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中当在生理pH和25℃下的等渗缓冲液中时，所述脂质纳米颗粒包括厚度为约2nm至约15nm的亲水性冠。
20.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒不是脂质体。
21.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒没有固体芯。
22.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中至少75％的第一小分子药剂在pH 7.4和25℃下在24小时后与纳米颗粒保持结合。
23.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中至少8％的第二小分子药剂在pH 7.4和25℃下在24小时后与纳米颗粒保持结合。
24.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中至少75％的第二小分子药剂在pH 7.4和25℃下在24小时后与纳米颗粒保持结合。
25.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中至少70％的组合的第一和第二小分子药剂在pH 7.4和4℃下在8个月后与纳米颗粒保持结合。
26.权利要求1所述的多药脂质纳米颗粒，其中当纳米颗粒经受蔗糖梯度测试时，至少70％的小分子药剂与纳米颗粒保持结合。
27.权利要求26所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述蔗糖梯度测试包括使多药脂质纳米颗粒经受连续的5％-20％蔗糖梯度，并施加200,000g的离心力4小时。
28.一种药物组合物，其包含：
多种如权利要求1-27中一项所述的多药脂质纳米颗粒，和药学上可接受的含水载体。
29.一种药物组合物，其包含：
在25℃下log P大于1的第一小分子药剂；
在25℃下log P小于0的第二小分子药剂；
第一两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；和
第二两亲性赋形剂，其包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域；
其中所述组合物呈干燥粉末形式。
30.一种制备多药脂质纳米颗粒的方法，其包括：
在有机溶剂中溶解在25℃下log P大于1的第一小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质；第二两亲性赋形剂包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域，以提供有机溶剂溶液，其中所述有机溶剂包含与水可混溶的副组分；
在含水溶剂中溶解在25℃下log P小于0的第二小分子药剂，以提供含水溶剂溶液；
混合所述有机溶剂溶液和所述含水溶剂溶液以提供混合溶剂溶液；
从所述混合溶剂溶液去除混合溶剂以提供包含第一小分子药剂、第一两亲性赋形剂、第二两亲性赋形剂和第二小分子药剂的脱水产物；和
在水溶液中再水化所述脱水产物以提供含有多药脂质纳米颗粒的溶液。
31.权利要求30所述的方法，其中所述有机溶剂溶液和所述含水溶剂溶液以至少20:1(v/v)的比例混合。
32.权利要求30所述的方法，其中所述有机溶剂的所述水可混溶的副组分为醇。
33.权利要求32所述的方法，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、己醇和癸醇。
34.权利要求30所述的方法，其中所述有机溶剂的所述水可混溶的副组分为乙腈。
35.权利要求30所述的方法，其中所述有机溶剂还包括选自以下的副组分：氯仿、己烷、癸烷、二氯甲烷及其组合。
36.权利要求30所述的方法，其中所述含水溶剂包含NaHCO3、磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸或其组合。
37.权利要求30所述的方法，其中从单一混合溶剂溶液去除所述有机溶剂和含水溶剂包括真空干燥。
38.权利要求30所述的方法，其中所述脱水产物在至少高于所述两亲性赋形剂的凝胶至液相温度约3℃的温度下在水溶液中再水化。
39.权利要求38所述的方法，将水溶液的温度升高到至少40℃。
40.权利要求30所述的方法，其中混合溶剂相的小分子药剂与赋形剂的摩尔比为至少约1:10。
41.一种制备多药脂质纳米颗粒的方法，其包括：
在包含比例为约20:1至约40:1(v/v)的有机组分和含水组分的可混溶溶剂中溶解：
在25℃下log P大于1的第一小分子药剂，
在25℃下log P小于0的第二小分子药剂，
第一两亲性赋形剂，其中所述第一两亲性赋形剂是包含分子量小于300克/摩尔的亲水性结构域的脂质，和
第二两亲性赋形剂，其包含分子量大于500克/摩尔的亲水性结构域，
去除可混溶溶剂以提供包含第一小分子药剂、第二小分子药剂、第一两亲性赋形剂和第二两亲性赋形剂的脱水产物；
将所述脱水产物加热到高于所述两亲性赋形剂的凝胶至液相转变温度至少3℃的第一温度；和
在水溶液中再水化所述脱水产物，以提供含有多药脂质纳米颗粒的溶液。
42.权利要求41所述的方法，其中所述可混溶溶剂的有机组分包括与水可混溶的副组分。
43.权利要求42所述的方法，其中所述有机组分的水可混溶的副组分为醇。
44.权利要求43所述的方法，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、己醇和癸醇。
45.权利要求42所述的方法，其中所述有机组分的水可混溶的副组分为乙腈。
46.权利要求41所述的方法，其中所述有机组分还包括选自氯仿、己烷、癸烷、二氯甲烷及其组合的副组分。
47.权利要求41所述的方法，其中所述可混溶溶剂的有机组分包括比例为约7:5至约3:1(v/v)的氯仿和醇的混合物。
