CN107683133A - 包含聚合物‑脂质混杂微粒的药物递送组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包括三维多孔微粒的干燥组合物，其中所述微粒包括：(i)活性物质(例如水溶性差的药物)，(ii)聚合物纳米颗粒，比如由生物相容性和/或可生物降解的聚合物(例如PLGA聚合物)组成的聚合物纳米颗粒，(iii)脂滴(例如中链甘油三酯(MCT)的液滴)，(iv)纳米颗粒稳定剂如PVA或DMAB，和任选的(v)冷冻保护剂(例如甘露醇)；其中所述活性物质由所述纳米颗粒和/或脂滴携带。本发明的组合物可以配制成例如用于治疗和/或预防各种疾病或病症(例如人或兽医治疗)的药物。所述组合物的单个微粒的平均直径可以是2.5‑3.5μm的量级，其特别适合于肺部给药。

Description

包含聚合物-脂质混杂微粒的药物递送组合物

技术领域

本发明涉及用于向受试者递送活性物质(例如药剂比如药物，或其它生物活性分子包括蛋白质和肽)的新型组合物。

优先权文件

本申请要求于2015年3月11日提交的题为“新型药物递送组合物(Novel drugdelivery composition)”的澳大利亚临时专利申请号2015900861的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

通过引用并入

本说明书中引用以下出版物，其内容通过引用整体并入本文：

Rao JP and KE Geckeler.Polymer nanoparticles:Preparation techniquesand size control.Prog Polym Sci 36:887-913(2011)[37]；和

Makadia HK and SI Siegel.Poly Lactic-co-Glycolic Acid(PLGA)asBiodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.Polymers 3:1377-1397(2011)[38]。

背景技术

纳米技术研究面临的主要挑战是开发更智能和更强大的载体用于有效递送药剂。特别地，通常需要配制具有纳米载体的复合药剂如蛋白质、肽和亲脂性分子，以克服物理化学限制，从而达到分子的全部药用潜力[1]。为此目的，基于脂质的组合物(例如脂质体和固体脂质纳米颗粒)的封装药剂受到了最广泛的研究，并且确实已经在某些药物递送应用中采用了这种类型的一些组合物(例如水溶性差的药物、抗癌制剂和疫苗接种的口服递送)。但是，即使基于脂质的组合物可以提供高水平的生物相容性、有利的药代动力学曲线和相对简单的制造，迄今为止，由于封装药剂的不稳定性、载药量不足和/或特征性“突(burst)”释曲线使得这些组合物的临床应用有所限制[2-6]。

用纳米载体配制药剂的替代方法包括使用聚合物纳米颗粒。已经研究了这样的纳米颗粒用于包封溶解性和渗透性差的药剂，并且发现在生物流体中提供更高水平的稳定性(即相对于基于脂质的体系)，同时以有效的药物递送方式提供可控制的药剂释放速率的可能性。但是，许多聚合物纳米颗粒的生物相容性不如脂质体系高[7-9]，因此，相当多的研究工作致力于制造新型纳米结构载体体系，其可以将基于脂质的体系与那些聚合物纳米颗粒的优点相结合，同时最小化两种纳米载体的物理化学和生物学限制。

最近报道了大量的“混杂(hybrid)”聚合物-脂质纳米复合物，旨在解决多方面的药物递送挑战[10-13,45]。最普遍制造的混杂颗粒类型通常由通过两步法组装的脂质壳-聚合物核结构组成，其中阴离子聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)纳米颗粒与阳离子脂质体以所需比例混合[1,14,15]。但是，也存在单步法，其最小化物理化学性质的批次间变化。这种方法在纳米颗粒合成中使用磷脂作为乳化剂，导致脂质包被的聚合物纳米颗粒自组装[11,16]。PLGA是FDA批准的可生物降解的聚合物，由于它的生物相容性，其在聚合物-脂质混杂体的领域中受到了最广泛的关注[17]。PLGA-脂质混杂体的脂质壳-聚合物核形态已经证明了几个优于常规递送系统的潜在优点，例如用于高摄取的可控粒度、用于靶向递送的表面功能、高载药量、用于组合疗法的多种药剂的捕获和“可调的(tuneable)”药物释放曲线[12]。但是，关于脂质组分的稳定性和包封在脂质壳内的试剂的突释曲线在这样的系统中仍然存在限制。

先前，本申请人开发了新型纳米结构脂质载体系统，其由封装在三维多孔二氧化硅基质或凝聚层中的脂质组成；提供二氧化硅-脂质混杂(SLH)微粒[18-20]。这些SLH微粒可以通过喷雾干燥二氧化硅稳定的乳液来制备，除水过程诱导二氧化硅颗粒聚集成海绵状基质，由此油滴通过亲脂性的带负电荷或带正电荷的表面活性剂而附着[21]。表面活性剂电荷会影响干燥的SLH微粒的纳米结构，这是由于当皮克林(Pickering)乳液中电荷中和作用机制生效时纳米颗粒的稳定效应得到提高[18]。由于消化酶、脂肪酶对三维二氧化硅基质吸附的脂质的增强的和受控的消化，因此SLH微粒溶解度增加，许多亲脂性药物的口服吸收显示出增加[22-24]。脂质增加的界面表面积、亲水二氧化硅的结合支持和消化产物减弱的干扰作用显示出增强脂肪酶在SLH微粒中的吸附和作用[25]。但是，固体基质载体的表面化学性质对包封的脂质的消化率的确切影响尚未完全清楚。

可以通过固体纳米颗粒与中链甘油三酯(MCT)形成稳定乳液的能力来首先控制吸附脂质的多孔三维基质形成混杂微结构的能力。由于使用PVA作为稳定剂，具有轻微负表面电荷的PLGA纳米颗粒已经显示出通过油-水界面形成弱相互作用而赋予一系列非极性油动力学稳定的能力[26]。在本文中，本申请人研究了聚合物纳米颗粒(例如PLGA纳米颗粒)的稳定和受控递送特征是否可以有效地与脂滴的增溶作用结合，以通过喷雾干燥过程形成具有新型聚合物纳米颗粒壳-脂质核结构的干燥聚合物(纳米颗粒)-脂质混杂(PLH)微粒。此外，本申请人在喷雾干燥步骤中研究了冷冻保护剂(例如甘露醇)的用途，并鉴定出其它形式的干燥PLH微粒，其包含冷冻保护剂(即聚合物(纳米颗粒)-脂质-冷冻保护剂混杂(PLCH)微粒)，具有由聚合物纳米颗粒、脂滴和冷冻保护剂的三维基质(或者，换句话说，凝聚层)组成的新型结构。

发明内容

在第一方面，本发明提供包含三维多孔微粒的干燥组合物，其中所述微粒包括：(i)活性物质，(ii)聚合物纳米颗粒，(iii)脂滴，(iv)纳米颗粒稳定剂，和可选的(v)冷冻保护剂；其中所述活性物质由所述纳米颗粒和/或脂滴携带。

通常，所述活性物质是药剂诸如药物(特别是水溶性差的药物)或其它生物活性分子(例如蛋白质，比如抗体或抗体片段)。

所述聚合物纳米颗粒优选包括生物相容的和/或可生物降解的聚合物，例如PLGA聚合物。

所述脂滴优选包括中链甘油三酯(MCT)。

所述纳米颗粒稳定剂优选选自聚乙烯醇(PVA)和双十二烷基二甲基溴化铵(DMAB)。

可选的冷冻保护剂可以选自甘露醇、麦芽糖糊精、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖醇。

所述组合物的微粒优选不由如先前描述的混杂聚合物-脂质纳米复合物中所见的脂质壳-聚合物纳米颗粒核结构[1,14,15]组成。

优选地，本发明的组合物通过包括喷雾干燥水包油(o/w)乳液的方法制备，该水包油(o/w)乳液包括脂滴和在水相中的聚合物纳米颗粒。

在第二方面，本发明提供了向受试者(subject)施用活性物质的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用根据第一方面的组合物。

