CN107677834A

CN107677834A - TAFIa含量的检测方法、用于检测TAFIa含量的试剂盒及二者的应用

Info

Publication number: CN107677834A
Application number: CN201710872073.3A
Authority: CN
Inventors: 李文欣; 苏春阳; 刘峰
Original assignee: Liaoning Maidi Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Liaoning Maidi Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2037-09-25
Also published as: CN107677834B

Abstract

本发明提供了一种TAFIa含量的检测方法、用于检测TAFIa含量的试剂盒及二者的应用，涉及生物化学检测技术领域，本发明提供的TAFIa含量的检测方法，通过测量TAFIa酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量，具有灵敏度高、反应速度快、条件温和、无毒无害、成本低廉等优点。本发明提供的用于检测TAFIa含量的试剂盒，包括TAFIa标准品、底物、氨基酸氧化酶及(a)过氧化物酶、香草酸和4‑氨基安替比林或(b)化学发光剂。利用该试剂盒检测TAFIa的含量，具有灵敏度高、特异性强、反应速度快的优点，并且操作方法简单，不需要复杂的专业技术。

Description

TAFIa含量的检测方法、用于检测TAFIa含量的试剂盒及二者的应用

技术领域

本发明涉及生物化学检测技术领域，尤其是涉及一种TAFIa含量的检测方法、用于检测TAFIa含量的试剂盒及二者的应用。

背景技术

凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)又称为羧肽酶原U(procarboxylpeptidase U)，是由肝脏合成的一种糖蛋白。TAFI以酶原的形式存在于血浆中，可被凝血酶、纤溶酶、凝血酶-血栓调节蛋白复合物等激活，将TAFI切割为两部分：含92个氨基酸的TAFI激活肽(TAFI activation peptide)和393个氨基酸的TAFIa，这一过程称为TAFI的激活。TAFIa具有生理活性，可以水解纤维蛋白C末端的赖氨酸，使纤溶酶原不能被激活，从而发挥了纤溶抑制的作用。

TAFI在纤溶过程中发挥了重要的调控作用，因此TAFI浓度与某些心脑血管疾病有相关性。如冠状动脉疾病、静脉血栓、心绞痛、局部缺血性中风等均和TAFI水平呈正相关。由于TAFI被激活为TAFIa之后才发挥其纤溶调控作用，检测血液中的TAFIa含量可以直观地反映纤溶过程。

TAFIa的检测有诸多难点：(1)TAFIa会由于蛋白构象的改变而转变为无活性的TAFIai，这一过程使得TAFIa在37℃下的半衰期只有8-15分钟；(2)TAFIa占TAFI的比例只有约0.01％，含量低；(3)血液中的羧肽酶N(CPN)和TAFIa具有类似的催化活性。因此体外检测TAFIa的方法必须要保证待测物的活性，而且要有较高的灵敏度和特异性。虽然可以用ELISA等免疫学方法检测TAFI的含量，但这种方法不能区分有活性的TAFIa和无活性的TAFIai。

因此，开发一种能够有效区分有活性的TAFIa和无活性的TAFIai而进行检测的，灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低廉的TAFIa含量的检测方法尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种TAFIa含量的检测方法，本发明的第二个目的在于提供一种用于检测TAFIa含量的试剂盒，本发明的第三个目的在于提供上述种TAFIa含量的检测方法或用于检测TAFIa含量的试剂盒在TAFIa含量的体外检测中的应用，以缓解现有技术中存在的对TAFIa含量检测灵敏度低、反应速度慢、操作复杂、成本高昂的技术问题。

本发明提供了一种TAFIa含量的检测方法，所述检测方法包括：

通过测量TAFIa酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量；

所述酶促反应的产物为过氧化氢。

进一步地，所述检测方法还包括：

将含有TAFIa的样本与底物混合进行反应，生成游离的氨基酸，将所述游离的氨基酸进行氧化处理，得到所述酶促反应的产物，通过检测所述酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量。

