CN107686169A - 蛋白质介体‑漆酶体系降解双酚a的方法 - Google Patents
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Abstract
一种蛋白质介体‑漆酶体系降解双酚A的方法，通过构建漆酶‑血红蛋白复合酶体系，在常温下对水体中双酚A进行降解，并通过光学方法检测降解效果。本发明利用血红蛋白(Hemoglobin，Hb)提升漆酶活性，有效降低了漆酶的投入，提高生物降解双酚A的反应速率，克服了传统介体存在潜在毒性的二次污染威胁，具有良好的环境保护效果。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种酶法水污染防治领域的技术，具体是一种蛋白质介体-漆酶体系降解双酚A的方法。
背景技术
双酚A(Bisphenol A，BPA)作为增塑剂广泛存在于环氧树脂和聚碳酸脂塑料生产，2015年中国双酚A的产能为77万吨。虽然这两年中国双酚A产能扩张速度有所减缓，但据安迅思统计数据，中国双酚A产能近期将达到143万吨/年。据调查，2003～2004年武汉东湖双酚A含量为15.1～62.6μg/L，2003年天津海河双酚A含量为19～83ng/L,2005～2006年珠江水系为44～64ng/L，2013年上海黄浦江为23ng/L。双酚A是一种内分泌干扰物，具有雌激素的生物学功能，对女性生殖系统产生较大影响。研究表明双酚A对睾丸、前列腺的发育和乳腺癌的发展有影响，减少精子产生、生物体女性化和减弱鸟类、鱼类及哺乳类的生育能力。因此，大规模的工业生产和塑料制品广泛使用造成了环境中双酚A快速积累，达到了危害人体健康的水平。
近年来，利用酶特异性转化污染物的方法日益受到人们的关注。特别是一些不能利用传统方法，如在水环境中的痕量污染物，可以利用酶法特异性去除。漆酶(Laccase，Lac，EC 1.10.3.2)属于多铜氧化酶家族，可以催化氧化酚类和非酚类芳香族化合物及其衍生物，已经被广泛用于降解或解毒工业废水中的环境有机污染物。漆酶催化氧化反应条件温和、电子受体为空气中的氧气且产物为水，被认为是理想的绿色催化剂。漆酶具有三个铜离子结合位点，结合了4个铜离子，其中T1铜位点为底物的反应场，主要功能是将底物上的电子通过保守的His-Cys-His转移到到三铜中心(TNC)，三铜中心(TNC)为活性中心，经历2个2e-步骤将氧气还原成水。
虽然漆酶具有广谱的底物特征，但不同于专用酶的是氧化能力相对较慢，需要介体的协助来提高反应速率。有机小分子介体的发现扩展了漆酶底物的选择性，常用介体包括2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1-羟基苯并三氮唑(HBT)、2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)和紫尿酸(violuric acid)等等在酶法催化有机合成中得到广泛应用，但小分子介体存在价格昂贵和生物毒性等缺点，在环境保护中尚未得到推广。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种蛋白质介体-漆酶体系降解双酚A的方法，利用血红蛋白(Hemoglobin，Hb)提升漆酶活性，有效降低了漆酶的投入，提高生物降解双酚A的反应速率，克服了传统介体存在潜在毒性的二次污染威胁，具有良好的环境保护效果。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种蛋白质介体-漆酶体系降解双酚A的方法，通过构建漆酶-血红蛋白复合酶体系，在常温下对水体中双酚A进行降解，并通过光学方法检测降解效果。
所述的漆酶优选为白腐菌T.versicolor商品漆酶。
所述的血红蛋白优选为牛血红蛋白。
所述的漆酶-血红蛋白复合酶体系，通过以下方式构建：将漆酶和血红蛋白按10:1的摩尔比例混合后加入到含双酚A水溶液中，反应在常温下进行。
所述的含双酚A水溶液优选为pH中性。
所述的光学方法是指：通过检测紫外-可见光光谱并采用高效液相色谱法检测降解后的底物消耗和产物生成。
技术效果
与现有技术相比，本发明通过血红蛋白提高漆酶催化活性，缩短漆酶降解双酚A的反应时间，该血红蛋白从动物体内提取而来，具有获取容易且成本低的优点；此外，本发明通过紫外-可见光光谱和高效液相色谱法双重手段，有助于真实检测水污染物中双酚A及产物的浓度。
附图说明
图1为实施例1检测实验示意图；
图中：(A)紫外-可见光光谱检测漆酶-血红蛋白体系催化氧化双酚A的动力学实验；(B)表示通过NMF-ALS分解得到底物和产物的光谱信息；(C)表示双酚A产物随时间的相对浓度变化。
图2为实施例2检测实验示意图；
图中：(A)HPLC检测漆酶-血红蛋白体系催化氧化双酚A；(B)双酚A随时间含量变化；(C)双酚A降解产物随时间的相对浓度变化。
图3为实施例3检测实验示意图；
图中：紫外-可见光光谱检测漆酶-血红蛋白体系催化氧化双酚A的动力学实验(室温，中性pH)。
图4为双酚A(BPA)降解效率示意图。
具体实施方式
实施例1
紫外检测漆酶-血红蛋白体系降解双酚A
步骤1：取500μL的1mM双酚A加入到1.4mL的50mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，以加入50μL的17μM漆酶(1mg/mL)和10μL的1.7μM血红蛋白(0.1mg/mL)作为实验组，加入50μL的17μM漆酶或10μL的1.7μM血红蛋白作为对照组，以水补足至2mL。
步骤2：反应在37℃下进行。使用紫外-可见分光光度计(Agilent 8453)对反应液进行全波长扫描(190-1100nm)，扫描时长5min，间隔0.5s，重复三次实验。