所述组合物可以配制成用于口服、鼻腔、肺部、肌肉内或皮下给药至受试者的药物。

在第三方面，本发明提供了制备根据第一方面的组合物的方法，其中所述方法包括喷雾干燥乳液，该乳液包括脂滴和在水相中的聚合物纳米颗粒。

在第三方面的方法的实施方案中，所述方法包括提供所述乳液，该乳液包括脂滴和在水相中的聚合物纳米颗粒，然后通过喷雾干燥除去水相。

附图说明

图1提供了根据本发明的聚合物-脂质混杂(PLH)微粒的两步制备方法的示意图。(A)油相：带有溶解的阴离子乳化剂的MCT(10wt％)、卵磷脂(0.6wt％)以及通过乳液-扩散-蒸发制备的PLGA纳米颗粒(相对于油为80wt％)分散在水中。(B)形成PLGA稳定的乳液(注意：带正电荷的PLGA纳米颗粒覆盖带负电荷的脂滴，带负电荷的PLGA纳米颗粒由于静电而微弱覆盖脂滴)。(C)将甘露醇溶液(相对于PLGA纳米颗粒为20wt％)分散在乳液中。(D)形成PLGA-甘露醇稳定的乳液；由于zeta电位的增加，在乳液界面上带负电荷的PLGA纳米颗粒的覆盖增加。(E)将乳液喷雾干燥，分别在不存在和存在甘露醇的情况下形成干燥的PLH和PLCH微粒；

图2提供的图形结果示出了：(A)在添加10mM NaCl的情况下，zeta电位作为(◇)PLGA-1纳米颗粒、(Δ)PLGA-2纳米颗粒和(▲)用卵磷脂稳定的亚微米乳液的pH的函数；和(B)在添加10mM NaCl的情况下，zeta电位作为(■)PLMH-1、(●)PLH-1、(○)PLMH-2和(□)PLH-2微粒分散体的pH的函数；

图3提供了共焦激光扫描显微镜(CLSM)横截面图像和扫描电子显微照片(SEM)图像，证明了PLH-1(A和B)和PLMH-1微粒的表面形态和聚集性质的差异。SEM图像示出了：(A)单个PLH微粒的大聚集体，(B)显示PLH微粒的表面形态的特写图像，(C)PLCH微粒的最小聚集，以及(D)显示PLCH微粒的表面形态的特写图像；

图4提供了说明(●)PLH-1、(○)PLH-2、(■)PLMH-1和(□)PLMH-2微粒混合在消化介质中60分钟内的重构性质的图形结果；

图5提供的图形结果示出了，相对于乳液体系中的脂质含量，以(Δ)0wt％、(X)10wt％和(*)50wt％，向水相中加入PLGA纳米颗粒时，(A)PLGA-1纳米颗粒和(B)PLGA-2纳米颗粒对亚微米MCT乳液的消化曲线的影响。插图；通过60分钟内平均粒度的增加，PLGA纳米颗粒(50wt％)和乳液液滴的颗粒团聚表现出来；

图6提供的图形结果示出了在空腹状态下在3小时消化期间(□)PLH-1微粒、(○)PLH-2微粒、(■)PLMH-1微粒、(●)PLMH-2微粒和(▲)亚微米乳液中的MCT的脂肪酶介导的消化动力学。插图；伪一级拟合的品质；

图7提供的图形结果示出了根据本发明的微粒脂解的动力学作为在消化介质中搅拌30分钟后颗粒再分散百分比的函数：30分钟后的脂质水解程度(圆形，左轴)和伪一级速率常数k(正方形，右轴)；

图8提供了在消化介质中再分散0、5和60分钟的PLH和PLCH微粒的CLSM横截面图像和示意图。与PLH微粒相比，PLCH微粒中再分散度明显较高，因粒度和脂质含量随着时间的推移而显著降低。示意图：PLGA＝中灰色，脂质＝浅灰色，均匀圆形液滴形状，甘露醇＝深灰色点。比例尺＝10μm；

图9提供了水溶性差的药物桂利嗪(cinnarizine)(CIN)的释放作为时间的函数的图形结果：(A)在0.1％SLS溶液中，(■)带负电荷的PLCH微粒、(▲)亚微米乳液、(X)带负电荷的PLGA-1纳米颗粒和(带虚线)纯CIN药物；和(B)在模拟胃条件(≤60分钟)和模拟肠道条件(≥60分钟)下(■)带负电荷的PLCH微粒、(▲)带负电荷的PLGA纳米颗粒和(◆)纯药物的两步溶出；

图10提供了CIN释放到0.1％SLS溶液中的进一步的图形结果，示出了电荷对PLH/PLCH微粒组合物的影响以及在PLCH微粒中冷冻保护剂甘露醇的存在的影响：(■)带负电荷的PLCH微粒、(▲)带正电荷的PLCH微粒、(●)带负电荷的PLH微粒和(◆)带正电荷的PLH微粒；和

图11提供了CIN释放到0.1％SLS溶液中的图形结果，其示出了用低分子量PLGA替代高分子量PLGA的效果。这些研究中使用的组合物是具有(■)高分子量PLGA(MW＝30000-60000)和(▲)低分子量PLGA(MW＝7000-17000)的带负电荷的PLCH微粒；

图12提供了在0.1％SLS溶液中CIN释放研究的结果，示出了在组合物中用长链长度甘油三酯(LCT)替代中链长度甘油三酯(MCT)的效果。这些研究中使用的组合物是用(■)MCT和(▲)LCT配制的带负电荷的PLCH微粒；和

图13提供了与含有二氧化硅的脂质组合物对比的来自基于PLH微粒的组合物的CIN的24小时药代动力学曲线：PLH(■)、二氧化硅-脂质混杂微粒组合物(●)和二氧化硅稳定的立方体(cubosomes)(▼)。剂量标准化为10mg/kg，并绘制为平均血浆浓度±SEM，n＝4。

具体实施方式

通过喷雾干燥聚合物(例如PLGA)纳米颗粒稳定的脂质乳液，制备包括聚合物纳米颗粒和脂质的新型微粒。所得到的混杂微粒表现出三维多孔性能(即包括内部孔隙)，使其能够用于例如将活性物质(例如药剂比如药物或其它生物活性分子)递送至受试者的组合物。通过在喷雾干燥之前在乳液中包含冷冻保护剂(例如甘露醇)，三维多孔性能能够增加，因微粒的内部孔隙率增加。

在第一方面，本发明提供包括三维多孔微粒的干燥组合物，其中所述微粒包括：(i)活性物质，(ii)聚合物纳米颗粒，(iii)脂滴，(iv)纳米颗粒稳定剂，和可选的(v)冷冻保护剂；其中所述活性物质由所述纳米颗粒和/或脂滴携带。

所述组合物可以包括干物质，其包括松散的、聚集的和/或部分聚集的微粒。“干燥组合物”，应当理解所述组合物包括少于约10重量％(wt％)的水，更优选少于约5wt％。因此，所述组合物通常由不需要抗结块剂(例如碳酸钙和粉末状纤维素)的自由流动的粉末组成。

在不存在冷冻保护剂的情况下，所述微粒通常包括1至10μm范围内的平均直径尺寸。但是，优选地，所述微粒将包括2至5.5μm范围内的平均直径尺寸。使用扫描电子显微镜(SEM)，单个微粒通常具有光滑的球形形态，而共焦激光扫描显微镜(CLSM)表明微粒由包封在纳米颗粒的固体外壳内的脂滴组成(参见图1)。这些微粒可以以大的聚集体(例如，具有在例如20至100μm的范围内的平均最大尺寸)的形式存在于组合物中。以下，将缺少冷冻保护剂的微粒称为聚合物(纳米颗粒)-脂质混杂(PLH)微粒。

在存在冷冻保护剂的情况下，所述微粒也通常包括1至10μm范围内的平均直径尺寸。但是，在这种情况下，所述微粒将优选包括2至6μm范围内的平均直径尺寸。使用扫描电子显微镜(SEM)，单个微粒通常具有大致的球形形态，而共焦激光扫描显微镜(CLSM)表明微粒由聚合物纳米颗粒、脂滴和冷冻保护剂的三维基质(或者换句话说，凝聚层)组成(即，没有像在PLH微粒中观察到的聚合物纳米颗粒壳-脂质核结构)。这些微粒可以大量以单个微粒(即，具有最小的聚集)的形式存在于组合物中。以下，将包含冷冻保护剂的微粒称为聚合物(纳米颗粒)-脂质-冷冻保护剂混杂(PLCH)微粒。PLCH微粒(即纳米颗粒)的再分散性似乎明显大于PLH微粒的再分散性。