进一步地，所述底物为苯甲酰苯丙氨酰精氨酸、苯甲酰酪氨酰精氨酸、苯甲酰色氨酰精氨酸、苯甲酰苯丙氨酰赖氨酸、苯甲酰酪氨酰赖氨酸或苯甲酰色氨酰精氨酸中的一种。

进一步地，所述游离的氨基酸为游离的精氨酸或赖氨酸。

进一步地，所述氧化处理为加入精氨酸氧化酶或赖氨酸氧化酶。

进一步地，所述测量TAFIa酶促反应的产物的含量为利用化学反应产生的颜色变化或发光强度进行测定。

进一步地，所述检测方法还包括：

利用TAFIa标准品建立标准曲线。

本发明还提供了一种用于检测TAFIa含量的试剂盒，所述试剂盒包括：

TAFIa标准品、底物、氨基酸氧化酶及如下(a)或(b)：

(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；

(b)化学发光剂。

进一步地，所述试剂盒包括：

TAFIa标准品、苯甲酰苯丙氨酰精氨酸、精氨酸氧化酶及如下(a)或(b)：

(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；

(b)鲁米诺、氯化钴或HRP。

另外，本发明还提供了上述的检测方法或上述的试剂盒在TAFIa含量的体外检测中的应用。

本发明提供的TAFIa含量的检测方法，通过测量TAFIa酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量。该方法具有灵敏度高、反应速度快、条件温和、无毒无害等优点，同时，应用本发明提供的TAFIa含量的检测方法进行TAFIa含量的检测，所需仪器是常见的分光光度计、酶标仪、生化分析仪或化学发光仪，无需其他特殊设备，成本低廉。本发明提供的用于检测TAFIa含量的试剂盒，包括TAFIa标准品、底物、氨基酸氧化酶及(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林或(b)化学发光剂。利用该试剂盒检测TAFIa的含量，具有灵敏度高、特异性强、反应速度快的优点，并且操作方法简单，不需要复杂的专业技术。

附图说明

图1为本发明提供的应用比色法和化学发光法检测TAFIa含量的反应原理示意图；

图2为本发明实施例4提供的比色法建立标准曲线的结果图；

图3为本发明实施例6提供的化学发光法建立标准曲线的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种TAFIa含量的检测方法，包括：

通过测量TAFIa酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量；

其中，酶促反应的产物为过氧化氢。

本发明提供的TAFIa含量的检测方法，具有灵敏度高(最低检测限10pmol/L)、反应速度快(约15min)、条件温和(37℃)、无毒无害等优点，同时，应用本发明提供的TAFIa含量的检测方法进行TAFIa含量的检测，所需仪器是常见的分光光度计、酶标仪、生化分析仪或化学发光仪，无需其他特殊设备，成本低廉。

在一个优选的实施方式中，检测方法还包括：

将含有TAFIa的样本与底物混合进行反应，生成游离的氨基酸，将该游离的氨基酸进行氧化处理，得到酶促反应的产物，通过检测酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量。

其中，酶促反应的产物为过氧化氢。

在一个优选的实施方式中，在低温条件下收集含有TAFIa的样本，同时添加凝血酶抑制物、羧肽酶抑制物，保证离体的TAFI不被继续激活，已经激活的TAFIa不再失活，同时抑制羧肽酶N的活性。从而达到使待测样本中TAFIa含量在体内与体外保持一致的目的。

在一个优选的实施方式中，底物为苯甲酰苯丙氨酰精氨酸、苯甲酰酪氨酰精氨酸、苯甲酰色氨酰精氨酸、苯甲酰苯丙氨酰赖氨酸、苯甲酰酪氨酰赖氨酸或苯甲酰色氨酰精氨酸中的一种。

在一个更优选的实施方式中，底物为苯甲酰苯丙氨酰精氨酸，其结构式如式(Ⅰ)所示，其中X₁可以是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)或色氨酸(Trp)；X₂可以是精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)：

在一个优选的实施方式中，游离的氨基酸为游离的精氨酸或赖氨酸。

其中，将含有TAFIa的样本与底物进行反应，将X₂位置的氨基酸残基水解并释放到反应体系中。TAFIa对该底物具有特异性，排除了羧肽酶N的干扰。并且，反应体系中的精氨酸氧化酶(或赖氨酸氧化酶)能够将游离的精氨酸(或赖氨酸)氧化，生成过氧化氢。精氨酸氧化酶(或赖氨酸氧化酶)能够氧化氨基酸的α-氨基，因此只和游离的氨基酸反应而不与底物反应。从而达到灵敏度高、特异性强的目的。