步骤3：使用非负矩阵分解(NMF)和最小二乘法(ALS)方法对紫外动力学数据进行解析，这里对双酚A动力学数据进行两组分分解，即认为在反应液中含有一种底物和一种产物。
如图1所示，底物的吸收波长在280nm，产物的吸收波长在300-400nm之间，血红蛋白-漆酶体系相对于单独漆酶的活性有显著上升。
实施例2
HPLC进一步确定双酚A的降解水平
步骤1：取75μL的1mM双酚A加入到1.4mL的50mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，以加入10μL的17μM漆酶和10μL的1.7μM血红蛋白作为实验组，加入10μL的17μM漆酶或10μL的1.7μM血红蛋白作为对照组，以水补足至1.5mL。
步骤2：反应在37℃下进行，分别在0min、5min、10min和20min取100μL反应液，加入300μL乙腈终止反应。
步骤3：取10μL终止反应液进行高效液相色谱-荧光法(Agilent 1200HPLC)检测。激发波长为275nm，发射波长为305nm。柱子选择为4.6×150mm,5μm,Eclipae XDB-C18,Agilent,USA，流动相为66％的乙腈和34％的0.01mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH为4.5)。
如图2，双酚A的出峰时间为15.4min，产物的出峰位置为2.5min，以峰面积计算底物和产物的浓度。血红蛋白-漆酶体系20min降解22.5％的双酚A，单独漆酶20min降解12.2％的双酚A，血红蛋白-漆酶相对于单独漆酶活性提高84.4％。就产物生成而言，血红蛋白-漆酶在20min内的产物生成水平比单独漆酶提升了54.2％。
实施例3
漆酶-血红蛋白体系在常温、pH中性条件下降解双酚A
步骤1：取2mL的0.1mM双酚A(pH为中性，即以ddH2O溶解)，以加入10μL的17μM漆酶(1mg/mL)和10μL的1.7μM血红蛋白(0.1mg/mL)作为实验组，加入10μL的17μM漆酶或10μL的1.7μM血红蛋白作为对照组。
步骤2：反应在常温(25℃)下进行。使用紫外-可见分光光度计(Agilent 8453)对反应液进行全波长扫描(190-1100nm)，每隔1h扫描一次，重复三次实验。
如图3，血红蛋白-漆酶体系催化氧化双酚A在3h反应已经停止，单独漆酶催化速率较慢，反应在5h仍在继续，血红蛋白-漆酶体系相对于单独漆酶的活性提升了106.3％。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
Claims (9)
1.一种蛋白质介体-漆酶体系降解双酚A的方法，其特征在于，通过构建漆酶-血红蛋白复合酶体系，在常温下对水体中双酚A进行降解，并通过光学方法检测降解效果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的漆酶为白腐菌T.versicolor商品漆酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的血红蛋白为牛血红蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的漆酶-血红蛋白复合酶体系，通过以下方式构建：将漆酶和血红蛋白按10:1的摩尔比例混合后加入到含双酚A水溶液中，反应在常温下进行。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含双酚A水溶液为pH中性。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的光学方法是指：通过检测紫外-可见光光谱并采用高效液相色谱法检测降解后的底物消耗和产物生成。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征是，使用紫外可见光光度计和高效液相色谱对双酚A浓度进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，通过非负矩阵分解-交替最小二乘法方法对双酚A的动力学数据进行两组分分解。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，取10μL漆酶-血红蛋白体系处理后的双酚A反应液，使用高效液相色谱-荧光法进行检测：激发波长为275nm，发射波长为305nm；检测柱为4.6×150mm,5μm,Eclipae XDB-C18,Agilent,USA，流动相为66％的乙腈和34％的0.01mM的醋酸-醋酸钠缓冲液pH为4.5。
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|---|---|---|---|---|
| CN110038249A (zh) * | 2019-04-24 | 2019-07-23 | 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所 | 一种促进除草剂降解的方法 |
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2017
- 2017-08-31 CN CN201710768246.7A patent/CN107686169A/zh active Pending
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