因此，根据本发明的微粒不由脂质壳-聚合物纳米颗粒核结构(即，如先前描述的混杂聚合物-脂质纳米复合物中所见)[1,14,15]组成。

所述微粒是多孔的，平均孔径通常在25-500nm的范围内。PLCH微粒的内部孔隙率似乎比PLH微粒的内部孔隙率更高。

所述微粒可以是带正电荷或带负电荷的，或者是中性的。

所述活性物质通过聚合物纳米颗粒和/或脂滴携带在组合物中。通过“携带”，应当理解，活性物质可以溶解在聚合物纳米颗粒和/或脂滴中，和/或以其它方式相关联(例如活性物质可以完全或部分地吸附到纳米颗粒的表面)；使得活性物质可以从纳米颗粒和/或脂滴中释放(例如降解和/或扩散后)。

活性物质可以选自例如营养物质、化妆品物质(包括防晒剂和UV吸收分子)、农药化合物、农用化学品和食品。但是，更典型地，活性物质是药剂比如药物或其它生物活性分子(例如，蛋白质比如抗体或抗体片段，肽比如疫苗意义的抗原肽，或核酸分子比如反义寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA))。

本发明的组合物特别适用于向受试者递送水溶性差的(即亲脂性)药物。本领域技术人员将水溶性差的药物理解为化合物，其中低水溶性是药物通过胃肠道(GIT)吸收到血液中的主要障碍。因此，所述药物的口服生物利用度是有限的。

活性物质可以是难溶性药物化合物，例如由以下组成的组中的那些：

抗炎剂包括塞来昔布(4-[5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺)、吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1-H-吲哚-3-乙酸)，伐地考昔(4-(5-甲基-3-苯基异恶唑-4-基)苯磺酰胺)、美洛昔康((8E)-8-[羟基-[(5-甲基-1,3-噻唑-2-基)氨基]亚甲基]-9-甲基-10,10-二氧代-10λ⁶-硫杂-9-氮杂双环[4.4.0]癸-1,3,5-三烯-7-酮)、罗非考昔(4-(4-甲磺酰苯基)-3-苯基-5H-呋喃-2-酮)、双氯芬酸(2-(2-(2,6-二氯苯氨基)苯基)乙酸))、萘普生((+)-(S)-2-(6-甲氧基萘-2-基)丙酸)及它们的组合；

抗癌剂如紫杉醇、7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)、依托泊苷、泰索帝、多西紫杉醇、替莫唑胺及它们的组合；

止吐药如桂利嗪((E)-1-(二苯基甲基)-4-(3-苯基丙-2-烯基)哌嗪)；

维生素及其衍生物，包括维生素B、维生素D、视黄醇(维生素A)和视黄酸；

抗生素包括四环素、利福平、克拉霉素、红霉素及它们的组合；

抗精神病药物包括齐拉西酮、阿立哌唑等；和

心血管药物比如他汀类药物等。

活性物质，特别是那些水溶性差的药物，可以存在于组合物中在聚合物纳米颗粒和/或脂滴内(和/或表面)。因此，所述组合物能够实现药物可能的两阶段释放(例如，药物可以在第一阶段中首先从聚合物纳米颗粒中释放，然后在第二阶段从脂滴中释放，或反之亦然)，或释放两种不同的药物(例如联合治疗)。在用于联合治疗的组合物的一个实施例中，第一活性物质可以是存在于聚合物纳米颗粒内(和/或表面上)的塞来昔布，而第二活性物质是溶解在脂滴中的抗癌剂(如泰索帝、多西他赛和替莫唑胺)。

适用于本发明组合物的聚合物纳米颗粒可以选自本领域技术人员熟知的那些。实例包括：聚酯(例如聚(乳酸))酸(PLA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚丙烯酸(PAA)、聚乙烯醇(PVA)等)；聚酰胺(例如聚对苯二甲酰对苯二胺和聚[亚氨基(1,6-二氧六亚甲基)亚氨基六亚甲基))；共聚物(例如聚(丙交酯)-嵌段-聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(丙交酯)(PEO-PLA))；及它们的混合物。其它合适的聚合物纳米颗粒如聚(氧乙烯乙二醇)聚合物(POP)、聚(乙二醇)-聚(丙交酯)(PEG-PLA)、聚己内酯(PCL)和聚苯乙烯(PS)共聚物，及它们的制备方法由Rao和Geckeler描述[37]；Rao和Geckeler全部的公开内容[37]通过引用并入本文。

优选地，所述聚合物纳米颗粒将是生物相容的和/或可生物降解的。术语“生物相容的”，本领域技术人员将会理解，当将纳米颗粒给药到受试者时不会产生任何显著的副作用[41]。术语“可生物降解的”，本领域技术人员将会理解，当将纳米颗粒给药到受试者时，纳米颗粒通过体内的水解和/或酶解过程被破坏(即降解)[41]。因此，聚合物纳米颗粒可优选选自PLA、PLG、PLGA、PCL、壳聚糖、几丁质、明胶、聚氰基丙烯酸酯(PCA)和聚烷基-氰基丙烯酸酯(PACA)聚合物。但是，最优选地，聚合物纳米颗粒包括PLGA聚合物。

由于其生物相容性和生物降解性，PLGA聚合物已广泛用于制备引入到受试者的材料，例如药物递送器械和组织工程支架[38]。PLGA还具有“可调的机械性能”(例如通过控制相关参数，比如聚合物分子量，丙交酯与乙交酯的比例和药物浓度等，可以控制药物剂量和从PLGA载体释放的释放曲线)，以及如上所述是经FDA批准的[38]；PLGA聚合物可生物降解成生物相容的降解产物。特别地，PLGA通过水解(和可能的一些酶作用[38])降解成乳酸和乙醇酸。转而，乳酸进入三羧酸循环，经过代谢并最终以二氧化碳和水从身体排出[39]，而乙醇酸被认为在肾脏中不变地排泄，或者像乳酸，通过三羧酸循环，其经过代谢并最终作为二氧化碳和水从体内排出。Makadia和Siegel[38]综述了适合制备用于本发明的聚合物纳米颗粒的可生物降解的PLGA聚合物，以及它们的合成和尤其是制造成PLGA聚合物纳米颗粒的方法；Makadia和Siegel全部的公开内容[38]通过引用并入本文。一些具体实施例包括具有比例为50:50、65:35、75:25和85:15的聚乳酸(PLA)/聚乙醇酸(PGA)的PLGA聚合物。此外，PLGA共聚物也是合适的。例如，二嵌段PLGA/PEG共聚物(PLGA-PEG)和三嵌段PLGA/PEG/PLGA共聚物是合适的，并且可以提供增加的储存稳定性的附加益处[38]。

对于PLGA聚合物，通常，PLGA中聚乙醇酸的含量越高，降解速度越快(例如，PLGA50:50比65:35降解速度快，依次比75:25等降解更快)[38]，因为随着PGA含量的增加，PLGA的亲水性增加(从而通过水解导致更快的降解)。同样，随着亲水性的增加(和疏水性降低)，由于脂肪酶的抑制，通过脂解作用而降解的组合物脂滴含量将会降低。另一方面，使用具有较高分子量的可生物降解的聚合物通常会表现出较低的降解速率。本发明中使用的聚合物，特别是使用PLGA聚合物时，可以具有例如5-100kDa，更优选25-75kDa，最优选30-60kDa的分子量(MW)。选择具有不同MW和/或PLA/PGA比例的PLGA聚合物的能力使得能够“调节”活性物质从本发明的组合物释放的释放曲线。此外，使用具有更高含量的PGA的PLGA也可以有助于提高玻璃化转变温度(tg)，这可以使本发明的组合物的制备更适合于喷雾干燥方法[38]；尽管如下所述，包含冷冻保护剂能够使用具有较少量PGA的PLGA聚合物(例如PLGA 75:25和PLGA 85:15)。