48.权利要求41所述的方法，其中去除可混溶溶剂包括蒸发、减压干燥、喷雾干燥或其组合。
49.权利要求41所述的方法，其中所述水溶液在再水化步骤期间至少保持在第一温度下。
50.权利要求41所述的方法，其中在再水化步骤之前，将所述水溶液预加热至约第一温度。
51.权利要求41所述的方法，其中所述再水化步骤包括在约第一温度下逐渐组合脱水产物和水溶液，并在第二温度下保持完全组合的脱水产物和水溶液至少约1小时，所述第二温度为至少第一温度。
52.权利要求41所述的方法，其中得到的多药脂质纳米颗粒的小分子药剂与赋形剂的平均摩尔比为至少约1:5。
53.权利要求41所述的方法，其中至少约70％的第一小分子药剂和至少约70％的第一小分子药剂在中性pH下与得到的多药脂质纳米颗粒稳定结合。
54.权利要求30-53中任一项所述的方法，其还包括搅拌包含多药脂质纳米颗粒的水溶液，以降低多药脂质纳米颗粒的尺寸。
55.权利要求54所述的方法，其中所述搅拌步骤包括应用超声处理，通过一种或多种滤器挤出，或机械或水力剪切破碎。
56.权利要求54所述的方法，其中所述搅拌步骤产生多药脂质纳米颗粒，其中按数量计至少90％的脂质纳米颗粒具有约20nm至约200nm的直径。
57.权利要求30-56中任一项所述的方法，其中当在生理pH和25℃下的等渗缓冲液中时，得到的多药脂质纳米颗粒包含平均厚度为约2nm至约15nm的亲水性冠。
58.权利要求30-57中任一项所述的方法，其中第一小分子药剂选自利匹韦林(RPV)或其前药，依法韦仑(EFV)或其前药，雷特格韦(RAL)或其前药，度鲁特韦(DTG)或其前药，茚地那韦(IDV)或其前药，阿扎那韦(ATV)或其前药，利托那韦(RTV)或其前药，以及洛匹那韦(LPV)或其前药。
59.权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述第二小分子药剂选自替诺福韦(TNF)或其前药，恩曲他滨(FTC)或其前药，拉米夫定(3TC)或其前药，雷特格韦(RAL)或其前药，和齐多夫定或其前药。
60.权利要求30-59中任一项所述的方法，其中得到的多药脂质纳米颗粒的第一小分子药剂与第二小分子药剂的平均摩尔比为约1:20至约20:1。
61.权利要求30-60中任一项所述的方法，其中所述第一两亲性赋形剂选自磷脂、鞘脂、胆固醇和类固醇衍生物、胆汁酸和衍生物、心磷脂、酰基甘油酯和衍生物、糖脂、酰基肽和脂肪酸。
62.权利要求61所述的方法，其中所述磷脂选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；二棕榈酰磷脂酰胆碱；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；二油酰磷脂酰胆碱；源自蛋、大豆、亚麻籽等的酯交换磷脂；和被磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸取代的磷脂酰胆碱。
63.权利要求61所述的方法，其中所述第一两亲性赋形剂是包含具有至少14个碳的脂肪酸尾部的磷脂。
64.权利要求30-63中任一项所述的方法，其中所述第二两亲性赋形剂为糖蛋白、糖脂、含聚环氧烷的聚合物或含聚环氧烷的脂质。
65.权利要求64所述的方法，其中所述含聚环氧烷的脂质选自含聚氧乙烯的脂质和含聚氧丙烯的脂质。
66.权利要求65所述的方法，其中所述含聚氧乙烯的脂质是聚乙二醇官能化的磷脂，其中所述聚乙二醇具有约500至约20,000g/mol的数均分子量。
67.权利要求66所述的方法，其中所述聚乙二醇官能化的磷脂是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(mPEG-2000-DSPE)。
68.权利要求64所述的方法，其中所述含聚环氧烷的脂质是包含具有至少14个碳的脂肪酸组分的磷脂。
69.权利要求30-68中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的第一两亲性赋形剂与第二两亲性赋形剂的摩尔比为约2:1至约20:1。
70.权利要求30-68中任一项所述的方法，其中溶于溶剂中的所述第一两亲性赋形剂与第二两亲性赋形剂的摩尔比为约2:1至约20:1。
71.权利要求30-70中任一项所述的方法，其中所述水溶液是缓冲盐溶液。
72.一种多药脂质纳米颗粒，其通过权利要求30-71中任一项所述的方法制备。
73.权利要求1-27或72中任一项所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述多药脂质纳米颗粒是pH响应性的。
74.权利要求73所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述pH响应性包括在较低环境pH下释放升高量的结合的小分子药剂的特征。
75.权利要求1-27或72-74中任一项所述的多药脂质纳米颗粒，其中所述多药脂质纳米颗粒在给予哺乳动物受试者后赋予与给予哺乳动物受试者相同量的游离小分子药剂相比延长的第一小分子药剂和第二小分子药剂的血浆浓度。
76.一种治疗感染HIV的受试者的方法，其包括给予有效量的权利要求1-27和72-75中任一项所述的纳米颗粒，或给予有效量的权利要求28-29中任一项所述的药物组合物。
77.权利要求76所述的方法，其中所述给予是皮下的(SC)、静脉内的(IV)或肌内的(IM)。
78.权利要求76所述的方法，其中所述病毒载量在受试者的淋巴组织中可检测地降低。
79.权利要求76所述的方法，其中所述第一小分子药剂和第二小分子药剂在给予后在血浆或淋巴组织中保持可检测超过7天。
80.权利要求76所述的方法，其中所述第一小分子药剂和第二小分子药剂在给予后在血浆或淋巴组织中保持可检测超过14天。
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