在一个优选的实施方式中，氧化处理为加入精氨酸氧化酶或赖氨酸氧化酶。

在一个优选的实施方式中，测量TAFIa酶促反应的产物的含量为利用化学反应产生的颜色变化或发光强度进行测定。

在一个更优选的实施方式中，测量TAFIa酶促反应的产物的含量为利用比色法或化学发光法。

其中，比色法：过氧化氢可以被过氧化物酶催化，使得反应体系中的显色剂(香草酸、4-氨基安替比林)发生反应，生成有颜色的醌亚胺。用分光光度计等测定498nm波长吸光度的变化。化学发光法：过氧化氢可以和化学发光剂(鲁米诺、氯化钴、HRP)发生反应并发光，用化学发光仪检测发光强度。

在一个优选的实施方式中，检测方法还包括：

利用TAFIa标准品建立标准曲线。

检测体系中过氧化氢的浓度，即可通过标准曲线计算出TAFIa的含量，即通过对照样本测精氨酸本底浓度。

其中，TAFIa标准品为以不同浓度或活力单位的TAFIa为组成成分。

本发明利用TAFIa的天然催化活性，能够将合成底物的精氨酸残基切除，随后检测游离的精氨酸含量，从而可以对TAFIa进行定量检测。实验所需的主要仪器比较常见，用分光光度计、酶标仪、生化分析仪或化学发光仪即可测定，不需要HPLC等大型设备，具有灵敏度高、操作简单、反应速度快等优点。

本发明还提供了一种用于检测TAFIa含量的试剂盒，包括：

TAFIa标准品、底物、氨基酸氧化酶及如下(a)或(b)：

(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；

(b)化学发光剂。

在一个优选的实施方式中，用于检测TAFIa含量的试剂盒包括：

(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；

(b)鲁米诺、氯化钴或HRP。

当选择用比色法检测测量TAFIa酶促反应的产物的含量时，用于检测TAFIa含量的试剂盒包括：TAFIa标准品、苯甲酰苯丙氨酰精氨酸、精氨酸氧化酶及过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；当选择用化学发光法检测测量TAFIa酶促反应的产物的含量时，用于检测TAFIa含量的试剂盒包括：TAFIa标准品、苯甲酰苯丙氨酰精氨酸、精氨酸氧化酶及鲁米诺、氯化钴或HRP。上述两种检测方法的反应原理示意图如图1所示。

利用本发明提供的试剂盒检测TAFIa的含量，具有灵敏度高、特异性强、反应速度快的优点，并且操作方法简单，不需要复杂的专业技术。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。

实施例1样本采集和预处理方法

(1)采用枸橼酸钠作为抗凝剂，采集全血样本。样本采集后立即在冰上冷却。

(2)向其中添加终浓度为5μM的D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-精氨酰氯甲基酮(PPACK)和100μg/mL的抑肽酶。

(3)4℃，3000×g离心15min。

(4)收集上清血浆，在冰上保持低温。如需要长期保存，在-80℃冰箱中冷冻。

(5)待检测的血浆需要预处理：向血浆样本中添加终浓度为150μM的2-胍基乙基巯基琥珀酸(GEMSA)，反应的缓冲体系为20mmol/L Hepes(pH 7.4)，冰上孵育15min。预处理结束后的血浆作为待测样本，用比色法或化学发光法进行检测。

实施例2TAFIa标准品的制备

(1)配制Hepes缓冲液：20mM Hepes，150mM NaCl，1mg/mL BSA，0.01％Tween-80。

(2)将1μM TAFI重组蛋白、20nM凝血酶、5nM血栓调节蛋白、5nM CaCl₂，在Hepes缓冲液中混合，22℃孵育10min。

(3)孵育结束后加入100nM的PPACK终止反应，立即在冰上冷却。

(4)将上述激活的TAFIa加入TAFI灭活血浆中，-80℃冷冻保存。

实施例3比色法所用试剂的配制

试剂中的各个成分均以终浓度表示。

第一试剂的具体成分：50mmol/L Hepes缓冲液(pH 8.0)；400μM TAFIa底物(Bz-Phe-Arg)、30U/mL精氨酸氧化酶、2mmol/L香草酸。

第二试剂的具体成分：50mmol/L Hepes缓冲液(pH 8.0)、1mmol/L 4-氨基安替比林；2U/mL过氧化物酶。

实施例4比色法检测TAFIa含量

应用实施例3提供的的试剂测定实施例1提供的处理过的样本。

(1)所使用的生化分析仪型号为贝克曼库尔特AU480。

(2)生化仪参数的设置。第一试剂/第二试剂/样本的体积分别为150μL/150μL/15μL；检测波长为498nm；测光点为10、27；检测方法为终点法；定标方式为两点定标。