最优选地，本发明组合物的聚合物纳米颗粒包括具有30-60kDa MW的PLGA 50:50聚合物。

所述聚合物纳米颗粒的平均直径优选为2-500nm，更优选为5-200nm，最优选为约150nm。

本发明的组合物包括脂滴，优选中链甘油三酯(MCT)的液滴，尽管长链甘油三酯(LCT)的液滴也是合适的。本领域技术人员将理解，MCT包含6-12碳脂肪酸甘油酯。MCT合适的实施例包括己酸(C6：0)、辛酸(C8：0)、癸酸(C10：0)和月桂酸(C12：0)及它们的混合物。具体的合适的实施例是812(Cremer GmbH&Co，辛辛那提，OH，美利坚合众国)，其由辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯的混合物组成。合适的LCT包括大豆油和红花油。脂滴可以任选地包括标准乳化剂，优选阴离子表面活性剂，例如卵磷脂和脱氧胆酸钠。阴离子表面活性剂将负电荷引入到液滴中。

纳米颗粒稳定剂可以选自本领域技术人员熟知的任何一种，包括十二烷基硫酸钠(SDS)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂(F-68；Sigma-AldrichCo.LLC，St Louis，MO，美利坚合众国)，F-127表面活性剂(Sigma-AldrichCo.LLC)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(80；Sigma-Aldrich Co.LLC)和维生素E TPGS(d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐；Antares Health Products Inc.，Batavia，IL，美利坚合众国)。但是，优选的稳定剂包括聚乙烯醇(PVA)和双十二烷基二甲基溴化铵(DMAB)。所述稳定剂优选存在于合成聚合物纳米颗粒期间，在这种情况下，稳定剂可以赋予纳米颗粒表面上的电荷。例如，在合成PLGA纳米颗粒期间存在的PVA产生负电荷，而在合成PLGA纳米颗粒期间存在的DMAB产生覆盖纳米颗粒的正电荷。当用于具有带负电荷的脂滴(例如卵磷脂稳定的脂滴)的组合物中时，将引起这种带正电荷的PLGA纳米颗粒静电覆盖脂滴表面，从而增加干燥组合物中多孔微粒的三维结构的稳定性。

可选地，冷冻保护剂可以选自本领域技术人员熟知的任何一种。但是，优选的冷冻保护剂包括甘露醇、麦芽糖糊精、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖醇。

本发明的组合物可以包括：0.01-20wt％的活性物质(优选1-5wt％)、10-60wt％的聚合物纳米颗粒(优选25-50wt％)、5-50wt％的脂滴(优选25-50wt％)、1-40wt％的纳米颗粒稳定剂(优选10-25wt％)和0-17.5wt％的冷冻保护剂(优选0-10wt％)；其中所述wt％的量是基于组合物的总重量。

当使用乳化剂稳定脂滴时，乳化剂可以以基于组合物总重量0.01wt％至2.5wt％的量存在。

虽然活性物质可以以0.01wt％至20wt％的量存在于组合物中，但是本领域技术人员将会理解，实际存在的量可以根据例如组合物的特定组分、特定活性物质的溶解度(其通常可以通过乳化剂的存在而增加)和所需活性物质的释放方式而显著变化。

随着聚合物纳米颗粒数量的增加，通过脂肪酶脂解的脂滴降解速率将会降低。

本发明的组合物可以通过例如喷雾干燥、冷冻干燥和流化床方法来制备。

优选地，本发明的组合物通过包括喷雾干燥水包油(o/w)乳液的方法制备，该水包油(o/w)乳液包括脂质乳液液滴和在水相中的聚合物纳米颗粒。水相中的聚合物纳米颗粒对脂滴具有稳定作用。喷雾干燥优选在低于生物相容性聚合物的tg温度下进行(例如，对于PLGA而言小于60℃)。在大于聚合物的tg温度下，聚合物纳米颗粒在喷雾干燥过程中将分解和团聚。其它喷雾干燥参数，例如乳液流量和空气流量，优选设定为提供高水平去除残余水分或最佳去除残余水分的水平(例如乳液流量<1mL/min，例如流量在0.25至0.75mL/min的范围内，空气流量<1m³/min，例如流量在0.25至0.75m³/min的范围内)。使用PLGA纳米颗粒时，乳液流量可优选为约0.5m³/min，空气流量优选为约0.6m³/min。

更优选地，本发明的组合物通过两步法制备：提供包含由在水相中的聚合物纳米颗粒稳定的脂滴的o/w乳液，然后通过喷雾干燥除去水相。所述乳液可以通过均匀化混合物来制备，该混合物在聚合物纳米颗粒的水性分散体中包含脂质。所述活性物质优选存在于混合物中。活性物质可以包括在用于纳米颗粒生产的聚合物制备中(即活性物质由纳米颗粒携带)。

所述乳液可以包括标准乳化剂，优选阴离子表面活性剂比如卵磷脂。所述乳化剂可以以脂滴重量的0.1wt％至5wt％，优选约0.5wt％至2wt％的量存在。存在于乳液中的聚合物纳米颗粒的量相对于脂质乳液液滴的重量可高达80wt％。乳液可以任选地包含冷冻保护剂(例如甘露醇)。相对于聚合物纳米颗粒的重量，冷冻保护剂可以以约1wt％至35wt％，优选10wt％至20wt％的量存在。

所述组合物的单个微粒的平均直径通常为1-20μm，优选2-10μm，最优选<5μm(例如为1-4μm或2.5-3.5μm)。这种尺寸的微粒适用于各种用途。就治疗用途而言，这种尺寸的微粒特别适用于肺部给药。也就是说，研究已经表明，即使当受试者经历气流阻塞(例如与轻度至中度哮喘相关)时，微粒<5μm，特别是2.5-3.5μm在肺中具有最好的穿透和保留水平[40]。相比之下，>5μm的微粒具有“粘在喉咙后部”的倾向，或者换句话说，口咽，而亚微米颗粒(即颗粒<1μm)不容易保留在肺中(即它们在呼气时排走)。

本发明的组合物可以配制成例如用于治疗和/或预防各种疾病或病症(例如人或兽医治疗)的药物。所述药物适用于例如口服给药，递送至粘膜(例如鼻腔和/或肺部给药)或皮下给药。对于口服给药，所述药物可以是任何合适的口服剂型形式，包括片剂、囊片、胶囊、液体乳剂和悬浮剂和酏剂。对于鼻腔和/或肺部递送，所述药物可以以干粉形式用干粉吸入器装置提供(例如本领域技术人员熟知的装置，其通常通过引导湍流空气通过松散的粉末产生药物气溶胶)。对于皮下给药，所述组合物可以配制成适合于通过例如手术植入体内的固体药物。或者，所述组合物配制成可以皮下注射到受试者中的贮库形成组合物(depot-forming composition)。这种固体和贮库形成可植入药物特别适合于长期要求(例如需要活性物质持续释放时)。

在第二方面，本发明提供了向受试者施用活性物质的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用根据第一方面的组合物。

所述组合物可以配制成用于口服、鼻腔、肺部、肌肉内或皮下给药到受试者的药物。

一般而言，受试者将会是人类，通常是成年人。但是，本发明也可以适用于非人类受试者，例如家畜(例如牛、羊和马)、外来动物(例如老虎、狮子、大象等)和伴侣动物(例如狗和猫)。

在第三方面，本发明提供了制备根据第一方面的组合物的方法，其中所述方法包括喷雾干燥水包油(o/w)乳液，该水包油(o/w)乳液包括脂滴和在水相中的聚合物纳米颗粒。

水相中的聚合物纳米颗粒对脂滴具有稳定作用。

在第三方面的方法的实施方案中，所述方法包括提供o/w乳液，该o/w乳液包括脂滴和在水相中的聚合物纳米颗粒，然后通过喷雾干燥除去水相。

再次，水相中的聚合物纳米颗粒对脂滴具有稳定作用。

喷雾干燥优选在低于生物相容性聚合物的tg温度下进行(例如，对于PLGA小于60℃)。

所述乳液可以通过均匀化混合物来制备，该混合物在聚合物纳米颗粒的水性分散体中包含脂质。所述活性物质优选存在于混合物中。活性物质可以包括在用于纳米颗粒生产的聚合物制备中(即活性物质由纳米颗粒携带)。所述乳液可以形成于水包油(o/w)乳液，该水包油(o/w)乳液包括1-70％(w/w)的水包脂质，优选1-25％(w/w)，更优选5-20％(w/w)，最优选约10％(w/w)的水包脂质。所述o/w乳液可以包括适量的标准乳化剂，优选阴离子表面活性剂比如卵磷脂，比如0.1wt％至5wt％(相对于脂质的量)，或更优选约0.5wt％-2wt％。存在于乳液中的聚合物纳米颗粒的量相对于脂滴的重量可高达80wt％。乳液可以任选地包含冷冻保护剂(例如甘露醇)。相对于聚合物纳米颗粒的重量，冷冻保护剂可以以约1wt％至35wt％，优选10wt％至20wt％的量存在。

在另一方面，本发明提供了用于制备根据第一方面的组合物的含水制剂，其中所述制剂包括：(i)活性物质，(ii)聚合物纳米颗粒，(iii)脂质，(iv)纳米颗粒稳定剂，和任选的(v)冷冻保护剂。

这样的含水制剂可以提供为例如试剂盒的组分，其中所述试剂盒还可以包括说明书，该说明书用于喷雾干燥制剂以制备根据第一方面的组合物。为了准备喷雾干燥，可以将含水制剂混合(优选均匀化)以形成由聚合物纳米颗粒稳定的脂滴的乳液。

在另一方面，本发明提供包括三维多孔微粒的喷雾干燥的组合物，其中所述微粒包括：(i)活性物质，(ii)聚合物纳米颗粒，(iii)脂滴，(iv)纳米颗粒稳定剂，和可选的(v)冷冻保护剂；其中所述活性物质由所述纳米颗粒和/或脂滴携带。

下面参考以下非限制性实施例和附图描述本发明。

实施例

实施例1来自PLGA纳米颗粒稳定的脂滴的生物活性混杂颗粒

材料和方法

材料

聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA；50:50，MW＝30000-60000Da)，双十二烷基二甲基溴化铵(DMAB)和聚乙烯醇(PVA；MW＝30000-70000Da)购自Sigma-Aldrich Pty Ltd(Castle Hill，新南威尔士，澳大利亚)。从Hamilton实验室(阿德莱德，SA，澳大利亚)获得中链甘油三酯(MCT；812)，和从BDH Merck(悉尼，新南威尔士，澳大利亚)获得大豆卵磷脂(含有＞94％的磷脂酰胆碱和＜2％甘油三酯)。乙酸乙酯(AR等级)获得自SigmaAldrich(澳大利亚)。用于脂解研究的材料，包含牛磺脱氧胆酸钠(NaTDC)99％、三羟甲基氨基甲烷马来酸盐(trizma maleate)、X-E型L-α-卵磷脂(大约60％纯磷脂酰胆碱，来自干蛋黄)、猪胰酶提取物(活性相当于8×USP规格)、氯化钙脱水剂和氢氧化钠颗粒均购自Sigma-Aldrich(澳大利亚)。

PLGA纳米颗粒的制备

纳米颗粒由Hariharan等人开发的改进乳液-扩散-蒸发法[27]制备。纳米颗粒的平均直径约为180nm。将500mg PLGA(50:50)在室温下溶于25mL乙酸乙酯中2小时。然后将有机相加入到50mL含有DMAB(PLGA-1纳米颗粒)或PVA(PLGA-2纳米颗粒)作为稳定剂(50mL中250mg，0.5％，w/v)的水相中。将所得初始乳液在1000rpm下搅拌3小时，然后使用高压匀浆器(EmulsiFlex-C5匀浆器)以15000rpm均匀化5分钟。将水恒定搅拌加入到该纳米乳液中以促进扩散，最后蒸发乙酸乙酯，导致纳米颗粒的纳米沉淀(nanoprecipitation)。

PLGA-脂质混杂微胶囊的制备

使用Tan等人[19]开发的两步法(即均匀化，然后喷雾干燥PLGA纳米颗粒稳定的乳液)制备了PLH微粒，如图1所示。通过将0.6％(w/w)卵磷脂溶解在10％(w/w)油(812)中制备初始o/w乳液，并加入Milli-Q水作为连续相。将PLGA纳米颗粒分散在Milli-Q水中，其含有80％(相对于油含量的重量)的纳米颗粒。在均匀化之前(EmulsiFlex-C5匀浆器；Avestin Inc.，渥太华，ON，加拿大)，在1000巴的压力下将粗乳液在加入PLGA纳米颗粒后翻滚(tumble)12小时，进行5次循环。然后将PLGA纳米颗粒稳定的乳液喷雾干燥(Mini Spray Dryer B-290；Labortechnik AG，Flawil，瑞士)以在表1中给出的条件下形成PLH微粒。

表1

喷雾干燥条件
		乳液流量	0.5mL/min
空气流量	0.6m3/min
		入口温度	60℃
出口温度	35℃
		吸气器设置	10

制备PLCH微粒

以与上述PLH微粒相似的方式制备PLCH微粒，尽管在这种情况下，将含有20％(相对于PLGA纳米颗粒的重量)甘露醇的甘露醇分散体加入到PLGA纳米颗粒分散体中。然后在均匀化之前将该混合物加入到乳液中，并按照上述方法喷雾干燥。

PLGA-脂质混杂微粒的物理化学特性

扫描电子显微镜(SEM)-通过高分辨率分析扫描电子显微镜SEM(Quanta 450；FEI，Hills boro，OR，美利坚合众国)检查PLH微胶囊的粒度和表面形态。将每个样品安装在双面胶带上，并在成像之前用铂层溅射涂覆。

脂质装载量-通过热重分析(TGA)测定PLH微胶囊的脂质装载量。在氮气吹扫下，以10℃/min的扫描速率从20-550℃加热颗粒；该脂质在500℃完全分解。在微胶囊内脂质的装载量可以通过在该温度范围内的重量损失减去对应于水分(water moisture)的重量损失来确定。

分散性研究-基于使用Malvern Mastersizer的激光衍射(DLS)和使用MalvernZetasizer Nano的动态光散射(Malvern Instruments Inc.，莫尔文，英国)的一段时间内的液滴尺寸的变化来分别评估PLH的重构性质。按照Jang等人的方法[28]将每种组合物(5mg/ml粉末)再分散在脂质消化介质中。

体外脂解研究

脂质消化介质的制备-脂质消化介质根据调整自Sek等人所述的方法[29]制备。按照以下顺序制备空腹状态的混合胶束(即磷脂/胆汁盐(1.25mM PC/5mM NaTDC))：将蛋卵磷脂溶于氯仿(4mL)中，然后真空蒸发氯仿(Rotavapor RE，Labortechnik，瑞士)以在50mL圆底烧瓶的底部周围形成卵磷脂薄膜；加入NaTDC和消化缓冲液[50mM三羟甲基氨基甲烷马来酸盐(pH 7.5)、150mM NaCl和5mM CaCl₂.2H₂O]，将混合物搅拌～12小时以产生透明(浅黄色)胶束溶液。每天制备新鲜的胰酶提取物(含有胰脂肪酶、辅脂酶(colipase)和其它非特异性脂肪分解酶如磷脂酶A2)，通过在5mL消化缓冲液中搅拌1g猪胰酶粉末15分钟，然后离心(约5000rpm，4℃)20分钟来制备。收集上清液相并储存在冰上直到使用。

脂质消化动力学研究-根据Sek等人所述的脂解方案[29]，使用pH-stat滴定单元(TIM854滴定管理器，辐射计，哥本哈根，丹麦)监测脂质消化的进程180分钟。简言之，通过在具有恒温器(37℃)的玻璃反应容器中持续搅拌10分钟，将已知量的样品组合物(相当于约200mg脂质)分散在18mL缓冲胶束溶液中。用0.1M NaOH或HCl将消化介质的pH重新调节至7.50±0.01。通过向消化介质中加入2mL胰酶提取物(含有约2000TBU的胰脂肪酶活性)引发脂解。在整个实验中，通过自动滴定管用NaOH立即滴定反应容器中产生的游离脂肪酸(FFA)，以维持消化介质中的pH值恒定在7.50±0.01的预设值。根据既定的实验方案[29]，将0.6M NaOH的溶液用于长链脂质。

结果与讨论

从PLGA纳米颗粒稳定的脂滴形成混杂颗粒

通过两步制造方法制备由PLGA纳米颗粒和MCT液滴组成的纳米复合微粒，通过该方法，将含有阴离子表面活性剂卵磷脂的油相用正或负电荷的PLGA纳米颗粒的水性分散体均匀化。然后将所得的纳米颗粒稳定的乳液喷雾干燥以形成尺寸为1-5μm的干燥PLGA脂质混杂(PLH)微粒，其具有由前体乳液的界面结构控制的三维微结构。