(3)用上述第一试剂、第二试剂试剂和标准品，建立标准曲线。结果如下表1和图2所示。

表1TAFIa标准曲线(比色法)

TAFIa浓度(pmol/L)	反应度
		0	0.0003
200	0.1876

(4)按照本发明实施例1提供的方法，收集并处理不同的血浆样本。将处理过的样本放入生化仪，仪器进行自动检测，并通过上述标准曲线得到所测样本的TAFIa浓度，结果如下表2所示。

表2不同样本TAFIa浓度测定(比色法)

样本编号	测量值(pmol/L)
		1	20.86
2	15.91
		3	37.15
4	30.6
		5	28.45
6	36.47
		7	14.05
8	28.46
		9	16.47
10	29.47

实施例5化学发光法所用试剂的配制

试剂中的各个成分均以终浓度表示。

试剂1的具体成分：50mmol/L Hepes缓冲液(pH 8.0)；400μM TAFIa底物(Bz-Phe-Arg)；30U/mL精氨酸氧化酶。

试剂2的具体成分：100mM Na₂CO₃缓冲液(用盐酸调至pH 10.2)、650μM鲁米诺、60μMCoCl₂。

实施例6化学发光法检测TAFIa含量

应用实施例5提供的的试剂测定实施例1提供的处理过的样本。

(1)所使用的化学发光仪型号为BPCL微弱发光测量仪。

(2)150μL试剂2预先放入化学发光仪检测池中，温度设为37℃。

(3)将150μL试剂1和15μL标准品混合，37孵育5min。

(4)将步骤(3)的混合液注入化学发光仪检测池的试剂2中，开始记录化学发光强度值，测量时间300s。本实验采集的是化学发光动力学曲线的峰面积所对应的光子计数。用几个不同浓度的标准品建立标准曲线。结果如下表3和图3所示。

表3TAFIa标准曲线(化学发光法)

TAFIa浓度(pmol/L)	ΔI_CL×10^-8
		0	0.0033
20	0.6518
		40	1.2751
60	1.8634
		80	2.4862
100	3.1492

(5)按照本发明实施例1提供的方法，收集并处理不同的血浆样本。样本检测方法同上：①先将150μL试剂2预先放入化学发光仪检测池中，温度设为37℃。②将150μL试剂1和15μL待测样本混合，37孵育5min。③将步骤②的混合液注入化学发光仪检测池的试剂2中，开始记录化学发光强度值，测量时间300s。通过测量值在上述标准曲线中计算到所测的TAFIa浓度，结果如下表4所示。

表4不同样本TAFIa浓度测定(化学发光法)

样本编号	测量值(pmol/L)
		1	21.48
2	16.12
		3	36.75
4	32.46
		5	30.38
6	35.17
		7	15.63
8	27.19
		9	16.14
10	30.48

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种TAFIa含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

通过测量TAFIa酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量；

所述酶促反应的产物为过氧化氢。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：

将含有TAFIa的样本与底物混合进行反应，生成游离的氨基酸，将所述游离的氨基酸进行氧化处理，得到所述酶促反应的产物，通过测量所述酶促反应的产物的含量，间接得到TAFIa的含量。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述底物为苯甲酰苯丙氨酰精氨酸、苯甲酰酪氨酰精氨酸、苯甲酰色氨酰精氨酸、苯甲酰苯丙氨酰赖氨酸、苯甲酰酪氨酰赖氨酸或苯甲酰色氨酰精氨酸中的一种。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述游离的氨基酸为游离的精氨酸或赖氨酸。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述氧化处理为加入精氨酸氧化酶或赖氨酸氧化酶。

6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述测量TAFIa酶促反应的产物的含量为利用化学反应产生的颜色变化或发光强度进行测定。

7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：

利用TAFIa标准品建立标准曲线。

8.一种用于检测TAFIa含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

TAFIa标准品、底物、氨基酸氧化酶及如下(a)或(b)：

(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；

(b)化学发光剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)过氧化物酶、香草酸和4-氨基安替比林；

(b)鲁米诺、氯化钴或HRP。

10.如权利要求1-7任一项所述的检测方法或权利要求8或9所述的试剂盒在TAFIa含量的体外检测中的应用。