为了研究乳液稳定性对干燥颗粒纳米结构的影响，在纳米颗粒合成期间，使用DMAB或PVA作为稳定剂来改变PLGA纳米颗粒的电荷。DMAB产生具有高阳离子电荷的纳米颗粒，而PVA由于颗粒表面上聚(乳酸)基团的水解而产生具有阴离子电荷的纳米颗粒[30]。卵磷脂将负电荷引入到乳液液滴上，导致带相反电荷的PLGA-1纳米颗粒静电覆盖脂滴界面。相比之下，带负电荷的PLGA-2纳米颗粒需要高的纳米颗粒浓度来显示由于两个界面之间的静电排斥相互作用而产生的液滴纳米颗粒吸附。由于PLGA纳米颗粒的高浓度(相对于油浓度为80wt％)，经稳定的乳液和干PLH微粒的zeta电位取决于纳米颗粒的电荷。数据的外推得出PLH-1微粒的等电点在pH 9和10之间，PLH-2微粒的等电点在pH 3和4之间(图2)。

喷雾干燥的PLGA纳米颗粒稳定的乳液由于单个微粒的聚集而形成凝聚的和粘性的固体材料。相对于脂质，这独立于在80wt％PLGA下的纳米颗粒电荷，因为PLGA-1和PLGA-2纳米颗粒两者均显示出这一点。因此，假设这不是由于乳液稳定性，而是由喷雾干燥的高温和剪切力引起单个PLGA纳米颗粒之间的凝聚。与通常用于喷雾干燥的其它坚固材料不同，PLGA具有低的玻璃化转变温度，这在该过程中引起了维持PLGA纳米颗粒完整性的困难。碳水化合物比如甘露醇作为填充剂，并且在喷雾干燥期间保护PLGA纳米颗粒免受剪切力和高温的影响[31,32]。结果，在制备方法期间施用甘露醇以研究碳水化合物冷冻保护剂对除水步骤中纳米颗粒完整性和微粒聚集的影响。PLGA脂质-甘露醇混杂微粒(表2)指定为PLMH-1和PLMH-2的zeta电位和粒度增加；对于PLMH-1微粒产生的pKa在10和11之间，对于PLMH-2微粒产生的pKa在6和7之间。当喷雾干燥甘露醇的水溶液时，带正电荷和带负电荷的纳米颗粒稳定的乳液均形成自由流动的粉末。

表2

^a报道的zeta电位在pH 7.0-7.5的范围内。

SEM和CLSM图像清楚地表明，对于尺寸范围为20-100μm的PLH微粒形成的多孔聚集体，由2-5.5μm尺寸范围内的单个微粒组成(图3)。单个PLH和PLCH微粒之间的形态和颗粒聚集的差异归因于在除水过程中加入甘露醇。检查PLH微粒的SEM图像证实了光滑的球形形态，在颗粒表面上不存在单个PLGA纳米颗粒，表明在喷雾干燥期间没有保持纳米颗粒的完整性。相比之下，包含甘露醇似乎增加了PLGA纳米颗粒在喷雾干燥过程中从连续相到液滴界面的自组装能力，同时保持了单个纳米颗粒的完整性并形成三维多孔结构，从而将脂滴封装在PLGA基质内。这在图4中进一步突出，由此通过随着时间分别将PLMH-1微粒和PLMH-2微粒的粒度从5.63±1.2μm降低至1.76±0.3μm和从5.15±1.0μm降低至0.98±0.2μm，证明PLCH微粒重构成PLGA纳米颗粒和脂滴的非均相分散体。对于PLH微粒观察到最小的粒度变化(PLH-1微粒和PLH-2微粒分别为4.85±0.9μm至4.55±0.75μm、4.23±0.7μm至2.75±0.51μm)，证实由于除水过程的高温和剪切力，PLGA纳米颗粒被破坏，导致纳米颗粒变形成微囊状结构，由此将脂质包封在固体PLGA外壳内(图1)。

发现阳离子PLGA纳米颗粒由于强烈的静电吸引而对带负电荷的脂滴产生较高水平的稳定性，增加了干燥组合物中PLH微粒三维结构的稳定性。因此，PLMH-1和PLMH-2重构的差异可归因于PLGA纳米颗粒和乳液液滴之间的静电相互作用的差异。PLH-2和PLMH-2分别比PLH-1和PLMH-1具有更大的颗粒再分布速率和程度，最有可能是由于PLGA-2纳米颗粒和脂滴之间的静电排斥。还假设阳离子微粒之间的絮凝比阴离子微粒更大，这是由于带正电荷的微粒与带负电荷的微粒界面的小片之间的相互作用。这种絮凝进一步降低了PLH-1微粒对初始纳米颗粒和脂滴的再分散。

体外脂质消化研究

PLGA纳米颗粒对脂滴消化的影响-通过在稳定的乳液体系中评估胰脂肪酶作用来检查PLGA纳米颗粒对脂质消化的影响。特别地，将不同浓度的PLGA-1和PLGA-2纳米颗粒加入到由卵磷脂稳定的亚微米MCT乳液中，以研究其对脂质消化率的稳定作用(图5)。发现与PLGA-2纳米颗粒相比，使用PLGA-1纳米颗粒稳定的乳液液滴时，脂肪分解的初始速率显著降低。这与阳离子纳米颗粒(pH 7.5)稳定和与阴离子乳液液滴(pH 7.5)凝聚(由于两界面之间的静电吸引)的能力增强相吻合。图5A插图证实了这点，由于纳米颗粒和液滴之间的异质凝聚，PLGA-1稳定的乳液的平均粒度在60分钟内增加了6倍，从0.5±0.2μm增加到2.9±0.6μm，导致乳液液滴的物理屏蔽和降低的脂肪酶吸附到脂质界面的能力。但是，PLGA-2纳米颗粒在中性pH下带有小的负电荷，因此，纳米颗粒和乳液液滴之间的静电排斥相互作用被认为在密切接近时产生能量势垒，通过疏水相互作用限制了可以弱吸附到液滴(droplet)界面的纳米颗粒的数量，导致比带正电荷的PLGA纳米颗粒更少的颗粒聚集(在60分钟内0.4μm至1.82μm；图5B插图)。对于PLGA-2纳米颗粒稳定的乳液，观察到与常规亚微米乳液相似的初始消化速率，这是由于纳米颗粒对脂质的物理屏蔽减少，从而允许酶接近脂质界面。但是，随着对PLGA-1和PLGA-2纳米颗粒的脂质消化的进行，乳液液滴的尺寸减小，增加了PLGA纳米颗粒的屏蔽作用并限制了脂肪酶接近油-水界面，导致在60分钟内脂肪分解的程度减少[22]。在这两种情况下，随着纳米颗粒的浓度从10wt％增加到50wt％，由于物理屏蔽和空间位阻的增加，消化的速率和程度降低。但是，由于纳米颗粒电荷的差异，PLGA-1纳米颗粒中脂肪酶的抑制程度明显高于PLGA-2纳米颗粒。因此，10wt％和50wt％PLGA-1稳定的乳液脂解的总体程度分别为64.0±3.6％和55.8±2.9％，而10wt％和50wt％PLGA-2稳定的乳液脂解的总体程度分别为78.9±5.6％和66.9±5.1％。

喷雾干燥混杂微粒的消化动力学-图6描述了与用卵磷脂稳定的亚微米MCT乳液相比，四种开发的干的混杂微粒(即PLH-1、PLH-2、PLMH-1和PLMH-2微粒)的脂质水解的百分比作为时间的函数。在模拟的空腹肠道条件下，在约60％消化的快速抑制之前，亚微米乳液的脂质消化以快速的初始速率发生，这是由于在消化的早期阶段脂质底物较大地暴露于脂肪酶。相比之下，由于PLGA对酶吸附的空间位阻，所有四种混杂微粒以较慢的初始速率发生脂解，但是总体消化程度大于亚微米乳液(PLMH-1和PLMH-2微粒为100％而亚微米乳液为94.5±3.3％)。亚微米乳液和干燥微粒内的乳液液滴都用卵磷脂稳定。相对于脂质浓度，在低至中等浓度的卵磷脂时，卵磷脂似乎通过从乳化界面除去表面活性消化产物来增强脂肪酶作用。但是，在高浓度下，或者随着乳液液滴尺寸的减小，卵磷脂似乎通过与酶在油-水界面上竞争位点来干扰脂肪酶吸附[33]。除此之外，在胆汁盐浓度不足时，消化产物(即游离脂肪酸和单甘油酯)由于其两亲结构而吸附到油-水界面，这进一步限制了脂肪酶吸附并抑制脂解。由于油-水界面的饱和，乳液液滴尺寸快速降低以及从亚微米乳液中快速释放消化产物，导致酶降解的抑制。相比之下，PLH和PLCH微粒肯定存在一机制，由此将卵磷脂和释放的消化产物从孔中除去，为脂肪酶吸附留下裸露的脂质界面，从而促进完全消化。假设PLGA纳米颗粒与带负电荷的消化产物之间的静电相互作用减少了吸附到油-水界面的两亲组分的数量，并增加了囊泡和胶束结构形成的水平[25]。

与PLGA纳米颗粒稳定的乳液相比，所有干混杂微粒的脂质水解证实了持续消化，表明与湿相相比，在干相中PLGA对脂肪酶的物理屏蔽程度更高。在60分钟消化期间，PLH-1微粒的总体脂解程度为61.8±3.7％，这与10wt％PLGA-1稳定的乳液的脂质的酶降解一致。因此，PLH微粒的脂质水解速率明显较慢，但消化的总体程度与PLGA稳定的乳液相等。缓慢的初始消化动力学表明在界面处变成催化活性之前，酶从水性连续相中缓慢吸附[22]，但是，相当程度的消化表明微结构促进持续消化，以及消化产物和PLGA纳米颗粒对脂肪酶吸附的干扰作用降低。

封装在PLH和PLCH微粒内的脂质的水解显示伪一级动力学(图6插图)。具体地，通过将曲线拟合到ln(Hmax-H％)对时间(图6插图)，确定了每个脂质体系的一级速率常数k，以及消化3小时后的水解程度H_max，并且在表3中给出。

表3

由于两亲化合物在抑制脂肪酶吸附中的作用，乳液液滴尺寸减小，先前的动力学分析表明由于消化5分钟后反应速率急剧下降，不能将一级动力学拟合到亚微米乳液的消化[25]。因此，0.305min^-1的一级速率常数明显大于混杂微粒的一级速率常数，但仅描述初始消化动力学。与此同时，根据Tan等人[22]通过喷雾干燥二氧化硅纳米颗粒稳定的乳液液滴制备的二氧化硅-脂质混杂(SLH)微粒的脂质消化，证明了三相伪一级动力学，因此需要三个一级速率常数来精确描述数据。由于脂质增加的表面积和促进脂肪酶的界面活化的亲水性二氧化硅基质，SLH微粒中的消化动力学与亚微米乳液的相比增强。二氧化硅和PLGA的混杂系统之间的消化动力学的差异表明，与二氧化硅相比，PLGA纳米颗粒的表面化学变化和较大的粒径改变了脂肪酶和脂质界面之间的相互作用。虽然不受理论束缚，但是认为脂肪酶以其非活性“闭盖(closed-lid)”方向吸附到主要是疏水性的PLGA表面，减少了可用于催化的酶分子的数量，从而降低了脂质消化速率。此外，构成固体基质而增加的粒径增加了酶分子对脂质界面的空间位阻。

与带正电荷的PLGA-1纳米颗粒相比，当带负电荷的PLGA-2纳米颗粒用于制备混杂微粒时，在存在和不存在甘露醇的情况下，消化动力学都得到了增强。伪一级速率常数分别从带正电荷的PLH-1和PLMH-1微粒的0.017min^-1和0.037min^-1分别增加到带负电荷PLH-2和PLMH-2微粒的0.024min^-1和0.049min^-1(表3)。这与以前的研究一致，以前的研究证明了表面电荷对常规乳液液滴消化的影响；由此，带正电荷的脂滴由于带正电荷的液滴界面和吸附到界面的带负电荷的消化产物之间的静电相互作用而凝结，减少了脂肪酶吸附的可及表面积[33,34]。此外，当在所述组合物中使用甘露醇时，脂解的速率和程度增加。

表面电荷和甘露醇对配制的混杂微粒中脂质消化率的影响归因于每种组分对颗粒再分散性的影响。因此，当用阴离子稳定剂制备PLGA纳米颗粒并且甘露醇作为冷冻保护剂施用时，微粒再分散性增强(图4)。带正电荷的PLGA纳米颗粒和带负电荷的脂滴之间的静电吸引相互作用似乎增加了微粒结构的稳定性，导致再分散性能的降低。发现甘露醇通过维持PLGA纳米颗粒的完整性在喷雾干燥过程中作为冷冻保护剂，从而增加微粒对PLGA纳米颗粒和脂滴的非均相凝结的再分散。脂质消化的速率常数和程度线性依赖于微粒再分散/分解(图7)，这与以前的发现一致，其中发现当吸附在多孔二氧化硅内时，速率和程度线性依赖于脂质的表面积[25]。也就是说，脂质消化是通过脂肪酶接近脂质界面的能力来控制的[35,36]，因此，颗粒分解的增加会增加脂质的可及表面积，这反过来增加了脂肪酶吸附(图8)。对于PLCH微粒，PLGA纳米颗粒和乳液液滴的非均相分散体的形成增加了脂质的界面表面积，而PLH微粒由于微胶囊样结构(即其中微粒由包裹在纳米颗粒的固体外壳中的脂滴组成)而不能再分散，这限制了可以结合脂质界面的脂肪酶分子的数量，产生类似于粗乳液的消化动力学。

虽然以前制备的脂质壳-聚合物核结构的PLGA-脂质混杂微粒已经证明了有前景的药物递送应用，但是在该实施例中合成的微粒的新型三维多孔结构解决了混杂微粒的脂质组分的稳定性问题。也就是说，通过表面电荷和冷冻保护剂浓度来控制脂肪酶作用，与脂质壳-聚合物核微粒的常见突释机理相比，认为这种新型结构可以促进受控的药物释放和脂质组分的吸附。提出根据本发明的微粒将作为具有广泛应用的新型药物载体，例如组合治疗、口服递送水溶性差的药物和靶向递送。

实施例2用于桂利嗪的聚合物-脂质混杂(PLH)和聚合物-脂质-冷冻保护剂混杂(PLCH)微粒基组合物

材料和方法

将水溶性差的、抗呕吐药物桂利嗪(CIN)(Sigma-Aldrich Co.LLC，St Louis，MO，美利坚合众国)加载到根据实施例1描述的方法制备的PLH和PLCH微粒的脂滴和聚合物纳米颗粒中，但是其中桂利嗪以5％浓度溶解在脂质制剂(即812或长链甘油三酯(LCT)、大豆油的制备物)中，和以5％浓度溶解在PLGA/乙酸乙酯溶液(用PVA或DMAB)中。在这些实验中使用的PLGA是低分子量(即MW＝7000-17000Da)或高分子量(即MW＝30000-60000)。当包含冷冻保护剂时，所用的冷冻保护剂是甘露醇。根据标准方案进行各种溶出研究以评估从PLH和PLCH微粒组合物中释放出的桂利嗪。使用由卵磷脂稳定的液滴尺寸约为180nm的亚微米MCT乳液、PLGA纳米颗粒制剂和纯CIN进行比较。

结果与讨论

在120分钟的时间内，CIN释放(即溶解)至0.1％十二烷基硫酸钠(SLS)溶液中。显而易见的是，与单独的乳液、PLGA-1纳米颗粒和纯CIN相比，从PLCH微粒组合物(包括高分子量PLGA)释放的CIN增强(参见图9A)。当在两步溶解(即模拟胃液条件下为0-60分钟，模拟肠道条件下为60-120分钟)过程中，在模拟胃液条件和模拟肠道条件下评估PLCH微粒组成时，观察到CIN释放的类似增强(参见图9B)。

在释放到0.1％SLS的进一步研究中，发现与带正电荷的微粒组合物(包含高分子量PLGA-2纳米颗粒)相比，带负电荷的微粒组合物(即包含高分子量PLGA-1纳米颗粒)的CIN溶出速率和程度更大(参见图10)，这是由于与阳离子微粒相比阴离子微粒的再分散增加。此外，发现由于增加的微粒再分散性，PLCH微粒中甘露醇的存在促进了更快的释放动力学(参见图10)。

此外，与高分子量PLGA(图11)相比，使用低分子量(MW＝7000-17000)PLGA来配制PLCH微粒时，观察到CIN的释放动力学增强，表明药物释放的容易性可以在PLH/PLCH微粒中进行控制。用长链甘油三酯(LCT)代替MCT脂质，CIN释放动力学也受到很大的影响(参见图12)。在这种情况下，LCT引起PLCH微粒组合物的CIN释放降低。

实施例3用于桂利嗪的聚合物-脂质混杂(PLH)微粒基组合物

相对于对比性的含有二氧化硅的组合物研究了用于桂利嗪(CIN)的PLH微粒基组合物的药代动力学行为。

材料和方法

组合物制备

根据先前描述的方法[18-20]制备包含CIN的二氧化硅-脂质混杂(SLH)组合物。预先称取160mg干燥的组合物到10mL离心管中，然后用2mL盐水通过剧烈涡旋混合物而分散。对于300g大鼠，通过口服管饲(gavage)将1.5ml该混合物以10mg/kg的剂量给予大鼠。CZ含量估计约为1.5wt％。

根据实施例1中描述的方法制备包含CIN的聚合物-脂质混杂(PLH)微粒组合物，但是其中将桂利嗪溶解在脂质制剂(即812)中。PLGA具有低分子量(MW＝7000-17000)。以与SLH组合物相似的方式将PLH组合物给药于大鼠，为获得相同的CZ含量，称取370mg干燥的组合物。用2mL盐水水合形成乳状溶液。

根据Bhatt等人[44]制备了包括CIN的二氧化硅稳定的立方体(中性)组合物。将该组合物在不进一步制备的情况下以较低的CZ含量(约0.5wt％)给药到大鼠中。但是，所有的PK浓度都是在液相色谱质谱(LCMS)分析后进行剂量标准化的。

外科手术

在本研究中使用250-300g雄性Sprague Dawley大鼠。所有制剂一式四份(n＝4)进行。外科手术按照Nguyen等人[42]的描述进行。简言之，通过吸入异氟烷(5％v/v用于诱导，2.5％v/v用于维持)麻醉大鼠并称重。剃光胸骨和颈背上方的切口部位，并皮下注射镇痛药(0.1mL布比卡因0.5％)。分离右颈动脉并用0.96mm×0.54mm聚乙烯管插管，插管用2IU肝素/盐水溶液冲洗。然后将大鼠连接到线束/旋转系统并置于单独的代谢笼中。也将大鼠禁食并以与Nguyen等人[42]所述相同的方式喂养。为了准确确定给药量，在给药到大鼠前后称重注射器和管饲器。在0h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h和24h进行大鼠血液取样。每次抽取200μL的体积，然后立即分配到预先填充有10IU肝素的1.5mL离心管中。为了插管通畅，每次取血样后，用2IU的肝素盐水溶液冲洗插管。然后血样以7378×g离心5分钟。以2×等分试样收集血浆50μL，并在-20℃冷冻直到分析。

血浆提取用于CIN含量

根据Sahbaz等人[43]描述的方法进行CIN血浆提取。但是，简言之，50μL空白血浆掺有桂利嗪和卤泛群(halofantrine)(内标)，CIN标准浓度为5、10、25、50、100和250ng/mL。使用饱和硫酸铵来沉淀血浆蛋白，然后加入乙腈。从上清液中收集25μL的等分试样，然后将其转移到小瓶中进行LCMS分析。

CIN的LCMS分析

使用Sahbaz等人[43]描述的方法和设置，在单四极杆LCMS(Model 2010；岛津公司，京都，日本)上进行处理过的血浆的分析。

结果与讨论

该研究的结果在表4和图13中提供。结果表明，与其它两种混杂微粒体系相比，当包封在PLH微粒中时，CIN的口服生物利用度得到提高，AUC值和C_max值较大。PLH的生物利用度为SLH组合物的约2.5倍，是二氧化硅稳定的立方体组合物的约5倍。因此，结果突出了PLH/PLCH微粒有前景的释放特性和增溶能力，由此可以用它们来增加水溶性差的药物的吸收。虽然不希望受到理论的约束，但这可以通过多种递送机制来实现；即混合胶束中的脂质消化和增加的药物溶解，药物从PLGA纳米颗粒缓慢释放到GIT中，以及直接吸收含药物的PLGA纳米颗粒的潜力(即微囊分解后特别适合于向肺部施用活性物质)。由于释放行为和药物递送机制，PLH/PLCH制剂也可预期延长活性物质的吸收半衰期。

表4口服施用掺入到PLH、SLH和中性二氧化硅稳定的立方体组合物中的CIN后的药代动力学参数。将剂量标准化至10mg/kg CIN施用于大鼠。每个数据表示为平均值±SEM，n＝4。

在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，单词“包括(comprise)”和“包含(include)”以及诸如“包括(comprising)”和“包含(including)”之类的变体将被理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。

在本说明书中对任何现有技术的引用不是也不应被视为承认任何形式的暗示，即不是也不应被视为承认这些现有技术形成公知常识的一部分。

本领域技术人员将理解，本发明在其用途中不限于所描述的具体应用。关于本文描述或描绘的特定元件和/或特征，本发明在其优选实施方案中也不受限制。应当理解，本发明不限于所公开的实施方案或实施例，而是能够进行许多重新排列、修改和替换，而不脱离由所附权利要求书所阐述和限定的本发明的范围。

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Claims (22)

1.包含三维多孔微粒的干燥组合物，其中所述微粒包括：(i)活性物质，(ii)聚合物纳米颗粒，(iii)脂滴，(iv)纳米颗粒稳定剂，和可选的(v)冷冻保护剂；其中所述活性物质由所述纳米颗粒和/或脂滴携带。

2.根据权利要求1所述的组合物，其包括0.01wt％至20wt％的所述活性物质、10wt％至60wt％的所述聚合物纳米颗粒、5wt％至50wt％的脂滴、1wt％至40wt％的所述纳米颗粒稳定剂和0至17.5wt％的所述冷冻保护剂；其中所述wt％的量是基于所述组合物的总重量。

3.根据权利要求1所述的组合物，其包括1wt％至5wt％的所述活性物质、25wt％至50wt％的所述聚合物纳米颗粒、25wt％至50wt％的脂滴、10wt％至25wt％的所述纳米颗粒稳定剂和0至10wt％的所述冷冻保护剂；其中所述wt％的量是基于所述组合物的总重量。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述活性物质为药剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述药剂是水溶性差的药物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述聚合物纳米颗粒包括生物相容的和/或可生物降解的聚合物。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合物纳米颗粒包括PLGA聚合物。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述脂滴包括中链甘油三酯(MCT)。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒稳定剂选自聚乙烯醇(PVA)和双十二烷基二甲基溴化铵(DMAB)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括冷冻保护剂，该冷冻保护剂选自甘露醇、麦芽糖糊精、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖醇。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述微粒不由脂质壳-聚合物纳米颗粒核结构构成。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其通过包括喷雾干燥水包油(o/w)乳液的方法制备，该水包油(o/w)乳液包括脂滴和在水相中的聚合物纳米颗粒。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述微粒的平均直径<5μm。

14.用于向受试者施用活性物质的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-13中任一项的组合物。

15.制备根据权利要求1-13中任一项的组合物的方法，其中所述方法包括喷雾干燥水包油(o/w)乳液，该水包油(o/w)乳液包括通过水相中的聚合物纳米颗粒稳定的脂滴。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括提供乳液，该乳液包括由水相中的所述聚合物纳米颗粒稳定的脂滴，然后通过喷雾干燥除去水相。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述喷雾干燥在小于所述聚合物的玻璃化转变温度(tg)的温度下进行。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述乳液通过将包括脂质的混合物在聚合物纳米颗粒的水性分散体中均匀化而制备。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述乳液由包括1-25％(w/w)的水包脂质的水包油(o/w)乳液形成。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述o/w乳液包括0.1wt％至5wt％(相对于所述脂质的量)的阴离子表面活性剂。

21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述乳液中存在的聚合物纳米颗粒的量相对于脂质乳液液滴的重量高达80wt％。

22.根据权利要求15-21中任一项所述的方法，其中所述乳液包括5wt％至35wt％(相对于所述聚合物纳米颗粒的重量)的冷冻保护剂。